【word】 中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究

【word】 中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究 中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研 究 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VO L.21NO.6时珍国医国药2010年第21卷第6期 中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究 王晶,刘春明,白鹤龙,李丽 (长春师范学院,吉林长春130032) 摘要:目的以人参,西洋参,_Y-七中的皂苷类化合物为研究对象研究其抗氧化性能.方法采用Photochemi—lumines— cence(PCL)抗氧化活性体外评价体系为分析平台系统考察皂苷类化合物的抗氧化活性,并利用DPPH法进行对照评价. 结果人参,西洋参和2_-I=95%乙醇提取的皂苷类化合物均具有一定的清除自由基活性,并且随着皂苷含量的增加,其清 除自由基能力增强.结论PCL法成功应用于皂苷类化舍物的清除自由基能力研究. 关键词:人参;西洋参;三七;皂苷类化合物;抗氧化活性 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1008-0805(2010)06—1485-03 TheAntioxidativeActivityEvaluationsoftheSaponinsinTraditionalChines eMedicine WANGJing,LIUChun—ming,BAIHe—long,LILi (ChangchunNormalUniversity,Changchun,Jilin130032,China) Abstract:0bjectiveToexploretheantioxidativeactivityofthesaponinsinPanaxginseng,PanaxquinquefoljusandPanaxnO— toginseng.MethodsPhotochemi—luminescence(PCL)wasappliedtodeter minetheantioxidativeactivityofthesaponinsforthe firsttime,andDPPHmethodwasdevelopedforevaluatingthescavengingactivityoftheextracts.Photochemi—luminescence (PCL)wasappliedtodeterminetheantioxidativeactivityofthesaponinsforthefirsttime,andDPPHmethodwasdevelopedfor evaluatingthescavengingactivityoftheextracts.ResetsThesaponinsof95%ethanolextractsfromPanaxginseng,Panaxquin— quefoljns,Panaxnotoginsenghadobviousanti—radicalcapacity,theefficie ncyincreasedwiththecontentsofmajorsaponinsex— tractedfromplants.ConclusionPCLmethodissuccessfullyappliedtostudythetheantioxidativeactivityofthesaponins. Keywords:Panaxginseng;Panaxquinquefoljus;Panaxnotoginseng;Saponins;Antioxidant 现代研究发现很多疾病的发生与自由基反应有关.活性氧 自由基可直接或间接损伤DNA,导致DNA链断裂和染色体断 裂.因此,研究清除氧自由基的物质是生命科学发展的必然 趋势.传统中药在缓解衰老以及衰老性疾病的防治方面有 着极为丰富的实践经验,我国中草药资源丰富,因此从中草药中 寻找低毒高效的抗氧化剂是一个很好的途径.人参是具有极高 药用价值的传统中药,在中医治疗中常用于大补元气,凋补五脏 及延缓衰老,是一种重要的抗衰老药物,人参以及和它亲缘关系 较近的西洋参,三七的抗氧化作用已经被应用到食品和化妆品等 领域. 人参PanaxginsengC.A.Mey.,西洋参Panaxquinquefoljus L,三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.chen系五加科人参属中重 要的3种植物,是我国名贵中药材.三者主要的有效成分均为皂 苷类化合物,已有的研究表明,人参皂苷具有多种生理活性, 几乎可作用于人体的各个生命系统’.研究发现人参皂苷类 化合物具有清除自由基的作用,但是在自由基清除剂方面人 参皂苷是一种较弱的自由基清除剂,此特性在联合用药中有利于 人参皂苷抗自由基作用的缓慢释放.近年研究中清除自由基的 实验多采用Fenton,Haber—Weiss,DPPH法等紫外分光光度计法 进行分析’”,本研究将光化学发光(PCL—photochemi—lumi— nescence)法应用于皂苷类化合物的清除自由基能力分析. 收稿日期:2009-06—11;修订日期:2009.10—11 基金项目:国家自然科学基金(No.30873364); 吉林省科技厅重点项目(No.20071102): 吉林省人民政府人才开发资助金项目 作者简介:王晶(1984一),女(满族),吉林长春人,现为长春师范学院在 读硕士研究生,学士学位,主要从事天然药物化学研究X-作. 通讯作者简介:刘春明(1964-),女(汉族),吉林通化人,现任长春师范 学院教授,博士学位,主要从事天然药物化学研究工作. 光化学发光(PCL)法是一种测定抗氧化剂和自由基的方法, 其样品制备简单,分析时间短,试剂用量较少,不受温度和pH值 的影响,且由光化学法生成自由基,简单,快捷,可靠;并采用化学 发光法检测自由基,保证了极高的灵敏度.此法已成功测定了维 生素片剂的水溶性抗氧化能力』,此外这种方法在国内的应用 报道还比较少. 采用不同体外抗氧化实验体系测定样品时,由于抗氧化作用 机制不同,有可能产生的结果也不一致,所以一般要求至少采用 两种方法来衡量样品的抗氧化活性.本实验以人参,西洋参, 三七中的皂苷类化合物为研究对象,采用Photochemi—lumines— eence(PCL)抗氧化活性体外评价体系为分析平台,系统考察皂 苷类化合物的抗氧化活性,并利用DPPH法进行对照评价,为应 用一种较新的体外抗氧化活性的方法提供实验数据. 1材料与仪器 实验所用液相试剂均为色谱纯试剂(CaledonLaboratoriesL Ltd公司,加拿大),0.45m滤膜(安捷伦公司,美国),其它试剂 为分析纯(北京化工厂),用于PCL分析的溶剂由AnalytikJena AG公司(德国)提供.二苯基苦基苯肼自由基(1,1一diphenyl 一 2一Picryhydrazyl,DPPH?)购于Sigma公司(美国).人参 切片,西洋参切片,三七根部药材均购于北京同仁堂大药房(长 春分店),人参皂苷Rg,Re,Rb.,Rb2,Rc,Rd和三七皂苷R对 照品购于中国药品生物制品检定所.Agilent一1100高效液相色 谱(安捷伦公司,美国);DU800紫外可见分光光度计(Backman 公司,美国);旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司);S180H超声 清洗器(Elma公司,德国);BS124S电子天平(SartoriusAG,德 国);耶拿Photochem抗氧化剂与自由基分析仪(AnalytikJenaAG 公司,德国). 2方法 2.1样品溶液的制备分别精密称取人参,西洋参,三七药材粉 末(0.15mm粒径)1.0063,1.0047,1.0027g.用3Om1.95% ? 1485? 时珍国医国药2010年第2l卷第6期LISH1ZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VO L.21NO. 6 乙醇浸泡(2h)超声提取30min,提取3次.将乙醇提取液过滤, 减压回收乙醇,浓缩至于,残渣用甲醇溶解过0.45I.zm滤膜,定 容于10ml容量瓶中,制得人参,西洋参和三七样品溶液. 分别精密称取人参,西洋参,三七药材粉末(0.15mm粒径) 1.0056g,1.0048g和1.0069g.用30ml,95%乙醇浸泡(2h) 回流提取2h,提取3次.将乙醇提取液过滤,减压回收乙醇,浓 缩至干,残渣用甲醇溶解过0.45m滤膜,定容于10m1容量瓶 中,制得人参,西洋参和三七样品溶液. 分别精密称取人参,西洋参,三七药材粉末(0.15mm粒径) 1.0078g1.0o63g和1.0060g.用30ml,95%乙醇浸泡(2h) 60?水浴温浸提取2h,提取3次.将乙醇提取液过滤,减压回收 乙醇,浓缩至干,残渣用甲醇溶解过0.45m滤膜,定容于10ml 容量瓶中,制得人参,西洋参和三七样品溶液. 2.2高效液相色谱条件采用美国Agilentl100系统,DAD二极 管阵列检测器.Agilentl100Series自动进样器;Agilent—C18色谱 柱(4.6mmx250mm,5Ixm)(美国安捷伦),柱温35?.采用 二元线性梯度洗脱,流速为0.5ml/rain,流动相组成为乙腈 (A),0.05%的磷酸水溶液(B),样品分析时间为50min,样品进 样量为101,检测波长为203nm.流动相梯度:0—2min,75% 一 75%B;2,50rain,75%,50%B. 2.3抗氧化活性的PCL法分析采用Photochem(Berlin,Ger— many)超快速抗氧化剂和自由基全自动分析仪,测定原理是由光 化学法生成自由基,并利用化学发光法检测自由基.发光氨(Lu— mino1)是一种光致化学发光物质,通过测量反应所生成的光强度 来测量自由基的瞬间含量(光强与自由基含量成正比)14j.在 实验中使用有光化学激发作用的光敏剂(Photosensitizer,发光氨) 激发反应分子,使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快1000 倍的速度发生氧化反应,迅速产生自由基. 采用PCL—ACW—Kit方法测量人参,西洋参和三七提取物 中水溶性成分的抗氧化活性.首先,配置分析混合液为1.0ml 反应缓冲液,包括0.1mol/LSodiumCarbonate(pH10.5)和0.1 mmol/LNa2一EDTA;1.5mlACW—diluent(water);1mmol/LLu— minol(251),作为光敏剂激发反应分子,使其迅速产生自由基, 同时又作为光致化学发光物质.样品和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品均为10l.每个 样品平行测试2次. 2.4抗氧化活性的DPPH法分析二苯基苦基苯肼自由基(DP— PH)是一种性质较为稳定的自由基,其溶液显紫色,在515nm 处有最大吸收,当有自由基清除剂存在时,DPPH?的单电子由于 被配对,其浓度减小而使其颜色变浅,吸光度值变小,这种颜色变 浅的程度与配对电子数成化学计量关系,因此可用比色法进行定 量分析.清除剂直接作用于DPPH?自由基,反应时间短,用分 光光度计即可测定,该方法操作简单,直接,灵敏,快速,因此DP— PH分光测定法在国内外广泛用于清除自由基物质性质的研究. 取0.1ml样品溶液,加入2ml的60p~moL/L的DPPH溶液 混匀,放置30min,以原溶剂调零点,在515nm处测起吸光度为 Ai;同法0.1ml溶剂+2mlDPPH溶液混匀测定吸光度极为Ac; 0.1ml样品溶液+2ml溶剂混匀测定吸光度极为Aj.按下述公 式计算其自由基清除率. ,A:A:, 清除率(%):『1一]X100%.. Ao.. IP(%):[1一(Ai—Ai)/Ac]×100%,其中Aj反应样品自 身对吸光度的贡献;Ai样品对DPPH作用后的吸光度数值;Ac为 DPPH本身在测定波长的吸收. 3结果’ 3.1提取方法的确定人参,西洋参,三七的乙醇超声提取物以 及对照品的液相色谱图示于图1.分别采用3种提取方法提取3 种药材中的皂苷类化合物.结果见图2.对于3种药材,超声提 ? 1486? 取的效果均较好,皂苷类化合物含量较高,且快速,安全,简便,溶 剂消耗少,常温提取其成分又不会被破坏,这一结果与文献所报 道一致. 3.2自由基清除作用的评价研究 3.2.1自由基清除作用的PCL法评价研究通过采用PCL— ACW—Kit方法测定不同物质的量(0,0.5,1,2和3nmo1)的L — ascorbicacid(抗坏血酸)得到标准曲线,即y=44.489X+ 5.3481.R:0.9908.在实验中需要稀释样品溶液,以使滞后时 间距落在标准曲线的线性范围内.Photochem产生标准曲线和 测试样品的抗氧化活性都是自动进行的,样品的抗氧化活性是用 相当于L—ascorbicacid的纳摩尔数来计算.PCL法首次应用于 皂苷类化合物的抗氧化活性研究.实验结果表明,3种中药提取 物清除自由基能力有所差别,其中三七和西洋参提取物清除自由 基能力比人参提取物强(见图3).不同提取方法对于提取物的 清除自由基能力有较大影响,对于三七提取物的清除能力来说, 超声提取法>回流提取法>温浸提取法;西洋参和人参提取物的 清除自由基能力皆是回流提取法大于超声提取法,但是二者的差 异不大,而温浸提取法清除能力最弱.结果见图3. A-0.1mg?ml混合标样色谱图;B-三七超声提取液色谱图; C.西洋参超声提取液色谱图;D一人参超声提取液色谱图(=203lttn) 1.Noto-Rl2.Re+Rgl3.Rf4.Rb15.Rc6.Rb27.Rd 图1对照品和样品高效液相色谱图 图3不同提取物自由基清除能力的PCL评价结果 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010V OL.21NO.6时珍国医国药2010年第21卷第6期 3.2.2自由基清除作用的DPPH法评价研究采用上述的PCL 法评价了3种中药提取物的清除自由基能力,为了参考比较,同 时采用清除DPPH自由基体外活性试验,对所提取的活性成分进 行清除DPPH自由基作用的测定,对皂苷类化合物的清除自由基 能力进行研究比较.各提取物对DPPH自由基清除率如图4所 示.实验结果表明,3种中药的提取物对DPPH自由基的清除作 用与PCL法评价的结果略有差别,但大体趋势一致,三七提取物 的清除能力>西洋参提取物>人参提取物,但西洋参提取物清除 自由基能力稍高于人参,相较于PCL法的评价结果相差较小(见 图3,4).而不同提取方法对提取物的清除自由基的影响与 PCL法评价结果一致见图4. 图4不同提取物对DPPH自由基的清除作用 3.3提取物清除自由基能力的比较根据所测得到人参,西洋 参,三七中的主要皂苷的总量(见图2).同时结合提取物对自由 基的清除实验,可以看出两个实验体系中所得到的提取物对自由 基的清除效果:基本一致(见图3,4).对于三七的提取物来说, 其清除自由基的效果随着皂苷含量的增加而显着增大,对于提取 的皂苷含量,超声提取法>回流提取法>温浸提取法(见图2), 其清除自由基能力也是超声提取法>回流提取法>温浸提取法 (见图3,4).而西洋参和人参提取物的皂苷含量和其清除自由 基能力的趋势略有差别.实验结果表明,二者都是超声提取法提 取的效果要高于回流提取;但在清除自由基实验中,回流提取法 却表现出最好的清除自由基能力,超声提取法次之,但二者的差 别较小;而对西洋参和人参来说皆是温浸提取法的提取的皂苷含 量最低,其清除自由基能力也最弱.这可以说明皂苷的含量对于 自由基的清除能力有一定的影响,而之所以在西洋参和人参的提 取物中出现了皂苷含量与其清除自由基能力不相符的想象,有可 能是由于回流提取法提取温度较高,提取的成分较复杂,对于自 由基的清除能力产生了一定影响,这有待于进一步的研究. 4结论 本实验采用超声,回流和温浸提取法对人参,西洋参和三七 中的皂苷类化合物进行提取,用高效液相色谱技术定量分析了主 要皂苷的含量,同时结合PCL和DPPH清除自由基体外评价体系 分析皂苷类化合物的抗氧化活性,两种方法评价结果基本一致, 实验结果表明,人参,西洋参和三七的皂苷乙醇提取物均具有一 定的清除自由基能力,皂苷含量高的提取物,其清除自由基能力 较强.PCL法可以应用于皂苷类化合物的清除自由基能力研究. 参考文献: SalemYH.DulchavskySA.DuttaS.EffectofinhibitionofLipidper- oxidationonmyocardialoxidantdamage[JJ.Surg.Res.1994,56(6): 606. 孙丽萍,王大仟,张智武.11种天然植物提取物对DPPH自由基的 清除作用[J].食品科学,2009,30(10):45. 陈磐,陈绍瑗,冯懿挺,等.植物活性多糖抗癌活性的研究——抗 自由基作用[J].中国药物与临床,2004,4(8):606. 付瑞燕,樊美珍.氧自由基清除剂的应用[J].生物学杂志,2002,19 (4):31. 唐斌,程绪菊,刘江,等.人参皂苷药理作用研究进展[J].西南 军医,2005,7(3):45. 谢呜.中医方剂现代研究[M].北京:学苑出版社,1997:368. 郑虎占.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1997:62. 王雪梅,戴云,张建胜,等.分光光度法测定三七皂苷清除活性氧 自由基的研究[J].云南中医中药杂志,2006,27(6):41. 刘满红,杨明惠,刘晓芳,等.紫外辐射诱发自由基体系及抗氧化活 性的研究[J].化学世界,2008,14(1):14. 施跃坚,陈海云.绞股蓝体外抗活性氧自由基的研究[J].云南民族 大学(自然科学版),2008,17(3):241. 黄锁义,黎海妮,唐玉莲.芥菜中总黄酮的提取及其对羟自由基的 清除作用研究[J].时珍国医国药,2007,18(10):2479. 张海蓉,赵泰.检测维生素片剂的水溶性抗氧化能力(ACW) [J].生命科学仪器,2003,(6):40. 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