【doc】 古尼虫草无性型的分子鉴别

【doc】 古尼虫草无性型的分子鉴别 古尼虫草无性型的分子鉴别 菌物24(3):344,348,2005 Mycosystema 古尼虫草无性型的分子鉴别 张泽文傅岚陈作红 (湖南师范大学生命科学学院长沙410081) 摘要:采用PCR技术,以rDNA的ITS区为分子指标,对古尼虫草Cordycepsgunnii的有性 和无性阶段进行比较分析,从分子水平上证明古尼虫草的无性阶段是古尼拟青霉Paecilomyces gunnii. 关键词:古尼拟青霉,rDNAITS区 中图分类号:Q939.5文献标识码:A文章编号:1672—6472(2005)03—0344—0348 古尼虫草Cordycepsgunnii(Berk.)Berk.是一种寄生于蝙蝠蛾幼虫的较大型虫草,它 是一种复合型真菌,具有有性型和无性型两种生活形态,梁宗琦(1983)首次报道为我国 新记录种:梁宗琦(1985)采用多批次组织和孢子分离,以分离物的培养性状和形态特征 为鉴定依据获得了古尼虫草的无性型——古尼拟青霉PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang新种; 刘爱英等(1997)利用子囊孢子微循环产孢再次确认古尼拟青霉为古尼虫草无性型. 随着分子生物学的飞速发展,DNA序列测定已被应用到虫草无性型的鉴定上,为无性 型的鉴定提供了准确的依据.为了证明古尼虫草无性型的准确性,本文以rDNA18S和25S 之间的转录间隔区(ITS区)为分子指标,通过对古尼虫草子实体和分离纯化的古尼虫草 无性型一古尼拟青霉两种材料的ITS区序列进行比较分析,从分子水平对古尼虫草的无性 阶段进行分子鉴定. 1材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1材料 古尼虫草Cordycepsgunnii(Berk.)Berk.采自湖南浏阳;古尼拟青霉Paecilomycesgunnii z.Q.Liang从古尼虫草子座中分离纯化得到,并从形态上按梁宗琦(1985)报道的方法得 以确认. 1.2试剂 1.2.1DNA提取试剂:SDS,氯仿苯酚.异戊醇,无水乙醇,超纯 水,Lysbuffer裂解液(灭 菌后配 制):s—HCI(pH7.6)1mol/L5%;NaCI5mol/L2%;EDTA(pH8.0)0.5mol/L 20%】,蛋白酶K20g/L,10%SDS(十二烷基硫酸钠)10% 1.2.2琼脂糖凝胶电泳试剂:琼脂糖,1×TAE缓冲液(pH7.6,2.5mLTris.HCI加5mLEDTA 调pH定容至250mL),EB(溴化乙锭0.5mg/L),溴酚蓝(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶 液) 基金项目:湖南省教育厅青年基金资助项目(01B010) 通讯作者E—Mail:chenzuohong@263.net 收原稿日期:2005—02—28,收修改稿日期:2005—05.10 3期张泽文等:古尼虫草无性型的分子鉴别345 1.2.3PCR扩增试剂:PCR试剂盒(购自上海生工)(10~buffer,dNTP,MgC12,Taq酶), 超纯水,DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 1.3古尼虫草子座及菌丝DNA的SDS法提取与检测 采用SDS法提取总DNA(Sambrook&Russell,2001),得到古尼虫草子座和菌丝体的 DNA溶液,4?保存备用. 取10laL提取的DNA溶液与2.0L溴酚蓝混匀点入琼脂糖凝胶,用 1×TAE缓冲液 在3V/cm下电泳,约45min后在紫外分析仪上检测条带. 1.4ITS区片段的扩增 ITS序列采用双引物ITS4+ITS5扩增,此为真菌常用的引物.ITS4为26SrRNA基 因5,端下游3l一50个碱基处,取其互补序列为5”-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3,,ITS 5序列为5”-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG一3,,引物交由上海捷倍思公司合成. 1.4.1扩增的反应体系(251aL):超纯水15.751aLl,10×Buffer2.5laL,2mmol/LdNTP2.5laL, 25mmol/LMgC121.5laL,10plaL/IaL.ITS4llaL,10plaL/laLITS5llaL,Taq 酶0.251aL,模板 0.5laL. 1.4.2扩增程序:95?5min,暂停加入Taq酶;95~C1rnin,56?30s,72”C50s,重复 1次;95?30s,56?30S,72?50s,循环37次;72?10min,20?保温. 1.4.3电泳检测:同上. 1.4.4测序:扩增产物的纯化与测序均由上海博亚生物技术有限公司在DNA自动测序仪上 进行测序. 2结果与分析 2.1DNA纯度的检测 如图1示,从古尼虫草子座与菌丝体中提取的DNA溶液,经琼脂糖凝胶电泳检测,从 电泳图谱可看到,其基因组DNA大小一致,约21000bp,且为一条明显亮带,证明其纯 度较高,可进一步进行PCR扩增. 2.2PCR扩增产物的电泳检测 运用PCR技术从古尼虫草子座与古尼拟青霉的DNA中特异扩增了rDNA的ITS序列, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后(如图2)大约在700bp处可以看到清晰的条带.该产 物交由上海博亚生物公司纯化并直接在自动测序仪上进行测序. 2.3ITS序列的分析 根据博亚公司的测序结果,得到古尼虫草子座(CG)和古尼拟青霉(PG)全部ITS 区(ITSI+5.8S区+ITS2)的序列(表1),两者的序列完全一致,整个ITS区共计585bp, 其中ITS1为212bp,5.8S为156bp,ITS2为222bp,显然是属于同一生物种的不同生长 阶段,前者为其有性型,后者则为其无性型.从而从分子水平上证明分离得到的菌丝体确 为古尼虫草的无性型,即古尼拟青霉. 与冬虫夏草Cordycepssinensis的ITS区(ITSl+5.8S区+ITS2)相比(表1),古尼虫 草5.8SrDNA的长度与冬虫夏草的完全一样,均为156bp,其中变异碱基位点仅有4个, 整个性状位点的2.5%,表明核糖体基因高度保守;两者的ITS1(表1中第1-212个碱基) 和ITS2(表1中第369,590个碱基)的长度变化较大,变异位点较多,ITS1区共212bp, 变异碱基有98bp,占整个性状位点的46.2%;而ITS2区共222bp,变异碱基有79bp,占 凿物24卷 整个性状伉点的356%整个ITAA* A**AA~:CAA* TTGGTTCTGG 【AACGCAGCGMATGcGATAAGTA TGA 240 ?%?皤???{皇?皤 3期 续表I 张泽文等:古尼虫草无性型的分子鉴别347 木木木木术木木木木木木木木T事木木木木木木木木木木木木木木木木爿c木木T术木木木木 木木木木术木木木木木木木木T事木木木木木木木木木木木木木木木木爿c木木T木木木木木 320 360 !?!!!AACCCTCGAGCCCCCCGCCTCGCGGC一一400 木木木木木木A木木木 木木木料木A爿c料 590 一 :表缺失数据;+:表相同碱基位点:下划线为5.8S区 一 :Gapsrequiredforalignmem::Thesamebasesite;Underlineale5.8Sregion CS:冬虫夏草子座(StromsofC.sinensis):CG:古尼虫草子座(Stromsofcgunnii):PG:古尼拟青霉gunnii) 3讨论 关于虫草无性型的分离与确证,在形态特征方面,梁宗琦等做了大量工作,并取得了 可喜成绩(梁宗琦,2001),方法有三:1,多途径多批次分离确定;2,虫草子囊孢子微循 环产孢直接确证;3,在特定人工培养基上诱发虫草有性子实体的确 定.近年来随着分子生 物学的发展,利用分子生物学手段在确定冬虫夏草,蛹虫草,Cbrittlebankisoides,Csobolifera 等多个种类的无性型也取得了很好的进展.李增智等(2000)从青海的冬虫夏草子实体上 分离出中国被毛孢,并利用RAPD—PCR技术获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组 DNA指纹图谱,两者相似率高达96%,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢;赵锦 等(1999)以rDNA18S和25S之间的ITS区为分子指标,通过对冬虫夏草及相关种类有 性和无性阶段材料的ITS序列分析进行比较分析,从基因水平证明冬虫夏草的无性型为中 国被毛孢:Liueta1.(2001.2002)应用ITS序列分析的方法,研究表明冬虫夏草标本与相应 ?{3?{3???{3??{3? 348菌物24卷 的无性型分离物中国被毛孢之间的ITS序列完全一致,蛹虫草和其无性型分离物蛹虫拟青 霉ITS序列差别很小.利用分子生物学手段是从遗传物质上探讨虫草无性型与有性型的关 系且不受其生活史不同阶段的影响,因此已成为确定虫草无性型重 要方法. 本文对古尼虫草的菌种进行了分离,培养纯化后制片镜检,可从形态 学上确认是古尼 虫草的无性型即古尼拟青霉.赵锦等(1999)曾对古尼拟青霉的rDNA 进行了序列测定, 但仅只测出ITS1区和5.8S的部分序列.本文利用分子生物学手段, 对古尼虫草的子座和 分离培养的古尼拟青霉菌种的rDNA的完整ITS区进行序列测定, 并进行比较,结果证明 分离到的菌种确为古尼虫草的无性型即古尼拟青霉. 【REFERENCES] LiangZQ,1983.AdescriptionofCordycepsgunniiinChina.ActaMycologicaSinica,2(4):258-259 LiangZQ,1985.Isolationandidentificationoftheconidialstageofcordycepsgunnii.ActaMycologicaSinica,4(3):162-166 LiuALiangZQ,LiuZ1997.DeterminationoftwospeciesofCordycepsbyascosporalmicrocyclecondiation.Mycosystema, l6(4):297-299 SambrookJ,RussellDW’2001.MolecularCloning:ALaboratoryManual(3ed.).ColdspringHarborLaboratoryPress. LiangZQ,2001.CurrentsituationandponderationofCordycepsFr.researcha ndexploitationinClfma.ActaEdulisFungi,8(2):53—62 LiZZ,HuangB,LiCR,FanMZ,2000.MolecularevidencefortheasexualstageofCordycepssinensis(Berk.)Sate.Mycosystema, 19(1):60—64 ZhaoJ,WangN,ChenYQ,LiTH,QuLH,1999.MolecularidentificationfortheasexualstageofCordycepssinensis.Acta ScientiarumNaturaliumUniversitatisSunyatseni,38(1):121-123 LiuZLiangZQ,LiuAYaoYJ,KevinDH,YuZN,2002.Molecularevidenceforteleomorph—anamorphconnectiomin CordycepsbasedonITS一 5.8SrDNAsequences.MycologicalResearch,106:1100-1108 LiuZYaoYJ,LiangZQ,LiuADavMNMarkWC,2001.Molecularevidencefortheanamorph—teleomorphconnectionsin Cordycepssinensis.MycologicalResearch,105:827-832 [附中文参考文献] 粱宗琦,1983.一种国内未见报道的虫草菌—占尼虫草.真 菌,2(4):258—259 粱宗琦,1985.古尼虫草分生孢子阶段的分离和鉴定.真 菌,4(3):162—166 刘爱英,粱宗琦,刘作易,1997.两种虫草无性型的微循环产孢确证.菌 物系统,16f4):297—299 J.萨姆布鲁克,D.w拉塞尔着,黄培觉等译,2002.分子克隆实验指南(第 三版).北京,科学出版社,461—516 粱宗琦,2001.我国虫草属真菌研究开发的现状及思考.食用 菌,8(2):53,62 李增智,黄勃,李春如,2000.确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据,I. 中国被毛孢与冬虫夏草的关系.菌物系统,19(1):60--64 赵锦,王宁,陈月琴,李泰辉,屈良鹄,1999.冬虫夏草无性型的分子鉴别 中山大学(自然科学版),38(1):121—123 MoLECULARIDENTIFICATIoNoFTHEANAMoRPHSTAGEoF CoRDYCEPsGUNNII ZHANGZe—WenFULanCHENZuo—Hong (CollegeofLlyeScience,HunanNormalUniversity,Hunar~Changsha410081) ABSTRACT:1]herDNAITS(internaltranscribedsparce)fromthetele0m0T1)hstageandtheanamorphstageof CordycepsgunniiwereamplifiedwithPCRw,chnology.thenthePCRproductsweresequencedand comp~edTheresultsindicatedthattheITSsequencesofthemwereconcordantcompletely,whichsuggested thattheanamo~hstageofCgunniishouldbePaecilomycesgunnii. KEYWORDS:,Paecilomycesgunnii,rDNAITS