小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应与膜功能的影响
小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应
与膜功能的影响
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l714?2005年6月29日第85卷第24期NailMedJChina.June29,2005,Vol85,No.24
小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体
反应与膜功能的影响
熊锦文熊承良田永红李双徐惠敏胡廉丁晓芳
【摘要1目的探讨小鼠睾丸巨细胞病毒(MCMV)感染对附睾尾部精子顶体反应与膜功能的
影响.
方法
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随机选择无MCMV感染史的BALB/c雄性小鼠48只作为实验组,睾丸直接接种
MCMV,分别于感染后第1…246,9,14天处死小鼠,用地高辛标记的MCMVM83mRNA寡核苷酸探
针对睾丸组织进行原位杂交,检测睾丸MCMV感染情况,同时取附睾尾部成熟精子进行精子顶体反
应与精子膜低渗肿胀功能检测.另设平行对照组雄性小鼠30只(同法随机选择),睾丸接种不含
MCMV的细胞培养液,其他处理方法同实验组.结果实验组48只雄性小鼠睾丸组织间质及(或)
生精细胞中均出现原位杂交阳性信号.实验组精子顶体反应与膜功能在接种病毒后的第2天,第4
天,精子顶体反应率(58%4-9%,56%4-9%)低于平行对照组(71%?6%,70%4-7%)(P均<
0.05),精子膜尾部低渗肿胀率(48%4-9%,38%4-8%)低于平行对照组(60%4-7%,50%4-4%)(P
均<0.05).结论小鼠睾丸MCMV感染模型成功建立.小鼠睾丸MCMV急性感染可导致精子顶体
反应与膜功能的显着下降.
【关键词】鼠巨细胞病毒属;睾丸;精子
Effectsoftestisroutinecytomegalovirusinfectiononspermacrosomereactionandspermaticfunction
ofmembraneinmiceXIONGJin-wen,XIONGCheng—liang,TIANy0一,LIShuang,
xUHui—
min.HUl&m.DlNGXiao-fang.CenterofReproductiveofMedicine.ResearchInstituteofFamily
Planning,To,~giiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China
Correspondingauthor:XIONGCheng—liang,Email:clxiong@mails.tjmu.edu.en
【Abstract】
ObjectiveToexploretheeffectsoftestismurlnecytomegalovirus(MCMV)infectionon maturespermacrosomereactionandspermaticfunctionofmembraneinmice.MethodsBALB/cmice
withoutMCMVinfectionwererandomlydevidedintotwogroups:anexperimentalgroup(48mice)anda
controlgroup(30mice).rI1lemiceinthecontrolgroupweretreatedbyinoculationDMEMwithoutMCMV
intotestis,whilethoseintheexperimentalonewereelirecflyinoculatedwithMCMVintotestis.Miceintwo
groupsweresacrificedseparatelyat1,2,4,6,9,14dpostinoculation(D1,2,4,6,9,14PI),andthe
MCMVM83mRNAgenewasdetectedinsidethetestesbyinsituhybridization(ISH)withoneepisode
MCMVlate—
mRNAprobelabeledwitlldigoxin.meanwhileacrosomereactionandthefunctionofmembrane
ofmaturespermsintheepididymistailswasmeasured.ResultsThepositivesignalofISHofMCMVwas
mainlyfoundedinthetwokindsoftesticularceUs(spermatogeniccellsandLeydigceUs)intheexperimental
group.Comparedwitllthatofthecontrolgroup.thespermacrosomereactionintheexperimentalgroupwas
decreasedsignificantlybytheratefrom(714-6)%,(704-7)%to(584-9)%,(564-9)%(P<0.05)
separatelyonD2PIandD4PI.Andthespermmembranehypo—
osmoticsweUingwasdecreasedsignificantly
bytheratefrom(604-7)%,(504-4)%to(484-9)%,(384-8)%(P<0.05)separatelyalsoonD2PI
andD4PI.ConclusionThemodelofCMVinfectioninmurinetestiswasestablished.Thespermacrosome
reactionandfunctionofmembraneinmicemightbedescentedsignificantlybyMCMVinfectionintheearly
period,whichshowsthatMCMVinfectionmightinfluentthespermsfunction.
Muromegalovirus;Testis;Spermatozoa 【Keywords】
男性生殖系统微生物感染是影响精子质量的重
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院计划生育研
究所生殖医学中心
通讯作者:熊承良,Email:clxiong@mails.tjmu.edu.cn
.
论着
要原因之一,可直接或间接地导致男性生育障
碍….人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,
HCMV)属于13疱疹病毒亚科,在人群中普遍存在,
临床上常呈潜伏状态,活动感染时可导致全身各大
器官不同程度的各种损害[.为研究巨细胞病毒
2005年6月29日第85卷第24期NatlMedJChina,June29,2005,Vol85一No.24
(CMV)感染对精子质量的影响,便于今后深入探讨 CMV感染机制及其与男性生殖系统疾病的相关性, 本文将小鼠巨细胞病毒(murinecytomegalovirus,
MCMV)直接接种小鼠睾丸,造成小鼠睾丸组织的人 工急性感染,并检测MCMV感染对小鼠精子顶体反 应与膜功能的影响.
材料与方法
一
,材料
1.细胞和病毒:小鼠胚肺成纤维细胞(murine embryolungfibroblast,MEL)NIH/31r3株购自中国 典型培养物保藏中心(Chinacenterfortypeculture
collection,CCTCC).MCMVSmith株购自美国典型 培养物保藏中心(Americantypeculturecollection,
ATCC).细胞与病毒在我所细胞培养室按常规方法 培养传代,病毒滴度为10TCID50/0.1ml. 2.实验动物:清洁级BALB/c雄性小鼠,8—
10周龄,已性成熟,体重20g?4g,购自湖北省武汉 生物制品研究所.
3.主要试剂:MCMV—IgG,IgM抗体酶联免疫吸 附试验(ELISA)试剂盒购自珠海海泰生物制药有限 公司.敏感性加强型原位杂交检测试剂盒
(MK1030),二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购于武 汉博士德生物工程公司.MCMVM83基因(相当于 HCMVpp65基因)mRNA序列为5cGAGAccTccAT GTCCTIEATGC3,由北京奥科生物工程有限公司 合成探针并予5末端标记地高辛.
二,方法
1.小鼠睾丸MCMV感染模型的建立:
(1)动物处理:实验前鼠尾采血0.1ml/只,取 血清进行ELISA检测,操作严格按说明书进行,选 择MCMV—IgM阴性小鼠78只用于实验.随机选择 人选小鼠48只设为实验组,微量进样针穿透白膜, 于两侧睾丸分别接种MCMV悬液20—25l [(3.4—4.25)×10一TCID50];另选平行对照组雄 鼠30只,每侧睾丸直接接种不含MCMV的细胞培 养液20—25J.观察各组小鼠的体重,被毛,精 神,食量等变化,并于接种后的第1,2,4,6,9,14天 分别处死各组小鼠(实验组每次8只,平行对照组 每次5只),无菌采集双侧睾丸组织,快速置4%多 聚甲醛溶液固定6—8h,石蜡包埋,切片. (2)MCMV感染检测:采用单相寡核苷酸探针 mRNA原位杂交方法检测睾丸组织MCMV感染情 况.技术操作严格按说明书进行.其中睾丸组织行 胃蛋白酶消化5min;地高辛标记的寡核苷酸探针浓 度为2g/ml.每次实验均设阴性对照,即对照标 本用不含标记探针的杂交液代替杂交液.光镜下分 析结果,细胞内出现棕黄色颗粒者判断为杂交信号 阳性.小鼠双侧睾丸标本有一侧阳性结果出现即判 定为睾丸MCMV感染阳性.
2.精子顶体反应功能检测:处死小鼠后,取两 侧附睾尾部组织0.02g,置2.0mlCa"浓度为 1.3mmol/LL4的TYH培养液中剪碎,37~C,CO 孵箱温育10min,使精子游离,加TYH液至4.0ml, 调整精子浓度至(3—6)×10个/ml,待检.取处 理过的精液1ml,置37~C,CO孵箱温育5h,使其 获能;1000r/min离心3min,弃上清,沉淀以5%甲 醛溶液固定10rain,混匀,吸取50l精子悬液滴于
载玻片上涂片晾干,用0.22%考马斯亮兰G250染 液浸染至少30min,双蒸水冲洗,晾干,400倍显 微镜下完整视野计数至少200个精子.精子顶体反 应率计算参照文献[7,8].
3.精子膜低渗肿胀实验:取精子浓度为(3—6)× 10/卜/ml的待检精液300l,加入0.5ml低渗肿 胀液…,混匀,37~C,CO孵箱温育30min,滴片,400 倍显微镜下完整视野计数至少200个精子,其中精 子尾部卷曲者(尾部膜肿胀精子)计为阳性结果. 精子尾部膜肿胀率:尾部膜肿胀的精子数/总检测 精子数.
4.数据处理:所获实验数据均用?s表示,两 组平行对照组间均值比较用t检验,采用SPSS13.0 软件包进行处理.
结果
小鼠感染征象:实验组87.5%(42/48)小鼠 1.
于接种病毒后第2天即出现被毛耸立,精神烦燥,嗜 斗等征象,其余12.5%(6/48)小鼠未出现以上征 象;另外,实验组小鼠在接种病毒后2—6d出现了 食量减少,体重下降等状况,随后饮食,体重缓慢恢 复.而平行对照组小鼠均无上述现象出现.两组无 感染致死小鼠.
2.原位杂交结果:实验组睾丸间质细胞和(或) 各级生精细胞胞浆中可见棕黄色颗粒状阳性着色. 组织中血管各层,生精小管管周肌样细胞及睾丸包 膜等均有阳性杂交信号出现,提示MCMV可感染睾 丸组织内各种细胞,主要是睾丸间质细胞.从病毒 感染的第2天起,MCMVM83mRNA阳性表达开始 在睾丸生精细胞中出现,而此期睾丸生精细胞也开
盘堕_轩』_塑盟第:?—Chi
始山现同程度的病理损害;在感染后第4天,第6 天的睾丸组织中MCMVM83mRNA阳件表达信号 逐渐增强.而问期的睾丸组织病变相应加蓖,笙第9 天阳性表达投病变程度达到高峰(图1,6)这提 示.MCMVM83mP~NA在不同的感染时段,不同程 度病理损害的组织中有不同的表达.实验皇I【48M 小鼠双侧睾九取一侧检测均有m性杂交结果, MCMV活动感染率为100%,而对照自i睾丸切片及 原忙杂交阴性对照均无杂交m性信号出现 3小鼠精于顶体反应与膜功能改变:凼实验组 小鼠窜丸均感染MCMV.救所有杯本精于功能检测 结果均刮为统计范围小鼠睾丸在感染MCMV后 第2天第4天时,精子顶体反应率及尾部膜肿胀率 与平行对照组相比.均显着下降,差异具有统计学意 义(在I,2)
表l哺组小鼠睾九MCMV感染后不同时可的 成熟精顶体反应率f%)
组别鼠散1d
丑=验组873?9
照577?4
麒纽较,…2902,P=0014.t=2888.P= 00I5
表2两组小鼠睾丸MCMV感染后不同时间的 成熟精于尾肯I5膜肿胀串(%)
别Id
38?8空验组842?7
:纽较,…2654.P=0022一3149P=n?9
1,鼠睾丸MCMV感染模型的建谨投方法在
f究中的意义:目前探对人类疾病的发病机制及防
冶措施的研究主要建立在整体动物模型的实验基础
;成功的动物模型必须遵守卡爿似,可控经济,易行
等原则,使人类疾病能在动物实验研究中得以良好
的再现由于MCMV与HCMV具有80%的同源
基因结构以及感染普遍,致病低,感染受机体免疫
功能的影响等类似的致病过程,许多学者应用
MCMV感染宾验动物模型研究HCMV感染".因
CMV感染对精子功能影响厦感染与男性生殖疾病
的相关性研究国内外报道较少.意见不一,所
应用动物模型进行此类课题的研究十分必要.本
文选用免疫力较低的雄性BALB/c小鼠,将种属特
异性MCMV直接接种小鼠睾丸,于感染的不同连续
州段榆测其附睾尾部成熟精子顶体反应与膜功能的
-
.o
目lz组睾组织生精胞?庸细胞排.MCMVM83mHAg性表达啄侍杂交x40目2接MCMV后
第1.小嗥闻质细胞生精小世曾月肌样监血管MCMVM83mRNA日l性表原恃杂交~40目3接种McMV第
2,4.小睾丸生精小营基膜坏死.管月肌样细晦性损害生精胞内MCM~M83mJ~NA性表达开始出现庳位杂x100
目4接MCMV第6.小鼠睾丸病理损眚加重.?精胞排列豪乱,问质淋B细胞增?,MCMVM83mRNA性表选范围扩
原f杂xl岫目5接种MCMv9天,小丸生情小骨盐问峨胞中MCMVMg3n~dqA性丧然程度谜高蟑原
位杂交x100砸6接补MCMv第14*,小睾MCMVM83mRNA睾丸组中性表达运新碱位杂×100
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改变.模型的建立将为今后系统研究MCMV感染 对雄性生殖功能的影响及感染机制打下坚实的基 础.另外,因CMV晚期基因转录产物mRNA的出 现是病毒复制完成的标志,为病毒活动性感染的最 可靠指标,所以本研究选用MCMV晚期基因 M83(HCMVUL83homolog)中的一段序列设计了寡 核苷酸探针,采用地高辛标记,针对小鼠睾丸组织, 从病毒基因转录水平进行原位杂交检测,不仅准确, 灵敏地检测出睾丸MCMVM83mRNA的存在,快速 判断出睾丸组织MCMV活动感染率状况,还对病毒 在睾丸组织中的定位及其易感细胞进行了初步探 讨,为雄性生殖器官MCMV感染模型研究提供了新 的实验手段.
2.小鼠睾丸MCMV急性感染对精子功能的影 响:精子在体内只有经过获能,顶体反应,才能穿人 卵细胞与其融合,完成受精;同时,精子膜的功能与 精子获能,顶体反应及精卵融合密切相关.因此,检 测精子的顶体反应功能及精子膜功能的完整性可准 确地反映精子功能,并预测精子的潜在受精能力. 1999年,WHO规定可将精子顶体反应率,精子膜功 能完整性作为评价精子受精功能的重要指标. 本实验在建立小鼠睾丸MCMV感染模型的同时,检 测附睾尾部成熟精子顶体反应率及膜功能的完整性 (精子膜尾部低渗肿胀率),以探讨MCMV急性感染 对精子功能的影响.研究发现,在睾丸MCMV感染 的不同时段,对照组各时期及实验组各时期小鼠精 子的顶体反应率与尾部膜肿胀率的波动范围较大, 并未呈现出一规律曲线,但两组率在平行对照时段
的波动趋势较为一致,因此考虑实验中组间的数据
波动可能是因为不同笼的小鼠存在的一些个体差异
所致.另外,MCMV感染后第2天,第4天时,精子
顶体反应率,精子膜尾部低渗肿胀率均低于平行对
照组,而随着感染时间的延长,精子的顶体反应率及
精子膜尾部低渗肿胀率不受影响.这提示,MCMV
急性感染可能导致精子功能的低下,CMV为引起男
性生育障碍的可能病原微生物之一;至于此后精子
顶体反应,膜功能的恢复及MCMV急性感染导致精
子功能下降的机制研究,有待于进一步深入.此外,
从原位杂交结果分析,MCMVM83mRNA在不同的
感染时段,不同程度病理损害的组织中有不同的表
达,说明MCMVmRNA在感染部位表达水平的高低
与受染细胞病变的程度及精子功能可能具有相关
性;而关于睾丸组织对MCMVmRNA负荷量的多少
与精子功能的相关性研究仍有待今后研究的进一步
深入和完善.
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(收稿日期:2004.11-29)
(本文编辑:吕小东)