大鼠神经垂体内后叶加压素神经分泌末梢的GABA能神经支配…

大鼠神经垂体内后叶加压素神经分泌末梢的GABA能神经支配… 大鼠神经垂体内后叶加压素神经分泌末梢 的GABA能神经支配… 第25卷第3期 1994年7月 解剖 ACTAANATOMICASIN1CA Vo1.25.No.3 July1994 ?cIl敬I 大鼠神经垂体内后o-l-~g压素神经分泌末梢 的GABA能神经支配的免疫电镜证实* 朱长庚张喜刘庆莹蔡秋云魏瑛 ‘同济医科大学解剖学教研室脑研究室’武汉’..030R5王,乎f 摘要为了探讨神经垂体内后叶加压紊(vP)释放的一氰基丁酸(GABA)能神经调控,本研 究用包埋前ABC法结合免疫电镜双标技术,研究了大鼠神经垂体内VP能神经和GABA能神经 的超微结构分布及其相互联系.先用DAB法显示GABA免疫反应.然后用钼酸镀一TMB法显示 vP免疫反应.再用DAB一氯化钴稳定后作免疫电镜包埋.电镜观察 发现:在神经垂体内GABA样 免疫反应产物呈电子密度高的颗粒状沉淀,定位于神经末梢内的小清亮囊泡周围和线粒体胰上I vP样免疫反应产物呈电子密度高的不规则形块状或针状敬在于神经分泌末梢内.GABA样神经 末梢分布于神经分泌末梢之间或紧贴毛细血管和垂体细胞.可与神经分泌末梢紧密接触甚至形成 突触.VP样神经分泌末梢内含小透亮囊泡和大颗粒囊泡,并可与GABA样轴突末梢形成突触.在 这种情况下,GABA样轴突为突触前成分,突触前,后膜呈对称性,突触间隙宽度小于20llm,内 含电子致密物质.以上结果证实,在大鼠神经垂体内vP释放受到GABA神经的直接突触调控. 关麓调丰电堑垂隹后叶加压素氨基丁酸免疫电镜突触大鼠 目前已知,在神经垂体内存在着胺类,氨基酸类和多种肽类物质【1.随着越来越多的神 经活性物质在神经垂体的发现,人们很自然地想到,这些不同种类的神经活性物质之间是否 存在着一定的关系,进而实现各种神经内分泌物质释放的调控呢?这正是神经内分泌学中的 关键问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .虽然一些学者曾经证明多巴胺和脑啡肽能抑制神经垂体内VP的释放【6_,胆囊收缩 素能促进VP的释放口],但多系药理学或生理学资料,形态学尤其是在突触水平的超微结构 证实极少.我们在过去发表的论文中已证实神经垂体内的vP神经分泌末梢接受几茶酚胺能 神经的突触调控].在此基础上,本研究拟用免疫电镜双标方法,进一步研究神经垂体VP样 神经分泌末梢的GABA能神经调控. 材料和方法 雌雄性Wistar大鼠6只,体重140~250g,戊巴比妥纳腹腔麻醉(40mg/ks体重),用生 理盐水100ml经升主动脉快速冲洗后,灌注冷的含4多聚甲醛和0.2戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液500ml,取出垂体,后固定于不含戊二醛的上述灌注液中4h,经磷酸缓冲 液洗涤后,用振动切片机作水平切片,片厚50m,用磷酸缓冲液收集,将前叶组织除去,根 据Norgren和Lehman[法略加改变作免疫电镜双标染色.第1套:切片经3正常羊血清处 理30rain后入第一级抗体兔抗GABA血清(1—1000,上海脑研究所产品)4?,72h,生物素 结合的羊抗兔IgG(1t50)和ABC复合物(1—50)各1h,DAB?4HCIAI2O(0.05/ 0.01)30rain,上述每步骤间用PBS充分洗涤.结果反应产物呈棕褐色.第2套:加第一级 t国家自然科学基垒资助的课题 ? VP神经分描末梢的GABA能神经支配的免疫电镜证实!1 抗体兔抗VP血清(1t1000,上海第二军医大学产品)CC,72h,经上述ABC程序处理,入 TMB液15~20min(TMB液内含钼酸铵,具体配方见前文再加0.3HzOz1ml,10~20 min,镜下检查切片至呈蓝绿色.取出后用Trls-HC1缓冲液短洗.然后按免疫电镜程序处理: 切片经稳定液处理3rain(稳定液内含DAB,CoC1.及H.O.,配方见前文),1锇酸溶液固 定1h,70酒精饱和醋酸铀溶液过夜,升度酒精及氧化丙烯脱水,Epon812平板包埋,45~C 聚合24h,60~C,48h.将包埋片修整后用502胶粘接在环氧树脂柱上,Reichert—Jung超薄切 片机切片,铜网贴片,枸橼酸铅染色,HitachillA电子显微镜观察,摄片. 对照试验:1.抗体交叉试验:(1)置换试验:用正常兔血清代替两种第一级抗体,分别 温育切片{(2)空白试验;分别省去GABA抗血清和VP抗血清,温育切 片.2.呈色混合试 验;在第1套染色程序完成后,切片经PBS洗涤,直接进行第2套染色程序中的钼酸铵一 TMB呈色步骤,以证实在第1套染色程序后是否有残余的ABC与第2套程序中的TMB发 生反应而导致反应产物混杂. 结果 在电镜下观察,神经垂体内显示的GABA免疫反应产物为电子密度高的颗粒状沉淀,位 于小清亮囊泡周围和线粒体膜上(图1,3).小清亮囊泡绝大多数为圆形,直径约40till2.在某 些终扣内,可见少数扁形囊泡(图6).在GABA免疫反应阳性轴突内未见颗粒囊泡.GABA样 轴突末梢分布于神经分泌末梢之间,后者内含许多具有分泌功能的大颗粒囊泡,可能含有肽 类物质(图1,2).在某些部位,GABA样末梢与神经分泌末梢紧贴(图1),甚至形成突触样结 构(图2).在后一种情况,GABA样末梢为突触前成分,内含大量被免疫反应标记的小清亮囊 泡.部分囊泡紧贴突触前膜{神经分泌末梢为突触后成分,内含大量大颗粒囊泡.突触前后膜 特化不明显,呈对称性,突触间隙宽度小于20nm,内含电子致密物 质.GABA样轴突还分布 于毛细血管附近,紧贴基膜和垂体细胞(图3).VP免疫反应产物则为电子密度高的针状或不 规则块状分布于神经分泌末梢内,后者尚含多少不等的大颗粒囊泡(直径约90nm)和小清亮 囊泡(图4,6).VP样神经分泌末梢散在分布于神经垂体内,在某些部位可与GABA样末梢 紧贴(图4),甚至形成突触样结构(图6).此时,GABA样末梢为突触前成分,呈帽状附于VP 神经分泌末梢的一侧,其内充满被免疫反应产物标记的小清亮囊泡,后者大多数为圆形,少 数为扁形,部分囊泡紧贴突触前膜.VP样神经分泌末梢为突触后成分,内含小清亮囊泡和少 数大颗粒囊泡.突触前,后膜特化不明显,呈对称性,突触间隙宽度小于20nm,内含电子致 密物质. 对照试验:用正常兔血清分别代替GABA抗血清和VP抗血清后,不出现相应的免疫反 应,只出现相应的另一种抗原一抗体反应.空白试验结果与置换试验相同.以上表明本实验无 抗体交叉反应.呈色混合试验阴性,表明两套免疫细胞化学程序之间不互相干扰,具有一定 特异性. 讨论 关于本实验所用包埋前ABC法免疫电镜双标技术的原理,优缺点和最适条件已述于我 们以往发表的论文.简言之,应用来自同一种动物的两种抗血清进行包埋前免疫染色不出 现交叉反应的原因是由于DAB反应产物掩盖了该处第1套免疫反应抗原部位的缘故.因此, 两种呈色剂的使用顺序应DAB在前,TMB在后,不能颠倒.此外,使用钼酸铵使TMB反应 液的pH值提高到6.0,与其前后反应的pH值接近,有利于结构保存和反应产物的稳定. 本实验在电镜下观察到神经垂体的VP样分泌末梢内除含有大颗粒囊泡外,尚可含有小 清亮囊泡(或微泡),这与我们以往在大鼠视交叉后区所观察到的vP末梢形态一致rn]. Navone等认为[1神经垂体内神经分泌末梢内的微泡就是突触前神经末梢内所含有的小突触 囊泡.因此,它们可能在传递突触信息中起一定的作用这也提示,神经垂体内的VP轴突末 梢不仅是释放VP至毛细血管,而且还可能作为突触前成分对其他神 经末梢起调控作用,当 然这一点尚待进一步的超微结构研究证明.? 本实验观察到神经垂体内GABA免疫反应阳性轴突末梢含大量小清亮囊泡,以圆形为 主,扁形很少,但无大颗粒囊泡,与大多 数学 数学高考答题卡模板高考数学答题卡模板三年级数学混合运算测试卷数学作业设计案例新人教版八年级上数学教学计划 者的观察结果一致,这说明扁形小泡不是GABA. 轴突末梢的主要特征.我们在大鼠神经垂体内观察到GABA样轴突末梢与vP样神经分泌末 梢形成突触,虽然突触前,后膜特化不显着,但突触前成分内部分囊泡紧贴突触前膜,突触 间隙内有电子致密物质,突触前后膜电子密度高等特征均符合突触标准,与我们以往的观察 一 致.而且,上述结构属于抑制性突触的形态特征,与GABA对vP释放实行抑制性调控 的功能一致迄今为止,对VP神经元调控的形态学研究仅限于在下丘脑室旁核和视上核内 VP神经元的胞体水平,本文首次报道在神经垂体内vP神经末梢水平,GABA神经末梢 对VP释放的突触调控. 我们在本实验中还观察到GABA样神经末梢还分布于毛细血管和垂体细胞附近,与 Oertel的报道L1’_一致,其机能意义一方面提示神经垂体内的GABA可通过毛细血管进入血流 对其他部位实现功能性影响,另一方面由于垂体细胞属于神经垂体内的星形胶质细胞,能摄 取和释放局部产生的由GABA神经末梢释放的GABA,从而间接调节VP和其他神经激素的 释放”]. 收蔫1993--09修回1994--01 本文图1,6见插图第1页 图版说明 图1大鼠神经垂体内的GABA撵神经末楠(G),免疫反应产物呈焉垃状位于小清亮囊泡周圈及线粒体膜上.免疫 反应阴性神经分末楠(A)内含大量大颗粒囊泡.井与GABA样末精譬邻X11400 图2神经垂体内的GABA撵辅突末梢(G)内含大量赦免疫反应标记的小清亮囊泡(部分囊泡譬玷突触前膜)和一些 线粒体,井作为突触前成分与束标记的神经分泌末楠(A)形成突触.突触前,后膜呈对称性,突触间隙小于2O 啪,内含电子致密物质.空箭头指示突触活性区x19800. 图3神经垂体内的GABA样轴突末精(G)譬邻毛细血管(cp)和垂体细胞(P)×5440 图4神经垂体内的GABA撵轴突末精(G)与VP佯辅突末楠(v)互相 密切接触×15980 图5神经垂体内的VP样轴突束梢(v).内含许多大颗粒囊泡(星号)及小清亮囊泡(黑三角)x9800 圈8神经垂体内的GABA样轴突末精(G)与VP样轴突末梢(v)形成对称性突齄(空莆头).G为突齄前成分.其内 充}睹小清亮囊泡.少数囊泡为扁形(白前头).部分囊泡譬玷突齄1HI.V为突触后成分.内有块状的TMB反 应产物,大腼粒囊泡(空三角)及小清亮囊泡(黑前头).突齄间隙小于20nm,内含电子致密物质×11500 参考文献 [1]LuppiPH,S~kaiK,SalvD.etPvent工icu】ardcIninergicT-euronterfllin 砒jIlgintheneur~ntermediatelobeofthe ch~ophJc0mpNemo1.1986.2”(2)l204 [2]S~laudLC.WvilaceJA.ComunasF.seraton—i衄un饥删ivelrvefiber~ofther且tphtary ch.nilleandanti—se~otonindrLon帅曲.mgpatterr~BrainR.1986,388(2)l310 [3]RabhlM,Ont~mteB,KakO.n.1mmunocytochemieal毗udyottheGABA-ergmne~ationotther?u衅0ituitaryby useo/antibody日?t岬_丑nobutyricacid(GABA).CellTissueRes,1987,247(1)『33 [妇朱长庚.睬阿青,刘庆莹等.大鼠神经垂体敢粪物质的免疫电镜研 究.解剖,1989.20(2)r147 3期朱长庚等.大鼠神经垂体内VP神经分泌末梢的GABA能神经支 配的免疫电镜证实?235? 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KEYWORDSNeurohypophysislVasopressinlGABA}Immunoelectronmicroscopy} SynapselRat