鸡传染性法氏囊的诊断技术

鸡传染性法氏囊的诊断技术 前言  鸡传染性法氏囊病(IBD)是由IBDV引起的一种主要危害雏鸡的免疫抑制性传染病。本病1957年首先在美国特拉华州岗博罗(Gumboro)镇的肉鸡群中发现的，故又称岗博罗病(Gumboro disease)。根据本病有肾小管变性等严重的肾脏病变，曾命名为“禽肾病”。又因该病主要以损伤鸡免疫器官法氏囊为主， 1970年为避免一病多名引起的混乱，统一称之为鸡传染性法氏囊病。 本 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 是参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》，并结合我国现有动物卫生法规、农业部对传染性法氏囊的相关政策和 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 及河欣科技中心试验条件制定的。 1 范围 本标准制定了传染性法氏囊的病毒分离、鉴定技术，病毒中和试验(VNT)、琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验、酶联免疫吸附试验(间接ELISA)、PCR的技术要求。 2 病毒分离与鉴定技术 2.1 材料准备 2.1.1 病料的采取及处理  病料的采取 病毒分离的病料应采自发病早期典型的病例，病程较长的家禽不宜用于分离病毒。病禽扑杀后应以无菌操作法解剖尸体和采取病料，不同传染病所采病料不同，最好的检验病料为气管黏膜、肺、脑组织，应优先采集。高热期的血液中也有较高病毒含量。另外，脾、肝、肾和骨髓也可做为病毒分离的材料。  2.1.2病料处理 按1克组织加入5～10毫升灭菌生理盐水进行研磨。每毫升研磨液中加入青霉素和链霉素各2000单位，置4℃冰箱作用2～4小时或37℃处理1小时后，以1500转/分钟离心15分钟，取上清液作为接种材料。 2.1.3无菌检验 对接种材料应作无菌检验。接种营养肉汤或血液琼脂平板，观察有无细菌生长。如有细菌，则应对材料进行滤过除菌或加入敏感抗菌药物处理。  2.2病毒分离 2.2.1 鸡胚选择与孵化 鸡胚应选择健康鸡群所产新鲜受精蛋，蛋的颜色以白壳蛋为好，照蛋时易于观察。孵化温度以37.5℃，湿度60%左右为宜。每天翻蛋3～4次，注意放蛋时应大头朝上，鸡胚接种日龄因分离繁殖的病毒特征不同在6～12日之间。 2.2.2接种前准备与接种 根据接种目的和分离的病毒特性不同，鸡胚接种分为绒毛尿囊腔内接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种和羊膜腔接种等方法。接种材料应确认无菌。经照蛋后画出气室和鸡胚位置，先用碘酒棉球、后用酒精棉球涂擦消毒接种位置及其周围。以绒毛尿囊腔内接种为例，接种位置一般选在气室边缘上3毫米处，在该部位打孔，用1毫升或2.5毫升灭菌注射器吸取处理后的病料，插入气室下部小孔约5～10毫米，每胚注射0.1～0.2毫升，然后用融化的石蜡将蛋壳小孔封闭。 2.2.3接种后检查 接种后每隔6小时照蛋一次，24小时内死亡鸡胚应丢弃并做无害化处理。24小时后死亡鸡胚连同72小时未死亡鸡胚，置4℃经6～12小时后取出收获材料，同时检查鸡胚病变情况。 2.2.4鸡胚材料收获 一般情况，接种部位即为收获材料的部位。尿囊腔接种者，无菌收取尿囊液；羊膜腔接种者，在先收取绒毛尿囊液后再用注射器吸取羊水；卵黄囊接种者，先收取尿囊液和羊水后再收取卵黄液。以上收获物应作无菌检验，防止细菌污染。  2.3病毒鉴定 2.3.1 法氏囊病毒的特异性鉴定：样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液没有凝血性，可用没有血凝性的鸡胚的绒毛尿囊液制备抗原，与法氏囊病毒标准阳性血清进行AGID试验，检测样品中是否含有法氏囊病毒。 2.3.2.1抗原的制备：从没有凝血活性的鸡胚中取出绒毛尿囊液，以1000r/min离心10分钟后取上清，按终浓度0.1%的量加入甲醛溶液，置37℃温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原。 3 琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验 3.1 材料准备 3.1.1 硫柳汞溶液、PH值7.2,0.01mol/L PBS溶液，配制见附录A 3.1.2 琼脂板：制备方法见附录B 3.1.3  法氏囊琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性血清和阳性血清。 3.2 操作方法 3.2.1 打孔：在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm。孔距2mm-5mm,将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。 3.2.2 封底：用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要融化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。 3.2.3 加样：用微量移液器或带有6-7号针头的0.25ML注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别加入外周1、4孔中，被检血清按编码顺序分别加入另外4个外周孔，每孔均以加满不溢出为度，没加一个样品换一个滴头。 3.2.4 作用：加样完毕后，静置5min-10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h、72h观察并记录结果。 3.3 结果判定 3.3.1 判定方法 将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则实验成立。 3.3.2 判定标准 3.3.2.1 若被检血清孔与中心孔抗原之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。 3.3.2.2 被检血清与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔被检样品判为弱阳性（弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性） 3.3.2.3 若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。 3.3.2.4 被检血清孔与中心抗原之间沉淀线粗而浑浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。 4 动物回归试验 4.4.1 4 周龄非免疫健康鸡60 只，取0．5 mL 病料上清液经滴鼻、点眼和擦肛等途径接种，另取5 只作为空白对照。无菌收集3～5 d 内死亡鸡的法氏囊，－70℃保存。 4.4.2 接种后，鸡只出现精神委顿、羽毛蓬乱、食欲减退或废绝、卧地不起、拉白绿水样粪便等外观 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现。 剖检发现，法氏囊肿大、弥漫性出血、呈“紫葡萄”状；心肌、骨骼肌出血。发病率达到100％，5 d 后的 死亡率高达70％。 5 病毒中和试验  可用细胞培养或幼龄鸡进行，比琼脂凝胶沉淀试验检测抗体更敏感，对估价疫苗的免疫应答是有用的。 5.1细胞培养中和试验  在微量滴定板的每孔中，加入0.5ml含100TCID50的病毒稀释液。被检血清经56℃灭能30min，然后以滴定板上的病毒稀释液将被检血清作连续倍比稀释。滴定板在室温放30min后，每孔加入0.2ml制备好的鸡胚细胞悬液，置37℃培养4～5天，每天在倒置显微镜观察细胞病变产生的情况，并以不出现细胞病变的最终稀释度的倒数(log2)判定终点。 5.2用鸡用中和试验  将被检血清在56℃灭能30min。取lml被检血清与lml已知阳性IBD抗原(可用细胞培养毒，lml含200TCID50／0.05ml，或用清亮的10％法氏囊匀浆) 合，置37℃孵良30～60min。将上述混合物滴入7只易感鸡眼内(易感鸡不含有IBD抗    体)，每只鸡滴0.5ml，3天后将鸡宰杀，检查其法氏囊有无病变。同时设立IBD阳性血清和阴性血清作对照。若被检血清采于非免疫鸡群，其阳性血清和被检血清鸡的法氏囊无病变，而阴性血清对照鸡的法氏囊出现病变时，表明被检血清的鸡已感染IBDV；如果被检血清采于免疫鸡群，出现这种情况，说明IBD疫苗免疫应答较好。相反，阳性血清鸡的法氏囊无病变，而阴性血清和被检血清鸡的法氏囊出现病变，表明IBD疫苗免疫应答差。 6 酶连吸附试验（间接ELSIA） 6.1仪器与试剂 6.1.1  仪器 6.1.1.1  酶标仪：具490 nm波长滤光片。 6.1.1.2  96孔酶标板。 6.1.1.3微量加样器：50 /iL、100 /iL。 6.1.1.4振荡器。 6.1.1.5  37℃恒温箱。 6.1.1.6微量离心管：1.5 mL。 6.1.1.7 台式离心机。 6.2试剂 6.2.1试剂规格 本标准所用化学试剂除另有特殊规定外，均为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。试剂配制用水需满足GB/T 6682的要求。 6.2.2包被液 碳酸盐缓冲液，0.1 mol/L，pH 9.6，配制方法见附录C。 6.2.3洗涤液 含有0. 05%（体积分数）Tween-20酌磷酸盐缓冲液(PBS-T)，0.OI mol/L，pH 7.4，配制方法见附录C 6.2.4稀释液 含有2.5%（质量浓度）牛血清白蛋白的PBS-T，使用当日配制。 6.2.5封闭液 含5%犊牛血清及0.I%Tween-20的TNE溶液，TNE溶液配制方法见第A.3章。 6.2.6底物溶液 含有0. 04%（质量浓度）邻苯二胺及0.1%（体积分数）双氧水的柠檬酸一磷酸盐缓冲液，pH 5.0，现 用现配，配制方法见第A.4章。 N/T 1554-2005 6.2.7终止液 2 mol/L硫酸溶液。 6.3 标准抗原、酶标抗体和标准血清 分别为： ——鸡传染性法氏囊病病毒抗原； ——酶标羊抗鸡IgG抗体； ——标准阳性血清； ——标准阴性血清。 6.4被检血清 无菌条件下静脉采血1 mL，分离血清，装于无菌小瓶或试管中，加贴标记后置4℃冰箱中保存备检。 6.5操作方法 6.5.1  包被抗原 将鸡传染性法氏囊病抗原用包被液稀释到工作浓度，每孔加IOO pL，用塑料薄膜盖住酶标板，37℃ 恒温箱中温育th，4℃过夜后备用。 6.5.2封闭 次日甩干包被液，每孔加封闭液200 pL，用塑料薄膜盖住酶标板，置37℃恒温箱中温育90 min。甩 干后用洗涤液洗涤3次，甩干。 6.5.3温育 用稀释液将被检血清作100倍稀释，每孔加100 /iL，每份血清加两孔，做平行重复试验。 每板的最后一排加标准阳性血清和标准阴性血清各2孔。 置37℃恒温箱中温育1 h，甩干后用洗涤液洗涤3次，甩干。 6.5.4加酶标羊抗鸡IgG抗体 将酶标羊抗鸡IgG抗体用封闭液稀释至工作浓度，每孔加100/-tL，置37℃恒温箱中温育1 h，甩干