SLC33A1蛋白对HEK293细胞增殖的影响及机制

SLC33A1蛋白对HEK293细胞增殖的影响及机制 中国 科技论文在线 ////0>. SLC33A1 蛋白对 HEK293 细胞增殖的影响 # 及机制** 赵宝悦,孙文杰 5 (山东大学医学院,济南 250012 ) 摘要 : 目的 探讨 SLC33A1 蛋白对 HEK293 细胞增殖的影响及其机制。 方法 用 PEI 转染试 剂将 PEGFP-C1-SLC33A1 载体转染 HEK293 细胞,然后用含 G418 的培养液筛选获得具有 Genectin 抗性的高 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 SLC33A1 的 HEK293 细胞 (PEGFP-C1-SLC33A1。通过 CCK8 法检 测细胞增殖的变化。Western blot 法检测增殖相关蛋白 β-catenin 、cyclin D1 以及 c-myc 等的 10 表达。结果 CCK8 和克隆形成实验结果显示,高表达 SLC33A1 的 PEGFP-C1-SLC33A1 细 胞组与正常表达 SLC33A1 的 PEGFP-C1 细胞组相比, 增殖速度明显加快P0.05 。Western blot 结果显示 β-catenin 、 cyclin D1 以及 c-myc 蛋 白的表达水平显 著升高P0.05. 结论 高表 达 SLC33A1 因可通过活化 Wnt/ β-catenin 信号途径促进 HEK293 细胞 的增殖。 关键 词: 基础医学;SLC33A1 (AT-1 );细胞增殖;Wnt/ β-catenin 信号途 径 15 中图 分类号:R394.3 The effect and mechanism of SLC33A1 on cellular proliferation of HEK293 cells Zhao Baoyue, Sun Wenjie 20 School of medicine, Shandong uninersity, Jinan 250012 Abstract: Objective To investigate the effects of over?expression of SLC33A1 on cell proliferation and Wnt/ β-catenin signal pathway of HEK293. Methods The eukaryotic expression vector PEGFP-C1-SLC33A1 was stably transfected into HEK293 cell by PEI. The genectin-resistant SLC33A1 overexpression cellsPEGFP-C1-SLC33A1 were selected out by 25 culture liquid containing G418 as the experiment group, paralleled with the vector control PEGFP-C1. The effect of SLC33A1 overexpression on the proliferation of HEK293 cells was observed by CCK8 method. The expression levels of β-catenin, cyclin D1 and c-myc were examined by western blotting. Results Compared with the control group, the proliferation of PEGFP-C1-SLC33A1 increased significantly. The expression levels of β-catenin, cyclin D1 and 30 c-myc were significant higher than control group p0.05. Conclusion Over-expression of SLC33A1 can promote the proliferation and malignant transformation of HEK293 cells via the activation of Wnt/ β-catenin signal pathway . Key words: Basic medicine; SLC33A1AT-1; cell proliferation; Wnt/ β-catenin signaling pathway 35 0 引言 SLC33A1 基 因最早发现于 1997 年[1] ,但目前为止有关SLC33A1 基因及 其编码的蛋白 的功能研究非常少,研究结果显示 SLC33A1 基 因编码的蛋白 SLC33A1 (又 名 AT-1 )定位 于内质网上,其可以将乙酰辅酶 A 转移至内质网内,参与蛋白的乙酰化修饰 [2-3] 。也有结 果表明 SLC33A1 蛋白在 内质网应激过程中起到重要作用,可以阻止细胞的 自噬,对细胞发 基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(201);山东省优秀中青年科学家科研奖励基 金(BS2012SW007 ) 作者简介:赵宝悦,女,硕士研究生,主要从事神经退行性疾病致病基因功能的研究 通信联系人:孙文杰,女,讲师,主要研究方向:神经退行性疾病致病基因的功能研究. E-mail: sunwenjie@//. - 1 - 中国 科技论文在线 ////. 40 挥保护作用[4] 。2006 年, 本实验室在山东青岛地区发现了一个遗传性痉挛性截瘫大家系, 呈常染色体显性遗传。并发现人类SLC33A1 基因 是该家系的致病基因,患者均携带 S113R 错义突变[5-6] 。对该基因的功能研究将有利于对其在遗传性痉挛性截瘫中的致病机制的探 讨。 已有许多研究报道 Wnt/ β-catenin 信号 通路参与调节细胞的增殖以及分化、运动、凋亡 45 等活动[7-8] 。 当此信号通路被 Wnt 信号激活后可以抑制 β-catenin ,Axin ,APC ,GSK-3 β 复 合物的形成,进而抑制了 GSK-3 β 对 β-catenin 的磷酸化,未被磷酸化的 β-catenin 逃脱了泛 素- 蛋白酶体途径的降解, 在细胞浆中大量堆积, 并进入细胞核, 与 T 细胞因子/ 淋巴样增强 因子(TCF/LEF 结合,启动下游靶基因 cyclinD1 ,c-myc 等的表达,从而促进细胞的增殖 [9-11] 。 50 为进一步研究 SLC33A1 的功能,我们构建了高表达 SLC33A1 的 HEK293 细胞系,探 讨其在细胞增殖中的作用及对 Wnt/ β-catenin 信号 通路影响。 1 材料和方法 1.1 材料 PEGFP-C1-SLC33A1 为本 实验室前期构建。HEK293 细胞由本 实验室保存。胎牛血清、 55 DMEM 培养 基、 胰蛋白酶、Trizol 等购自 Invitrogen 公司。DNA Marker、总 RNA 提取试剂 盒、RT-PCR 试剂盒购自 Fermentas 公司。SLC33A1 引物合成与 测序由上海生工完成。CCK8 试剂盒购自碧云天公司。BCA 法蛋白定量试剂盒购自 Pierce 公司。鼠抗 β-catenin 单克隆抗 体、 鼠抗 c-myc 单克隆抗体购自 santa 公司、 兔抗 cyclinD1 单克 隆抗体购自 abcam 公司 FITC 标记兔抗,JHRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 购自 Jackson 公司 。 60 1.2 方法 1.2.1 细胞 培养 将 HEK293 接种到含有 10% 胎牛血清 ,100U/ml 青霉素,100?g/ml 链霉素的 DMEM 培 养基中,置于 37 ? ,5%CO2 培养箱 中培养。 1.2.2 PEGFP-C1-SLC33A1 细胞系 的建立 65 将 HEK293 细胞接种到培养瓶中,待细胞汇合度达到 70-80% 时用 PEI 转染试剂根据转 染说明进行转染,分别将 PEGFP-C1-SLC33A1 和 PEGFP-C1 转入 HEK293 细胞中。 转染后 5 换正常培养基恢复培养 24 小时后,以 2×10 个细胞/ 皿传入内径 60 mm 培养皿,48 小时后 以终浓度为 10 ?l/ml 的 G418 筛选, 每 3 天换液一次 , 直至未转染细胞全部死亡, 继续培养 , 挑取克隆以 5?l/ml 的 G418 维持,扩大 培养进行检测。 70 1.2.3 PEGFP-C1-SLC33A1 细胞系 的鉴定 RT-PCR 检测 SLC33A1 mRNA 的表达。 用 Trizol 法提取各组总 RNA , 根据逆转录试 剂 盒将 RNA 逆转录成 cDNA ,采用 SYBR Green I 染料法检测各组细胞中 SLC33A1 mRNA 水 平的相对表达量, 荧光定量 PCR 体系:SRBR Premix ExTaqTM ? 12.5 ?l, 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 cDNA 2 ?l , 10 ?mol/l 的 上下引物各 0.5 ?l , 灭菌双 蒸水 10 ?l 。 反应条件:95 ? 5 min 、94 ?15 s 、65 ? 30 75 s 、72 ? 30 s ,40 个循环 ,95 ? 保温 1 min 。制作融解曲线,检测引物的特异性。相对基因 表达分析采用 2-ΔΔCt 法 。实验重复 3 次。 - 2 - 中国 科技论文在线 ////. 1.2.4 细胞 增殖检测 3 细胞以 2×10 个细胞/ 孔接种于 96 孔培 养板中, 每组设 6 个复孔, 分别培养 1 、2 、3 、4 、 5 、6 、7 天。 每孔加入 20 ?l CCK-8 溶液, 37 ? 、5%CO 继续培 养 4 小时, 酶标仪上 450 nm 2 80 测定各孔吸光度值, 以吸光度值表示细胞增殖能力大小, 各组取 6 孔平均 值, 绘制生长曲线。 1.2.5 Western blot 检测 蛋白表达 收集两组细胞, 加入适量细胞裂解液在冰上裂解, 随后 4 ? ,12000 r/min,离心 10 min 。 吸取上清液转移至新的 EP 管中,BCA 法测定蛋白总浓度, 取 40 ?g 总蛋 白进行 SDS-PAGE 电泳,湿转至 PVDF 膜(100V ,1 h )。50 g/l 脱 脂奶粉室温封闭 1 h 。分 别用鼠抗 β-catenin 85 (1:1000 稀 释),兔抗cyclin Dl (1:1000 稀释), 鼠抗 c-myc (1:500 稀释) ,鼠抗 β-actin (1:2000 稀释)4 ? 孵育 过夜。 对应加入 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG (1:5000 稀释 ) 和 HRP 标记的山羊抗兔 IgG (1:10000 稀释) , 室温孵育 1 h ,ECL 试 剂盒显影。 用 Image J 分析软 件对蛋白条带进行灰度值测定。实验重复 3 次。 2 结果 90 2.1 PEGFP-C1-SLC33A1 细胞系的建立和鉴定 PEGFP-C1-SLC33A1 和 PEGFP-C1 分别转染 HEK293 细胞后成 功筛选出两种细胞系, 通过荧光显微镜观察发现 PEGFP-C1 细胞内荧光 呈弥散分布 (图 1A ) , PEGFP-C1-SLC33A1 细胞内荧光分布与 SLC33A1 蛋白分 布情况一致 (图 1B ) 。 进一步通过 RT-PCR 法检 测, 结 果显示, 与 PEGFP-C1 对照细胞组相比,PEGFP-C1-SLC33A1 细胞组 SLC33A1 mRNA 的表 95 达水平显著升高(图 2 )。 图1 HEK293 细胞中质粒转染结果 Fig.1 The result of plasmid transfection in HEK293 cells - 3 - 中国 科技论文在线 ////. 100 图2 SLC33A1 mRNA 表达的 检测结果 Fig.2 The result of the SLC33A1 mRNA expression 2.2 SLC33A1 对 HEK293 细胞增殖的影响 CCK-8 细胞增殖实 验测定显 示 , 与 PEGFP-C1 组相比 , 高表 达 SLC33A1 的 PEGFP-C1-SLC33A1 细胞 组细胞的增殖能力明显增强(图 3 )。 105图3 SLC33A1 对 HEK293 细 胞增殖的影响 Fig.3 The effect of SLC33A1 on cellular proliferation of HEK293 cells 2.3 western blot 检测结果 110 western blot 检测结果显 示高表达 SLC33A1 的 细胞组的增 殖相关 蛋白 β-catenin 、 cyclinD1 以及 c-myc 蛋 白的表达量都是显著升高的(图 4 )。 - 4 -