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粗蛋白的定量测定 微量凯氏定氮法.doc

粗蛋白的定量测定 微量凯氏定氮法

蓝蓝的天风吹
2017-10-15 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《粗蛋白的定量测定 微量凯氏定氮法doc》,可适用于影视/动漫领域

粗蛋白的定量测定微量凯氏定氮法实验目的掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。学会使用凯氏定氮仪。二、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系其中含碳,、氢,、氧,、氮,和硫,。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近一般恒定在,平均值为左右因此在蛋白质的定量分析中每测得克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量再乘以就可以计算出样品中的蛋白质含量。生物样品中的含氮量可用以下反应来测定:含氮有机物与浓硫酸共热被氧化成二氧化碳和水而氮则转变成氨氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点()加入硫酸铜作为催化剂过氧化氢作为氧化剂以促进反应的进行。反应()()在凯氏烧瓶内完成反应()在凯氏蒸馏装置中进行其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小节省能源本仪器使用方便效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中硼酸吸收氨后使溶液中的H浓度降低然后用标准无机酸滴定直至恢复溶液中原来H浓度为止最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。三、仪器和试剂仪器消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、mL锥形瓶、mL量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。试剂血清或卵清蛋白等其他含蛋白质样品消化液:过氧化氢、硫酸与水的比例为临用时配制。催化剂:硫酸铜(CuSOHO)与硫酸钾(KSO)以:配比研磨混合。氢氧化钠溶液硼酸溶液标准盐酸溶液(约molL)混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由mL甲烯蓝乙醇溶液与mL甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色碱性时为绿色变色范围很窄且很灵敏。四、实验步骤(一)安装微量凯氏定氮仪定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个,升容积的烧瓶。反应室上边有两个小烧杯一个供加样一个盛放碱液。样品和碱液由此可直接到反应室中。反应室中心有一长玻璃管其上端通到反应室外层下端靠近反应室的底部。反应室下端底部有一开口上有橡皮管和管夹。由此放出反应废液。反应所产生的氮可通过反应室上端细管经冷凝管通入收集瓶中。反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。安装仪器时将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。橡皮管连接的部位应在同一水平位置。冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。安装完毕后不得轻易移动以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气以保证所测结果的准确样品的处理()固体样品随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中置于的烘箱中干燥h用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内待降至室温后称重称重一次恒重即可。随后继续干燥样品每干燥h()血清样品取人血(或猪血)放入离心管中与冰箱中放置过夜。次日离心除去血凝块上层透明清液即为血清。吸出mL血清加到mL容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度混匀备用。溶液如果显混浊加少量氯化钠再混匀。()卵清蛋白取g卵清蛋白溶于NaCl溶液并稀释至mL。如有不溶物离心取上清液备用。(三)消化取支消化管并编号在、、号管中各加入精确称取干燥样品(注意:加样品时应直接送入管底避免沾到管口和管颈上)加催化剂g混和消化液mL在、号管中各加相同量的催化剂和混合消化液(若样品是液体时还要加与样品等体积的蒸馏水)作为对照用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后将支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸不久看到消化管内物质变黑并产生大量泡沫此时要特别注意不能让黑色物质上升到消化管的颈部否则将严重地影响样品测定结果。当混合物停止冒泡蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时适当加强火力。在消化时应是全部样品都浸泡在消化液中如在瓶颈上发现有黑色颗粒应小心地将消化倾斜振摇用消化液将它冲洗下来。通常消化需要,h(对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间)。待消化液变成褐色后为了加速消化完成可将消化管取出稍冷加过氧化氢溶液,滴于管底消化液中再继续加热h。消化完毕取出消化管冷却至室温。(四)蒸馏()仪器的洗涤仪器应先经一般洗涤再经水蒸气洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器(正在测定中的仪器)加样前使蒸汽通过,min即可对于较长时间未使用的仪器必须用水蒸气洗涤到吸收蒸汽的硼酸指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。洗涤方法如下:取,个mL锥形瓶加入mL硼酸、滴混合指示剂用表面皿覆盖备用。现煮沸蒸汽发生器其中盛有体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水样品杯中也加入体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝左右在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸集水滴。这样用蒸汽洗涤min指示剂的锥形瓶位置倾斜冷凝管下口应完全浸泡于液体内继续用蒸汽洗涤,min观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色若不变色则证明蒸馏器内部已洗涤干净。下移锥形瓶使硼酸液面离开冷凝管口约cm继续通蒸汽min。最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口排废开始。用右手轻提样品杯中棒状玻塞使水流入反应室的同时立即用左手关闭夹子盖好玻塞。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中再在样品杯中加入体积蒸馏水如此反复三次既可排尽废液及洗涤液。打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪~min可进行下一次蒸馏。()样品及空白的蒸馏取个mL锥形瓶分别加入硼酸mL混合指示剂滴溶液呈紫红色用表面皿覆盖备用。把消化管中的消化液全部转移到样品杯中用约mL蒸馏水冲洗消化管重复次把洗涤液都倒入样品杯中打开样品杯的棒状玻塞将样品放入反应室用少量蒸馏水冲洗样品杯后也使之流入反应室盖上玻塞并在样品杯中加约体积的蒸馏水进行水封。而后将装有硼酸指示剂的锥形瓶放在冷凝管口下方打开存放碱液杯下端的夹子放mL氢氧化钠溶液于反应室后立即上提锥形瓶使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。反应液沸腾后指示剂混合液由紫红色变为绿色自变色时开始计时蒸馏锥形瓶中的硼酸,min。移动锥形瓶使硼酸液面离开约cm并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面继续蒸馏min用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端尖嘴将锥形瓶取出用表面皿覆盖以待滴定。排液和洗涤等操作与前面相同。排废洗涤后可进行下一个样品的蒸馏(每一个样品要同时做三份以求得准确结果)。待样品和空白消化液蒸馏完毕后同时进行滴定。(五)滴定全部蒸馏完毕后用molL标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量直至硼酸指示剂混合液由绿色变回淡葡萄紫色即为滴定终点记录所耗HCl溶液量。五、计算样品的总氮含量()=(AB)××××C若测定的样品含氮部分只是蛋白质(如血清)则:样品中的蛋白质含量()=(A,B)×××××CA,滴定样品用去的盐酸体积(mL)B,滴定空白用去的盐酸体积(mL)C,称量样品的量(g),盐酸的摩尔浓度(molL),氮原子量,系数(mLmolL盐酸相当于mg氮)。若样品中除有蛋白质外尚有其它含氮物质则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先需向样品中加入三氯乙酸使其最终浓度为然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量得出非蛋白氮量从而计算出蛋白氮再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮,非蛋白氮粗蛋白质含量()=蛋白氮×

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