[教学]硝酸还原酶活性测定

[教学]硝酸还原酶活性测定[教学]硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶活性测定一、原理:硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收 ---和利用氮肥有关。它作用于NO使还原为NO;产生的NO可以从组织322 -内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO的含量的高2 -低，即表明酶活性的大小。NO含量的测定用磺胺(对氨基苯磺酸胺2 sulfanil—amide)比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO。2 二、仪器药品: 721型分光光度计、真空泵(或注射器)、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角烧瓶、...

[教学]硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶活性测定一、原理:硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收 ---和利用氮肥有关。它作用于NO使还原为NO;产生的NO可以从组织322 -内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO的含量的高2 -低，即表明酶活性的大小。NO含量的测定用磺胺(对氨基苯磺酸胺2 sulfanil—amide)比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO。2 二、仪器药品: 721型分光光度计、真空泵(或注射器)、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角烧瓶、移液管、烧杯 0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5 0.2mol/L KNO3:溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。磺胺试剂:1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 α—萘胺试剂:0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。 NaNOMATCH_ word _1713505388534_0溶液:1g NaNO用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，22 再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO 5μg，用时稀释之。 2 三、操作步骤 1、将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2到3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.2—0.3g(或每份取30个圆片)，分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中:(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml;(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气3 后，圆片即沉于溶液中(如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中)。将三角烧瓶置于30?温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，这520nm下进行比色测 -定。通过标准曲线测得NO 的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜2 -重产生的NO μg或μmol表示之。 2 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶 -液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加NO 的2含量。 2、绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液(例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml)1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟(或于一定温度的水俗中保温30分钟)，立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO浓度为横坐标绘制吸光度—浓度曲线。2 NaNO浓度(μg/mL) 5 4 3 2 1 0.5 2 标准母液(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 蒸馏水(mL) 0 0.2 0.4 0.6 .8 1.0 磺胺(mL) 2 2 2 2 2 2 α—萘胺 2 2 2 2 2 2 OD值

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