【word】 一株鹅细小病毒全基因特征分析

【word】 一株鹅细小病毒全基因特征分析 一株鹅细小病毒全基因特征分析 中国动物传染病 2011,19(4):19-24ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases ? 研究论文? 一 株鹅--.rod’病毒全基因特征分析 万春和,朱海侠,黄瑜,彭春香,程龙飞,施少华,傅光华,陈红梅 (1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013:2.福建省农林大学动物科学学院,福州350002) 摘要:根据GenBank登录的鹅细小病毒基因序列和基因组结构特征,采用PCR技术扩增获得一株鹅细小病毒株(Goose parvovirus,GoPV)全基因序列,为中国大陆地区首次报道.GoPV株病毒全基因大小为5106nt,其基因组5端和3’端均 含有相同的末端倒置重复序列(invertedterminalrepeats,ITR),ITR全长为444nt.GoPV基因组主要由左右两侧两个开放 阅读框组成,左侧编码非结构蛋白(non-structureprotein,NS)NS1和NS2,右侧编码3种结构蛋白fviralstructuralprotein, VP)VP1,VP2和VP3.NS基因全长为1884nt(537-2420nt),其中NS2全长1356nt(1065,2420nt);VP基因全长 2199nt(2439-4637nt),其中全长1764nt(2874-4637nt),VP3全长 1605nt(3033,4637nt),在其右侧的ITR前 有一个Poly(A)的尾.GoPV株病毒全基因和欧洲疫苗株 (Eu583392(VG32/1,Europe))核苷酸同源性最高,高达98.6%.本 研究为进一步研究GPV分类地位以及进化关系提供依据,也为研究 GPV强毒株和疫苗株之间生物学特性以及GPV治病机 理和开发基因工程疫苗奠定基础. 关键词:鹅细小病毒;全基因;分子特征 中图分类号:$858.332.659.2:Q75文献 标识 采样口标识规范化 下载危险废物标识 下载医疗器械外包装标识图下载科目一标识图大全免费下载产品包装标识下载 码:A文章编 号:1674.6422(2011)04.0019—06 GENoMICCHARACTERIZATIoNSoFAPARVoVIRUS ISoLATEDFRoMGooSE WANChun-he,ZHUHai—xia2,HUANGYu,PENGChun—xiang,CHENGLong.fei, SHIShao—hua,FUGuang—hua.CHENHong—mei I1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine.FujianAcademy ofAgriculturalSciences.Fuzhou350013,China. 2.CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fu zhou350002,China) 收稿日期: 基金项目: 作者简介: 通信作者: 2011-05-23 公益性行业(农业)科研专项经费项目(201003012) 万春和,男,助理研究员,主要从事水禽病毒分子生物学研究 黄瑜,E—mail:huangyu一815@163.com [161WongJP,ZabielskiMA,SchmaltzFL,eta1.DNA VaccinationagainStrespiratoryinfluenzaviruS infection[J].Vaccine,2001(19):2461—2467. 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Keywords:Gooseparvovirus;full-genome;molecularcharacterization 鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)是感染 禽类的主要自主复制型细小病毒,由中国学者方定 一 1956年首先在江苏省扬州地区发现?卫,以后在 许多国家研究者也分离到该病毒,世界禽类学会为 纪念匈牙利学者Derzsy的先进工作而将此病命名为 Derzsy’S病瞄.鹅细小病毒属于细小病毒科,细小 病毒属,只有一个血清型.该病毒主要侵害30日龄 以内的雏鹅和雏番鸭,引起急性肠炎及肝,肾,心 等实质脏器败血f生病变,尤其是小肠部位的纤维性, 栓塞性病变.Derzsy’S病是目前危害养鹅业健康发 展的最严重的传染病之一,已造成严重的经济损失, 引起了国内外学者的广泛重视. 目前,关于GPV全基因序列仅有少量报道, 中国国内关于GPV基因序列仅限于其左右两侧两个 开放阅读框(openreadingframe,ORF),位于左侧 的非结构蛋白(non—structureprotein,NS)基因和位 于右侧的结构蛋白(viralstructuralprotein,VP)基因 [7-91 ,而对于其基因组5’端和3’端均含有相同的末端 倒置重复序列(invertedterminalrepeat,ITR)还未 见报道,本研究根据其ITR基因结构在箭头上有一 个SphI限制性内切酶的酶切位点(GCATGC), 设计引物,从而获得其ITR序列,经拼接后获得 GoPV株全基因序列,现将研究结果报告如下. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1毒株GPV病毒株为本实验分离并保存. 1.2试剂蛋白酶K购自Merck公司;SDS购自Sigma 公司;GoTaqMasterGreenMix购自Promega公司; DNA基因组提取试剂盒,DL2000DNAMarker和 pMD18一T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司; 琼脂糖凝胶回收小量试剂盒,质粒小量抽提试剂盒 购自OmegaBio—Tek公司,其它试剂均为分析纯; 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5感受态细胞自制. 1.3引物参照GenBank中登录GPV序列和GPV基 因组结构特征,设计引物,所有引物均由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成,引物序列见表l. 表1目的基因的引物序列 Table1Theprimersusedtoamplifythetargetgene 注:GPV2R和GPV6R引物序列相同,下划线表示SphI酶切位点 Note:GPV2RandGPV6Rprimerssharedthesamesequence,andtheunbedin emeanstheSphIrestrictionsite 第l9卷第4期万春和等:一株鹅细小病毒全基因特征分析?21? 1.4DNA的提取参照文献[10],提取鹅细小病毒 基因组DNA. l-5目的基因的扩增,克隆及序列测定与分析用 所设计的特异性引物进行PCR扩增,体系为50 L,其中2×GoTaqMasterGreenMix25IxL,上 下游引物(20m/mL)各1IxL,cDNA1IxL,灭 菌去离子水22L.反应条件为:94?5min预变 性后进入循环,循环参数为:94?变性50s,53? 退火35s,72oC延伸2min,30个循环后,72?再 延伸10min.取PCR产物5L,在l%琼脂糖凝 胶上电泳.将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与 pMD18一T载体连接,转化DH5感受态细胞,用 PCR和双酶切方法鉴定重组质粒,阳性重组质粒 送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测 定.用Lasergenev7.1DNAStar软件进行序列拼接, 并将拼接后的全基因序列向GenBank提交,进行 序列分析. 1.6鹅细小病毒参考毒株本实验中使用的细 小病毒株GenBank登录号和毒株编号如下: U25749(VirulentB,Hungary),AF416726(GPV- YG,China),AY506546(HG5/82,China), AY512830(GD,China),EU022755(HBZF07, China),EU253479(LN一1/06,China), EU088l01(SCh,China),EU088102(DB3, China),EU088103(GDFSh,China), 537NS(NS1)2420 1065NS22420 5106nt 2439 EU583389(82—032lV,Taiwan),EU583390(82— 0321,Taiwan),EU583391(06—0329,Taiwan), EU583392(VG32/1,Europe),EF5l5837(DY, China(duck)),U22967(MDPV). 2结果 2.1测序结果应用Lasergenev7.1DNAStar软 件分析序列测定结果,并进行序列拼接后获得 GPV株病毒基因组全长5106nt(GenBank登录号 HQ891825).分析可得其基因组结构(见图1), 5’和3’端ITR长为444nt,可折叠形成”u”形双 链发夹结构,发夹结构中含有181nt的无错配”茎” 部与1个44nt的”泡”区,外形如”箭”状, 在箭头上有一个SphI限制性内切酶的酶切位点 (GCATGC).该株病毒的主要结构蛋白由左右两 侧两个开放阅读框编码,左侧编码非结构蛋白(NS1 和NS2),右侧编码(VP1,VP2和VP3)结构 蛋白.其结构蛋白基因NS1(5372420nt)编码 的蛋白长度为627个氨基酸(aminoacid,aa), NS1(1065—2420nt)编码的NS2蛋白长度为451 个氨基酸;其衣壳蛋白基因VP1(2439,4637nt) 编码的VP1蛋白长度为732个氨基酸,VP2 (2874,4637nt)编码的VP2蛋白长度为587个 氨基酸,VP3(3033,4637nt)编码的VP3蛋白 长度为534个氨基酸,在其右侧的ITR前有一个 Poly(A)的尾. Poly(A) VP(VPI)4637 2874VP24637 3033VP34637 图1GoPV基因组结构示意图 Fig.1Thesketch-mapofGoPVstraingenomestructure 2.2GPV全基因分析 2.2.1鹅细小病毒间全基因特征比较应用Lasergene v7.1DNAStar软件,将GoPV株病毒全基因与 GenBank登录的其它鹅细小病毒全基因进行比较 分析(见表2).结果显示,GoPV与欧洲疫苗株 EU583392同源性最高,高达98.6%;与匈牙利鹅 5106 SphI ITR(444) 《——————————一 细小病毒分离株U25479同源性最低,为93.6%. 2.2.2鹅细小病毒主要结构蛋白特征比较 2.2.2.1鹅细小病毒非结构蛋白同源性比较将拼 接后鹅细小病毒结构蛋白基因NS序列与GenBank 中下载的鹅细小病毒非结构蛋白基因NS进行核 苷酸同源性比较.本实验株与GenBank登录号 盘 ? 22?中国动物传染病2011年7月 AY506546(黑龙江)和EU283749(辽宁)毒株 NS基因的同源性最高,均高达99.7%;与鸭源鹅 细小病毒株EF515837(DY,China)NS基因的同源 性为94.1%;与EU583391(06—0329Taiwan) 毒株同源性最低,为93.6%;与番鸭细小病毒株 U22967(MDPV)NS基因的同源性为80.9%.应用 MEGA4.1(UPGMAmethod),以番鸭细小病毒株 U22967(MDPV)为对照,绘制NS基因遗传进化树, 从遗传进化关系可以看出(图2),鹅细小病毒在 NS基因可以分为两个明显的基因亚群,鹅细小病 毒匈牙利株,欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株均处 在第l亚群(台湾亚群),鹅细小病毒中国大陆分 离株在两个群内均有分布. HBZF07,China 82—0321.Taiwan 06—0329,Taiwan VirulentB,Hungary DYChina(Duck) VG32/1.Europe 82—032lVTaiwan ?GoPV,China GPV-YG,China HG5/82.China LN一1/06,China MDPV 图2鹅细小病毒非结构蛋白基因遗传进化分析 Fig.2PhylogeneticanalysisofNSgeneofGooseparvoviruses 2.2.2.2鹅细小病毒结构蛋白遗传进化分析将 拼接后鹅细小病毒结构蛋白基因核苷酸序列与 GenBank中下载的鹅细小病毒结构蛋白基因VP 进行核苷酸同源性比较.本实验株与GenBank登 录号AY506546(黑龙江)和AF416726(GPV— YG)毒株VP基因的同源性最高,均高达99.8%; 与鸭源鹅细小病毒株EF515837(DY,China)同源 性最低,但也高达88.7%;与番鸭细小病毒株 U22967(MDPV)VP基因的同源性为79.7%.应用 MEGA4.1,以番鸭细小病毒株U22967(MDPV)为 第19卷第4期万春和等:一株鹅细小病毒全基因特征分析 对照,绘制VP基因遗传进化树,从遗传进化关系 可以看出(图3),鹅细小病毒在VP基因可以分 为两个明显的基因亚群,鸭源鹅细小病毒株(DY, China)为单一亚群,其它鹅细小病毒为一个亚群, 该亚群有可分为3个明显的亚群,鹅细小病毒匈牙 利株和台湾株均处在第1b和IC亚群,鹅细小病 毒中国大陆分离株在3个亚群内均有分布. ?GoPVChina GPv-YGChina HG5/82.China SCh.China GD.China GDFSh.China 82.0321.Taiwan 06—0329,Taiwan 82—0308,Taiwan 82—0321VTaiwan VirulentB,Hungary VG32/1,Europe DB3,China DChina(Duck) MDPV 图3鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析 Fig.3PhylogeneticanalysisofVPgeneofGooseparvoviruses 3讨论 3.1鹅细小病毒与番鸭细小病毒和人细小病毒B19 的ITR大小和形状非常接近,其正极性链和负极 性链的3和5’端均具有发夹样结构,在病毒DNA 复制和包装过程中起重要作用n”,且其ITR中还 含有大量的4,10nt重复序列,如本实验株GoPV 毒株中”TTCCGG”就重复l2次.有报道表明, GPV中有许多重复结构域与已知转录因子的识别序 列相吻合嗡.5’和3’端ITR长为444nt,可折叠形 成”u”形双链发夹结构,发夹结构中含有181nt 的无错配”茎”部与1个44nt的”泡”区,外形 如”箭”状,在箭头上有一个SphI限制性内切酶 的酶切位点(GCATGCE12J本研究根据其ITR特点, 设计引物,巧妙的避过大量的重复序列,从而获得 其ITR序列.在报道的鹅细小病毒基因中,ITR序 列的长短有所不同(381,444nt),但是所有的NS 基因和VP基因的长度却是相同的,分别为1884nt 和2199nt.有推测其ITR的长短和病毒毒力有关, 且ITR较短的多为低致病力毒株或疫苗株,这个 与本研究结果有所不同,由于目前鹅细小病毒的全 基因分子特征报道有限,还需做进一步的研究. 3.2通过TATA盒搜索发现,GPV基因组有3个 潜在的启动子:P9,P19和P41,它们分别位于 NS1,NS2和VP1的起始密码子之前.P41的转录 物经剪接后产生VP1和VP2,而VP3是在整个核 壳形成之后,从VP2氨基端剪去部分氨基酸形成 的,是一个非典型的”TTTTAA”序列,它的位点 与AAV的P40位点相类似,是有功能的启动 子.GPV基因组编码3种结构蛋白,即VP1,VP2 和VP3.三者起始密码子各不相同,但共用同一 终止密码子poly(A)处.VP1,VP2和VP3的起始 密码子分别位于2439bp的ATG处,2847bp处的 ACG处和3033bp的ATG处,其终止密码子均位 于4635bp的TAA处.Zadori等分析鹅细小病毒 右侧阅读框时仅发现2个ATG密码子,分别为翻 译VP1和VP3的起始密码子,没有发现VP2的起 ? 24?中国动物传染病2011年7月 始密码子,指出翻译VP2的起始密码子为非典型的 ACG. 3.3本研究对鹅细小病毒的非结构蛋白和结构蛋白 进行序列分析,结果表明,目前存在的鹅细小病毒 的同源性比较高4.M,这进一步支持了鹅细小病毒 只有一个血清型的特征,为开发其他的诊断方法提 供理论支撑[17-1810从遗传进化关系可以看出,其两 个主要结构蛋白基因在遗传进化上稍有差异:NS 基因在遗传进化上可分为2个明显的亚群,中国大 陆分离株在两个亚群内均有分布;从其VP基因的 遗传进化上,鹅细小病毒鹅源分离株在遗传进化上 分为3个明显的亚群(Ia,Ib,IC),Ib亚群 中毒株均为强毒株,本实验弱毒疫苗株处在Ia亚 群,台湾疫苗株和欧洲疫苗株处在Ic亚群.而鹅 细小病毒鸭源株(DY,China)在VP基因的遗传进 化上为单一亚群,提示GPV在VP基因上的进化速 度较NS基因更快,有报道其可能与宿主免疫系统 的压力所致有关. 参考文献 [1】方定一.”小鹅瘟”的介绍[J】.中国兽医学杂志,1962, 9(8):19-20. 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