从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记 蛋白质纯化经典技术资料

从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记 蛋白质纯化经典技术资料 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记 Royluo 引子 2000年5月6日,我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书,书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。这本书很奇怪,里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到,这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。这本书深深的吸引了我,因为里面 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 的实验十分经典,涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段,并且对实验细节有十分详尽的解释。我对这本书爱不释手,于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法,没有想到的是,五年以后这个想法竟然实现了。 这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结,一部分是八卦,一部分是流水账般的记叙,还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。想到哪说到哪,文字挺松散的,见笑了。 我来解释一下标题。课程结束之后,每一个学员都有一份证书,印着Per Pura Ad Astra 几个大字。这是拉丁语,直译就是“从纯化到星辰”。原始的谚语是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering torenown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是,做好蛋白质纯化,以后就容易出人头地。呵呵。 :二:同学和老师 冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久,从1989年开始每年都开课,到今年是第十六次。每年都是四月初开始,持续两个星期。值得一提的是,冷泉港有相当多的培训班和会议,是一个科学家交流和学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。 2004年底, 我下定决心上这门课,于是递交了申请。二月份的时候的到消息,我 1 被录取了,并且还有1000刀的tuition waiver。可我还是高兴不起来,因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。老板人很nice,但是他实在没钱了,所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了,去年的退税就这样全搭进去了, 欲哭无泪啊。 四月五号下午我赶到冷泉港,办完登记手续后被告知晚上七点全体开会,与教员和同学见面。老师一共有四个,每人负责一个模块的实验,持续三天时间, 每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一共有16个,分成四组,轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自colorado Boulder 的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlotte,是个博士生,做植物的。 现在开始八卦一下几个老师,^_^ 总负责人是来自wisconsin-madison的Richard Burgess教授, 这老头很有意思,带这个培训班已经带了十二年了,到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后,watson似乎跟他关系很好,每年纯化课的时候,watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天,同时拉他去吃饭什么的。后来的有一天,我还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是,watson此人相当精神,走路象年轻人。watson此人口碑很不好,很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认,watson有时候口无遮拦,让他都觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持,很提拔,这几年又尽心尽力为冷泉港筹 款,贡献巨大。 第二位教员是来自UCLA 的Albert Courey 教授。这位教授人很nice也很幽默,四位老师中我对他印象 最好。申请这个课前,我先跟他发过e-mail 询问这个课的情况,而他也鼓励我申请。这老哥研究果蝇的, 但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解,后来问他的学术经历,才明白是怎么回事。原来这老哥博士是做生化,博后跟的是robert Tjian :钱泽南:,还是做生化,研究转录因子。后来做了faculty之后,决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学,完全靠自学和到处问人。我知道后觉得特佩服,真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了,应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的,但是却很能跟上年轻人的潮流,比如他说他有一个 2 ipod mini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子,因为我也有个ipod。 第三位教员是来自Texas MD anderson cancer center的sue-hwa lin教授。她是一个身材瘦小的中年妇女,台湾人,特搞笑,非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的, 有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想,然后一本正经的说,和人产生矛盾了,一般有三种选择。第一种呢,就是既然你恨他,那就杀了他好了。那个学生听了之后,差点倒了。这个老兄说看起来你丫没这胆量,那还有第二种选择,就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一看乐了,然后说你既然没种杀人或者自杀,就剩第三种选择 了, 就是ignore that guy!!!哈。还有另一个笑话,sue-hwa lin的 博士后老板虽然当了老板,但是还是喜欢做实验,并且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说,XXX呀,你把bench弄得太乱了,赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒,而是慢条斯理的辩解说,每个人都有自己喜欢的工作方式,我喜欢乱,你丫管我呢,要是不喜欢,我们可以在bench上画条线划清界线,从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。 第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov副教授,这老兄是俄罗斯人,这四位老师中最年轻的一位。此君满头乱发,一脸大胡子,看起来很邋遢,所以一开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞,有一次他做 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ,他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹,其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一个老美,老美说也注意到了,认为实在是很sad,呵呵。另外,他有两个未成年的儿子,喜欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后,他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深,可见一斑。 :三: 不溶的sigma32 3 四月六号早上,我们开始了第一模块的实验,Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体,只有合成RNA的活性,却没有识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合,从而实现转录。我们这个实验 的核心主角就是其中一个因子,叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32过表达在大肠杆菌里面的时候,绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性 剂溶解变性不溶的蛋白,然后做重折叠。 所有的buffer几乎都已经配好了,所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白,inclusion body 相当稳定,不溶于triton,所以这一步,绝大部分垃圾就被去掉了。 下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢,Burgess教授提到了 sarkosyl。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸钠:是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是,虽然在高浓度下有变性作用,低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。 Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl:盐酸胍)来变性,作为对比。inclusion body 在这两种变性剂下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂,做重折叠。怎么做呢,方法有很多种,最简单的是透析,把变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢,因为,透析是个缓慢的过程。在透析袋里面,蛋白的浓度还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白,由于蛋白浓度相对与透析低了很多,好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放一大烧杯的缓冲液,里面有一个磁石可以不断混合液体,然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的,所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的还真象那么回事,可事实上,嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl 4 溶解的Sigma32。一开始还好,滴到后来,溶液就变浑浊了,最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看,说不应该这样的。我们一离心,沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换柱,拿到的蛋白很少,回收率小于5%。失败啊。 从这里开始,我要岔开一下,讲一些跟这个模块实验没太大关系,但是很有意思的东西。 :四:Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick Dr. Burgess 假定我们对蛋白质纯化一无所知,所以讲得很细致。比如他特别提到了disposable column的用法。这种小柱子很简单,把beads倒进去,冲洗一下就可以用来纯化蛋白了,很方便。唯一的问题是,由于是依靠重力跑,速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrostatic pressure(静流体压力:来决定。而hydrostatic pressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决定。如果你嫌液体流得太慢:尤其是洗柱子的时候:,可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管,这样速 度会快很多。这是很简单的小trick, 但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。 我知道一个例子。我原来很喜欢女生A, 有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验,就开车送她回家。这一等不得了,从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中,她好像没什么事情,但是每隔20分钟,她就会去一次cold room。作完实验了之后,我好奇的问她,到底是什么试验花了这么长时间,结果她说她在用一个disposable column纯化蛋白,由于beads 稍微多了一点,速度很慢,而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液,所以白白花了好几个小时。我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她, 有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出口加一个长管子,她至少可以少等两个小时。 5 当然最简单的办法还不是这个,最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高,然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。同时,柱子的下端连上塑胶管,弯成一个连通器,这个连通器的高度应该略高于柱面,这样冲洗结束后,柱子就不会干。如果用这种方法,A就不用在实验室待一晚上了,因为一切都是自动完成的。 我现在跟A已经完全没有来往了, 但我对她映象还是十分深刻,主要就是因为她那晚跑柱子的经历。话撤远了,现在再回到蛋百质纯化课。 :五:"万金油"buffer Dr. Burgess 这人特有意思,喜欢吹嘘他发现的小trick。比如,他得意说他是全美国最早用coomassie blue染蛋白胶的人。据他说,六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些,结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。 不过Burgess最自豪的,还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说,他几十年了,总喜欢用这个buffer的配方,什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神乎其神,配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的: 50mM Tris pH 7.9 0.5mM EDTA 50mM NaCl 5% glycerol Tris EDTA NaCl 这三样都没什么,真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很多蛋白,尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。六十年代的时候,他还是个小博士后,在watson 实验室里干,主要是纯化细菌RNA polymerase的各个亚基。那时候一个大 6 问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放冰上, 过30分钟,活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误,把纯化出来的RNA polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现,RNA polymerase 变得十分十分的稳定。稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol,用平信从美国寄十几天到澳洲,活性还有7~80%,另外Burgess也提到,如果要保存的蛋白有二硫键,加一点DTT,防止蛋白形成非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。 为了让我们对这个 "万金油"buffer的好处有感性认识, Burgess 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了一个实验让我们做。他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成两部分,一部分用guanidinium hydrochloride:盐酸胍:溶解变性,另一部分用sarkosyl (N十二烷基肌氨酸钠:溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升,然后加入,,倍的 refolding buffer 来稀释,稀释了之后,变性的GFP就开始重折叠。我们有一个hampton 卖的refolding 试剂盒,内有十几种不同配方的refolding solution。我们试了所有这些buffer 同时还试了 TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45% glycerol,这四种buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光,用一个fluorescence plater reader,我们可以实时监控折叠的效果。结果让人很吃惊,Hamton卖的这个试剂盒,虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂,没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下,TGE的四种溶液都很好,GFP重折叠的效率是hampton kit的几十倍。最强的是TGE+35% glycerol。 另外,不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性,TGE+glycerol 的重折叠的效果都很好。实验结果出来后,看着我们惊讶的表情,Burgess脸上都笑开花了,呵呵。这个实验我还学到的一个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛,但并不一定真的好用。 :六:兴风作浪的乳糖(lactose) 7 晚上每天都有人做报告,我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的,但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的,我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory 的,一生研究T7 噬菌体,也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列质粒)的发明者。 T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了,但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说,pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase 识别,而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达,就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大,原因 在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率,效率高到什么地步呢,就是表达一个蛋白,表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%! 大家可以想象,这种系统虽然很强大,但是表达量太大,对大肠杆菌有毒性,造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。 这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是,用质粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化,铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性,仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次,最后终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首,但是我没有仔细想过本底是怎么 来的。 这个问题到了bill studier做报告之后,才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分,其中一种是tryptone. Tryptone是caseine的酶解产物,而casein又是 8 milk里提取而来。由于milk 有乳糖(lactose),tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此,,, 所以要解决我原来的那个问题,用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是,细菌有一种很有意思的特点,如果培养基里有足量的glucose,细菌会优先摄取glucose,而不能摄取lactose。Bill studier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose 和 lactose。细菌首先摄取glucose,不摄取lactose,当细菌长到一定密度,耗完glucose之后,就开始摄取lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌,很省事,接种了第二天收细菌,提蛋白就行了。 最后Bill studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈, 如果有足够氧气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!要提高培养瓶的供氧,可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状),能有效增加空气培养基的混合。 最后,详细内容可以见下列文献: Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005) :七:古怪的CDC6 这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子,一个很夸张的例子,但是很有启发性。 Bruce Stillman 是冷泉港的现任主管,是一个绝对的牛人。不但科学做得很好,而且还很爱国。他是澳洲人,在美国待了N年,却从没有加入美国国籍,所以他只是外籍院士。我们的晚间报告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领域。在报告里面,他特别 9 提到了表达纯化CDC6蛋白的经历,我觉得十分有意思。这个蛋白, 用他的话说,是"a pain in the ass"。 CDC6是干什么的呢,这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点 (replication origin),ORC(Origin Replication Complex)是一个很大的蛋白复合体,可以识别这些复制起始位点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面,CDC6这个蛋白会与ORC结合,同时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上,形成一个prereplication protein complex。这个complex一旦形成,DNA 复制的准备工作就完成,只等其他kinase的激活,细胞从G1进入S期,复制就开始。 Stillman 实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白,然后做结构研究。但是到了CDC6,他们碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达,但是意外的是,他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶,重折叠也没有用。然后他们尝试在室温下诱导表达,发现蛋白虽然可溶了,但是都被降解了。然后呢,他们就想到了加一个GST tag,这下好了,蛋白也可溶了,也不被降解了,但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成dimer,干扰CDC6的正常功能。所以呢,他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候,意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的,可是一旦把GST切掉了,CDC就沉淀出来了....@#%#^&%$^#!!! 几乎是山穷水尽了,但是做这个project的博士后还是没有放弃希望,他做了最后的孤注一掷。他猜到这个蛋白可能很不稳定,对缓冲液要求可能很高,所以他让一个本科生连续试了十多种buffer,最后发现如果用磷酸钾,谷氨酸钾缓冲液,切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。Stillman认为谷氨酸根和磷酸根跟氯离子相比更接近与核酸, 可能让CDC6更稳定。这个CDC6一共花了他们18个月时间, 却就这一点小trick! 10 这以后,他们表达的CDC6都有活性了,后来做了一系列的电镜三维结构重构实验,研究CDC6和ORC的复合体结构。Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。大家等着看把。 :八:”液体DEAE“ 绕了这么大一圈,现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们 试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠,结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做 变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似,只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果好了很多,至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50,一种阳离子交换柱,来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离 子交换柱呢,因为sarkosyl带负电,会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32 很奇怪,既有负电的表面,又有带正电的表面,所以可以用阳离子交换柱。值得一提的是绝大部分蛋白质都是偏酸性,所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。 好了,聊完离子交换柱,现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。 Sigma32在大肠杆菌过表达的时候,绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分 是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形 成复合体。我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。核心办法是用免疫亲合柱来纯化。但是为了提高纯化的效果,Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。PEI 是什么呢,就是polyethyleneimine :聚乙烯亚胺:。这个东东我过去没碰到,所以很感兴趣。PEI呢是一个带正电的polymer,和酸性蛋白质和核酸结合 11 以后聚合体沉淀出来。由于这种结合是受离子强度影响的,感觉上很象DEAE那之类的性质,所以Burgess称之为"液体DEAE"。RNA polymerase和DNA是结合的,所以PEI沉淀DNA的同时,把RNA polymerase+sigma32都沉淀了下来。然后再用高盐洗脱蛋白质,而DNA和PEI结合很紧密,所以还是在沉淀里面。这样一来,好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了这一步,还有一个问题。就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI,如果现在就用透析的办法降低盐浓度,PEI和蛋白会重新形成沉淀。所以下一步就是用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。用低盐buffer重溶沉淀的蛋白,过免疫亲合柱就行了。免疫亲合柱就没有什么好说的了。最后结果很不错,跑胶后用coomassie blue 就可以清楚的看到RNA polymerase的各个亚基。 :九: 沉淀,沉淀,沉淀 上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀来去掉PEI(Polyethyleneimine:的步骤。不常做生化的同学可能对硫酸氨沉淀的方法不熟悉。但其实这种沉淀是蛋白质纯化中及其重要的一种方法。说实话我过去也很少接触,但是在这个课里面,四组实验中有 三个都用到了这个方法,可见其重要性。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢,其实很简单,把磨细了的硫酸氨粉末往样品溶液里 倒就行了,蛋白就会相继沉淀下来。由于不同的蛋白,在不同的硫酸氨浓度下被分 别沉淀下来,这种方法把蛋白质样品粗粗的分离一下。这种方法对大量样品尤其好 用,因为比较方便快捷便宜。硫酸氨沉淀的优点是什么呢,最大的优点是这东西虽 然能让蛋白质沉淀下来,但是不会让蛋白质变性,所以沉淀下来的蛋白质一般可以 重新溶解。 其实沉淀蛋白质的方法有很多种,但是对于娇贵的蛋白质来说,很多常用方法 都太harsh了。我举两个例子把:TCA沉淀大家都熟悉的。TCA是个强酸,施放出 12 来的质子中和了蛋白质的负电荷,只留下正电荷与TCA形成不溶物,从而变性。 丙酮沉淀,通过改变介电常数来降低蛋白质的溶解度,从而沉淀,由于丙酮一类的 有机溶剂可以与蛋白质的疏水表面相互作用,所以沉淀的同时,蛋白质也会变性。 硫酸氨沉淀的机理是什么呢,简而言之就是盐析:salt out:。蛋白质在溶液里 面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下,如果增加盐浓度,会增强蛋白质的溶解,这是因为,盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对,减少了蛋白质电荷表面相互作用的机会。当盐浓度高到一定程度的时候,过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子,以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。 硫酸氨如果运用的好可以帮很大的忙。Dr. Burgess讲过一个例子。他有一年去 一个公司做sabbatical。这个公司是做单抗的,有一个工序是要从ascites fluids 里 头把抗体给纯化出来。这个公司用硫酸氨沉淀的方法来粗分蛋白。Burgess很惊讶的发现,这个公司竟然没有做仔细的分析,就随便用了一个很高的硫酸氨浓度,结果把抗体和serum albumin一起沉淀了。但是其实可以用一个低一点的浓度,只把serum albumin沉淀下来,从而把抗体和serum albumin分开。Serum albumin浓度是非常高的了,这样一分,大大提高了后续纯化步骤的效率。 Dr. Burgess强调说,用什么浓度把什么蛋白沉淀下来,完全是经验性的,而且每 次都不一定能重复的。因为是否能沉淀下来跟蛋白质浓度有关系,而每次样品内目标蛋白的浓度不一定一样。有一个很简单的方法可以用来估计蛋白质沉淀所需硫酸氨的浓度。把样品分成五份,每份分别加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 离心去掉沉淀,保留上清,再向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%, 30%到40%, 40%到50%, 50%到60%, 60%到70%,离心保留沉淀,然后分析沉淀里的蛋白, 看看目标蛋白到底在 哪里,就完事了。 13 :十: 永远的转录因子 第一个模块的实验结束以后,我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫Al Courey。这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP1是一种很重要的sequence specific转录因子,在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质,实际上一种二聚体结构,要么 是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun和Fos都是alpha helix的结构。Helix的一边有很多Leu,和另一个helix形成Leucine Zipper的结构,而helix另一边就是碱性的氨基酸居多,所以可以和DNA 结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。 sequence specific转录因子是极其重要的一类蛋白质,真核生物的基因有5~10%是用来编码这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法,所以很有用。 怎么才能分离纯化呢,首先要确定要纯化什么因子,换句话说就是要决定纯化跟什么特异DNA序列相结合的转录因子。决定了这个,才能有一个活性检测系统,才能真正开始纯化。另外就是,可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上,然后做亲合层析,纯化效率会非常高。 整个纯化过程是这样的:首先制备Hela细胞的核提取物,然后用硫酸氨沉淀的办法粗分一下组分,小分子量蛋白(比如Histone H1) 因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍。然后粗分的产物再跑一下凝胶过滤层析,比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再过DNA affinity column, 比活力从5-10倍一下子提到了50~100倍。到了这一步,AP-1可以占到蛋白量的 10~50%。 值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是Sephacryl S-300 HR 凝胶(一种聚 丙烯酰胺凝胶),这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa,但是这种凝胶是比较粗的一种介质,分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细,所以可以自己手工装柱,我们用的柱子是Amersham的XK26/40(直径2.6cm, 高度40cm:。装好的柱子分辨率真的是很低,AP1的洗脱体积跟空体积(void volume:相差挺小,而AP-1只有40~50KD已经很小了。这样一来很多蛋白根本没可能和 14 AP-1分开,这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来,为什么要自找麻 烦做这又贵又麻烦的一步呢,原因在于这一步可以去掉核提取物里面的核酸酶,所以如果直接跑DNA affinity column, column上的DNA Oligos会被降解掉,另外一个原因是,核提取物有一些可以和DNA非特异结合的蛋白,这些蛋白会饱和DNA affinity column,影响要转录因子的纯化。 这个纯化步骤说明,不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。 :十一:核抽提物 上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备 也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白,如果大概知道蛋白在什么细胞器官,把 细胞器先分离出来作为纯化的起始原料,可以省好多事情。因为细胞器官的分离的 方法已经很成熟了。 核抽提物是怎么准备的呢,首先,融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不 是自己长的,而是直接从一个公司Biovest 买来的。据说这个公司有NIH的补贴, 所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要,,刀。冻存在-80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面,第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用 一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低,所以由于渗透压的影响, hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢,把重悬的细胞用Dounce 匀浆器处理一 下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低,但也不是没有盐在里面。主要 15 有两种成分,一个是10mM KCl ,另一个是 1.5mM MgCl2。KCl没有什么好说的, 可以换成NaCl。MgCl2 就关键多了。镁离子可以稳定细胞核, 让细胞核不至于在破 碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说,一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出来。细胞膜破碎之后,细胞核还是基本完整的,细胞质里面ER , Golgi之类的东东都漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的,所以一离心,马上就沉淀下来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些,还留在上清里面。 现在想起来,细胞器官的分离,几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离 的。细胞核是最好分离的了,因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器,比如要把Golgi和ER分开,是个十分麻烦的事情,因为比重相差太小了。有些时候,可以用一些古怪的办法来分离。比如lysosome把,比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合物,就积累在肝脏细胞的lysosome里面,使得lysosome比重变轻了一些,这样就可以把lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了,现在再回到AP-1purification。 细胞核虽然被沉淀下来了,但里面还有很多染色质,如果DNA都降解漏出来,麻烦就大了。所以下一步就是用高盐buffer(0.42M KCl)来破碎细胞核。核膜,染色质之类的垃圾不能溶解,转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心,取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。按理说,到这一步就可以上柱子了,但是这种上清溶液里面还有不少histone H1,可以抑制体外转录反应。为了祛除hisone, 我们又做了一步硫酸氨沉淀,histone由于太小,沉淀不下来,而转录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。 :十二:Gel filtration的先天缺陷 16 上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。 这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography), 我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈 原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢,并不是 实心的,而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候,如果蛋白质分 子体积太大,不能通过微珠的孔状结构,就会绕过微珠,很快的被洗脱下来。如果 蛋白质分子体积不是那么大,可以通过微珠的孔状结构,就会迟一些被洗脱下来。 这样,蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。 Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是:Gel filtration 并不依赖 蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是,所有的蛋白样品 最后都能被洗脱下来,柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gel filtration带来了一个严重的缺陷:低分辨率。分辨率包括两个因素,一个是两个蛋白峰的距离,另一个是,蛋白峰的宽度。由于蛋白在gel filtration column里面并不与柱材料相互结合,所以很容易扩散(diffusion),扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命,很多时候即使用了很好的柱子,蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽,重叠在一起,这样就很难分干净。另外,两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈线性关系,所以可以想见,如果分子量相近:比如只差两三倍:的话,洗脱位置也会相近,Gel filtration是很难把两个蛋白完全分开的。 说一件我的糗事。有一次一个师妹遇到了一个难题,表达一个GST-tagged的蛋白 有一个降解产物。她想要的蛋白50kD,而那个降解的产物有30KD。她问我该怎么分开。我没仔细想,就告诉她用Gel filtration。现在想起来,这实在是个昏招。当然,欣慰的是,该师妹最终没有试gel filtration, 用别的方法解决了这个问题。:-) 17 如果要想蛋白峰宽度变窄一点,怎么办呢,就样品而言,体积越小越好,理想状况是小于柱体积的,,。就柱子的材料而言,最主要的就是得把微珠做小一些,这样空体积就会小一些,扩散就不会那么严重。另外柱子里的微珠大小均匀一些也会有帮助。这种改进带来的一个问题就是,需要用FPLC之类的设备提供较高的压力, 柱子才跑得动。另外分辨率好的柱子往往不能手工装,得买预装的柱子,这样就很贵:很贵很贵,,,:。 唠叨了一大堆,我想表达的一个中心意思就是:如果你想从一个蛋白质混合物很干 净的把一个蛋白纯化出来,Gel filtration是肯定没戏的。虽然gel filtration 不能很精细的纯化蛋白,但是它还有另两个非常重要的用途。一个是脱盐,另一个是确定蛋白大小。这两个用途是其他种类的色谱没法作到的。 :十三:装柱子的学问。 上篇提到了Gel filtration的基本原理,现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham 的 XK26/40的空柱子,然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说,要提高分辨率,柱子应该是越长越细才好,这种柱子虽然不短,但是挺粗的。但是一个好处就是,样品体积可以大一些。 装柱子本身就是一件很tricky的事情,以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装柱子。我们这一组人中,我负责装柱子。一开始就是洗resin了,用粗制烧结玻板过滤的漏斗来洗,感觉这方法还挺快的。洗完了,就把resin重悬成50%的slurry,然后就是往柱子里头倒了。但是呢,有一个小窍门,就是必须先封闭柱子的下出口,往柱子里面倒10%体积的buffer。我过去装柱子犯傻,不知道要这么做,结果发现下面的resin 不均匀不说,还有一大堆气泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流,这样可以尽可能的避免气泡。然后就是等了,等resin 沉降,,分钟后,就可以打开柱子的下出液口,让多余的缓冲液 18 流出去。液面低到靠近柱面的时候呢,就可以把上端液流接头接到柱子上方。这个过程最麻烦了,主要是不能引入气泡,所以先得让这个接头装置里面充满缓冲夜,把气泡赶出来。我第一次做没经验,费了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕动泵(peristaltic pump) 加压,让resin继续紧缩一下。随着柱面的下降,接头装置还得不断往下移动,使得接头刚刚好与柱面接触。接触不紧密的话,等于是冲淡了样品,分辨率会降低。 柱子装好了,但还不能开始跑样品。为什么呢,因为这种柱子的质量必须很好才能起到分离蛋白的效果,否则是根本没法work的。所以呢,首先得测试这个柱子是否真的装好了。测试过程很简单,就是跑一下蓝色葡聚糖(blue dextran),蓝色葡聚糖是带有蓝色染料的多糖高分子聚合体,体积非常大,所以在空体积(void volume)就会洗脱出来。跑蓝色葡聚糖可以起到三个目的。第一个就是确定void volume,知道这个空体积是很重要的。因为每次装柱子,实际resin的总体积都会有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脱体积与空体积的比值是一定的,所以只要知道了空体积,就能知道蛋白大概会在什么时候洗脱出来。第二个就是确定样品会被稀释多少。第三个呢,是柱子是否装的均匀。如果装的不均匀,葡聚糖j就会跑得形状怪异。一般来说呢,柱子下端堆积会比上端均匀,为了分辨度好,应该从更均匀的一端上样。所以我们在做的时候,是从下端上样的。 忙活了半天,当所有装置都装好的时候,感觉还是挺兴奋的。首先是蠕动泵,然后是柱子,然后是UV monitor加记录仪。整套装置不贵,功能却很齐全。 :十四:anfinsen的疑虑 跑完sephacryl柱子,组分就可以过DNA affinity column。 DNA affinity column虽然很重要,但是这一步技术上来说要求很低。买来CNBR活化好的agarose,然后让特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了,柱子也是最简单便宜的一次性柱子。 19 亲合层析是目前最常用也最强大的一种蛋白质纯化技术, 纯化效率比别的层析方法可以高出一两个数量级。这种方法诞生是六十年代的事情。当时是在NIH的Anfinsen实验室。Anfinsen是一个诺贝尔奖获得者,可以说是蛋白质折叠研究的老祖宗。他主要贡献是通过研究ribonuclease 的变性和重折叠证明氨基酸序列就可以决定蛋白质最后的三维结构。他实验室那时侯有一个学生一个project是从葡萄球菌里面提取大量核酸酶,然后研究enzyme/inhibitor interaction。这个纯化可是很麻烦的事情,用gel filtration, ionexchange, hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能会问,怎么不在E.Coli表达his-tag重组蛋白,然后用 Ni- beads纯化啊,答案很简单,那个时候根本没有molecular cloning 这些技术,也没Nibeads这些东西,Nibeads也是亲合层析的一种,是好多年以后才发明的。这个学生有一天突发奇想,既然inhibitor可以与enzyme结合,为什么不能把inhibitor 固定在beads上面,然后用来纯化蛋白呢,后来他试了一把,结果非常成功。搞笑的是,anfinsen自己很怀疑这个技术是否能work, 勉强答应把自己名字署在在那个学生的文章,还强调如果没有别人能重复,自己心就是悬着的。呵呵。从此以后,各种各样的亲合层析层出不穷,成为生物实验室蛋白质纯化的最主要工具。 八卦完历史,现在介绍一下亲合层析的种类。通用的亲合层析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和 IAC(Immunological Affinity Chromatography)。这些东东 大家应该都熟,类似于Ni beads , proteinA beads 之类的东西, 几乎所有人都会用到。需要动点脑筋的是一些利用特定蛋白质特定性质的亲合层析。比如我们实验室研究的糖基转移酶把,有两个反应底物,一个是nucleotide-sugar,另一个是一个小蛋白质 EGF repeats。 由于这个酶与两个底物都有结合, 所以可以把这两种底物分别结合在beads上,然后跑两次亲合层析。AP-1的纯化呢,则是利用了转录因子与DNA序列的特异结合。所以呢,在做亲合层析之前,一定要根据蛋白质本身的特点来选择相应的ligand。决定了ligand之后呢,就得考虑怎么把ligand偶连在beads上了。 CNBr活化是最常用的一个方法。原理很简单,CNBr的碳对beads上的羟基发起亲电进攻,产生一种叫cyclic imido carbonate的中间产物, 蛋白质或者核酸的伯胺基 20 团(primary amine , -NH2) 与其发生反应, 形成共价键联在beads上。 蛋白质的primary amine主要来自于lysine, 如果要偶连的蛋白没有lysine用这种偶连方法就不好。DNA的primary amine来自于AGC三种碱基。DNA是双链互补的结构,碱基上的primary amine都要形成氢键。所以呢,要想把DNA oligo固定好,必须 得有不配对的overhang才行。这是一个小窍门,但是给我们的一个启示是,要做好affinity resin, 了解一些基本的偶连方法的化学原理是很有用的。 :十五:AP1的活性测定 第二个模块的实验,DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的 Gel filtration,用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出来的组分,我们都测试了AP1的活性。方法呢就只有两种,一种是凝胶迁移率变动分析(EMSA),另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay),都可以用来分析蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验,所以感觉很新奇,做的也格外卖 力,结果也还不错。 Gel Mobility-shift assay 原理很简单,把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针 一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了,速度会变慢很多,就会停滞在胶的上段;如果没有结合上,探针就会自由的跑到胶的下段去。然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置块头挺大的,是用来跑DNA测序胶的装置。把两大块玻璃板和两片spacer夹起来之后, instructor先做一个gel plug,就是配少量gel溶液,然后加过量的TEMED,然后迅速加到玻璃板中间,这些胶还没漏完就会凝固,所以会封住底端。这是一个小窍门,据instructor 讲,这个方法虽然很粗糙,但是比其他任何封底的办法都管用。还有一个小窍门。是这样的,由于胶的浓度低,比较脆弱,另外尺寸比较大。跑完如果把 21 一块玻璃板从胶上拿开的话,胶的某些部分会分别粘在两个玻璃板上,这样取胶的时候就很容易把整个胶弄破。我们做胶的时候,指导老师要我们把一块玻璃板的贴着胶的一面硅化:用sigmacote, 成分是氯化有机硅氧烷) 一下,使得这一面比较疏水,就不会与胶粘在一起了。这样打开胶夹层的时候,胶只会紧紧贴在一面玻璃上面,把胶和这整块玻璃拿去放射自显影就行了。生物实验要想令人心服口服,没有对照是不行的。EMSA也不例外。阳性对照很简单,是看看系统能不能work。关键是阴性对照,来看蛋白质与探针的结合是否特异。EMSA的阴性对照有两种,一种呢,是用来看和探针的结合的蛋白是不是特异的某一种蛋白。做法很简单,就是蛋白质和探针孵育的同时加入抗那种蛋白的抗体,抗体识别蛋白质之后会形成更大的protein complex,在胶看起来就是探针的迁移率进一步降低了。这叫"supershift"。另一种对照呢,是看蛋白质与探针的结合是不是与探针序列有关,因为如果是非特异性的结合,纯化就没有意义了。这种对照也很简单,在蛋白质与探针孵育的同时,加入没有同位素标记的探针来竞争。如果加入完全同序列的竞争DNA可以削弱protein-DNA interaction, 一两个nucleotide不一样就无法削弱的话, 说明看到的探针与蛋白质的结合是跟探针序列紧密相关的。 我们在实验中用了 第二种control, 效果挺惊人,仅仅是两个nucleotide和探针不一样,竞争DNA探针就没 法work了。 Gel Mobility-shift assay虽然能够证明一段Oligos是否能和蛋白质结合,却还是不 能告诉我们该蛋白质到底与哪一小段的序列直接接触。 DNAase I footprinting assay 正是用来解决这个问题的。DNase I 可以随机的分解DNA,正常情况下,一段DNA探针各处被酶切的可能性大致相当,如果跑胶再做放射自显影的话,看到的会是DNA ladder一样的东西。但是,如果有蛋白与特定区域相结合,DNase I无法酶切那一部分,我们看到的ladder 就会空缺一部分。这样我们可以知道那一部分没有被切到。这个实验步骤其实不复杂,但是有些tricky,实验的关键是DNase I 的用量和酶切时间。首先是做同位素标记探针的stock solution。stock solution里面除了探针以外,还加了非特异DNA,类似于poly(dI-dC) poly(dA-dT)之类的东西。有一种成分引起了我的注意,聚乙烯醇(poly- 22 vinyl alcohol)。 这东东比较粘稠,为什么要加它呢,大家想想看,用来做 DNAase I footprinting assay 的样品都是通过跑柱子的fractions,转录因子必定是被稀释得很厉害的。足迹实验最关键的就是要保证样品蛋白和探针有充分的结合。聚乙烯醇性质就象一个"分子海绵",占溶液体积不说,还跟蛋白质抢夺水分子,所以加入这个东东之后呢,蛋白质和探针的有效浓度都增大了,这样有利于蛋白质和探针的相互结合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似,第三个模块的实验里面会用到PEG沉淀。探针stock solution配好之后,就是加我们纯化出来的组分,孵育十几分钟。之后呢就是做DNAse I 酶切。我们这一组里,我和丹麦女生负责做酶切,这个酶切可是把我们忙坏了。为什么呢,酶切一共有三步,间隔时间很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分钟, 第二步是加DNase I 孵育一分钟, 第三步是加反应中止液。我们是三个三个一做, 每20秒加一个样品, 这样三分钟三个样品都完成了。丹麦女孩计时,然后我加样品。可能是太紧张了把,我们连犯了两次错误,漏加了Ca/Mg,只得重做几个样品。最后看结果的时候,我还特紧张,因为这是很重要的一份试验数据,最后结果很不 错,还受了老师表扬,呵呵。 好了,第二模块的实验,到这里就差不多了。这个培训课两星期的课程也进行了一 半。全体成员放假一天休息,而放假前一天晚上也没有报告。我学校离CSH很近,索性晚上就溜回去了,顺便还把YL硬拉出来听我汇报学习心得,呵呵。 :十六:浮起来的细胞膜 休息了一整天,晚上全体学员和老师去一家sushi店饱餐了一顿生鱼片。第二天 早上,第三个模块的实验开始了。老师是Sue-Hwa Lin, 这一个模块是从大鼠肝脏 23 里面提取胰岛素受体并且做一些鉴定。四个模块的实验之中,我最喜欢这个模块。主要是因为这是唯一一个设计膜蛋白纯化的实验,而膜蛋白纯化是所有蛋白质纯化中最麻烦的一类。受体蛋白纯化尤其麻烦,往往可能找不到又快又准确的测活办法。胰岛素受体即使溶解在去垢剂里面也能与胰岛素接合,所以用简单的binding assay就可以测活了。相比之下有些受体就不那么好伺侯了,比如我研究的Notch受体,配体也是膜蛋白,Notch和配体必须都簇集在细胞表面或者固体表面才能有接合,溶液中的游离状态下根本没法相互作用。 Sue-Hwa Lin是一个好老师,喜欢在做实验之前详细给我们讲解背景知识,这一 点上她比其他三位老师都做得好。另外她的助手是一位台湾的中年妇女,在Sue-Hwa 实验室做research assistant professor。这位助手特别nice,给我帮助很大。 好了,现在聊一聊纯化的实验步骤。首先是把大鼠肝脏的质膜部分分离出来,然 后呢用去垢剂溶解一下,用凝集素层析来粗分一下组分,然后做受体测活与鉴定。大家可能注意到,最后纯化出来的受体只是粗产品。事实上,手册上这个实验里面还得做一步insulin affinity chromatography来精制一下的。但是最近好多年,很多学员更希望做一些重组蛋白纯化的实验,所以就把原来的实验给切短了。我觉得这种做法很不明智,因为重组蛋白纯化的实验实在不需要花几千刀来冷泉港学的。 细胞膜结构的分离是一门大学问,著名的Methods in Enzymology有专门的一辑 整本都是讲这个的。细胞膜结构主要有核膜,质膜,线粒体,内质网,高尔基体,溶酶体等等。其中核膜是最容易的,因为细胞核很重,稍微离心一下,就沉淀下来了。其它的膜结构中呢,线粒体是最重的,质膜由于有胆固醇成分,所以是最轻的。这两种膜结构也是很好分开的。剩下的膜结构比重比较相似,所以不好分。 膜结构分离的方法呢,有很多种,但是变来变去,无非都是两种基本方法的组合: 差速离心+蔗糖梯度离心。差速离心:differential centrifugation:是粗分膜结构的 一种常用方法。其实很简单,就是用不同的速度离心三次。首先用等渗缓冲夜来做 24 组织的匀浆,然后就开始离心。第一次是低速离心,只用600g,这么小的离心力下,只有未破的细胞和细胞核才会沉淀下来。细胞主要的膜结构以及细胞质都还在上清里面。拿上清再做第二次离心,这回离心力大了一个数量级,到了8000g。由于线粒体比其它膜结构要重一些,所以线粒体沉淀下来,而其它膜结构还在上清里面。去上清进行第三次离心,这回离心力比前一次又要大一个数量级到了十万g。所有的膜结构都会在此时沉淀下来,所以也包括质膜。需要强调的是,差速离心的分离是非常粗糙的,并不是十分干净。下一步的蔗糖梯度离心就要精细得多。但不管是什么分离方法,本质上都不完美,千万不要指望从某篇文章找到一个方法就能套用。最好的办法是利用细胞膜结构特征性的一些标记物:比如 plasma membrane, 测5' nucleotidase 的活性)来分析分离方法的好坏,并加以改进。 我们分离质膜用的方法稍微特殊一点,省掉了差速离心这一步。这种方法对于分离 大鼠肝脏质膜比较管用,对别的组织就不一定好用了。我们一组四个人,每人都分了一个新鲜冰冻的大鼠肝脏:解冻后很难闻:,然后就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之后就加一种低渗缓冲液,再把碎的肝脏和缓冲液倒到Dounce匀浆器里面做匀浆。匀浆用的缓冲液里面加有Ca2+,比较重要。钙离子能够促进质膜碎片的聚集,这样在1500g这样小的离心力下,质膜也能被沉淀下来。我们把匀浆用两层cheese cloth过滤,去掉了很多结缔组织。然后就是用1500g离心了。拿出离心管一看,果然有一个很松的pellet,包括了质膜,细胞核之类的东西。然后再把pellet转移到Dounce匀浆器再弄均匀了。下面就开始准备蔗糖梯度离心 (sucrose gradient)。蔗糖梯度离心是十分古老的一种方法,但直到现在还有很广泛的应用。我们首先往pellet 匀浆里面加69%的蔗糖溶液,一直到终浓度变为44%为止。蔗糖的浓度十分的重要,如果不准的话,根本就没法分开。我们有一个折射仪,可以很快的测出溶液的折射率以及对应的蔗糖浓度。这个折射仪看起来很粗糙,但是却十分好用。下一步呢,就是把加了蔗糖的匀浆转移到超速离心管里,然后在上层铺一层42.3%的蔗糖溶液,接着就是超速离心两小时:九万g:。前面提到过,质膜相比其他膜结构而言是比较轻的,所以呢,在离心的过程中就会浮到上 25 层来。我们吃罢午饭,就回来看离心管,果然看到一层棕色的东西浮在最上面。这层质膜看起来有点像果冻,可以用小勺舀出来。到这里质膜的分离就算完成了。 :十七:何去何从 上一章提到从大鼠肝脏提取质膜的方法。质膜准备好了,下一步就得考虑怎么溶解质膜。最主要的问题是:用什么去垢剂呢,Dr.Lin在这一步试验里面要求每一组中的四个人各选一种去垢剂来溶解质膜,纯化完之后再比较不同去垢剂的蛋白质纯化效率,看看哪一种去垢剂最有效。选择去垢剂很简单,无非是想让膜蛋白能被充分的溶解解离下来,同时又不使蛋白变性。事实上,纯化膜蛋白时去垢剂的选择是没有规律可循,除了一些显而易见的不适和做纯化的去垢剂(比如SDS)外,很难讲什么去垢剂好什么去垢剂不好。所以,只能具体问题具体分析,一个一个去尝试。我们这一组人选的四种去垢剂分别是: Triton X100, Sodium Cholate, Chaps, 和Octyl glucoside。我选的是Octyl Glucoside。 好了,我先来讲讲去垢剂的小常识。去垢剂其实是很大一门学问,我几年前就花过好多力气来学习其中的一些知识,但到现在为止还是只懂了一些皮毛。这里就权当抛砖引玉了。首先,什么是去垢剂(detergent)呢,就是同时具有疏水和亲水两种基团的化合物。虽然脂类化合物也有类似性质,但是去垢剂能够形成胶束(micelle),所以相比之下非常易于在水中溶解。去垢剂的疏水基团一般是下面三种(1)直链或者支链烷基结构(2)类固醇之类的多元环结构(3)取代苯基结构(比如大家常用的Triton X100或者NP40)。去垢剂的亲水基团一般有(1)羧酸基团,比如胆酸钠(sodium cholate) (2)两性离子基团, 比如CHAPS (3)糖类衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基团, 比如Triton X-100和NP-40。 Triton X100和NP40大家都用得比较多。 它们实际上是同一种去垢剂,疏水基团是取代苯基,而亲水基团是聚乙氧乙醇基团。我想强调的一点是,聚乙氧乙醇基团与氧气很容易发生反应形成过氧化物, 如果用在蛋白质纯化里面,很有可能会破坏蛋白质的活性。 26 所以一般商业化的,比较纯的NP-40和Triton X-100都是小包装,而且在包装瓶子里面充有惰性气体。 选择适当去垢剂来纯化膜蛋白,有一些实际问题必须先想好。我强烈建议大家以后选择和使用去垢剂的时候先考虑以下几个问题: (1)选择的去垢剂是否干扰蛋白质浓度的测定, 类似于Triton X100之类的去垢剂有苯环结构,所以在280nm有很强的吸收。而相比之下CHAPS和胆酸钠之类的去垢剂就没有这个问题。另外,有些去垢剂会严重的干扰一些protein assay。比如常用的Bradford assay,用的是commassie blue G- 250染料。这种染料在酸性条件下呈现为褐色胶体物质,但在与疏水物质结合之后会变得稳定而呈现蓝色。所以可以想见,这种染料不单能染蛋白质,也能染一些去垢剂。我们在实验一开始专门做了测试,发现Triton X100和sodium cholate对Bradford assay 干扰比较严重,chaps, 尤其是Octyl glucoside基本上没有什么干扰。遇到这种干扰问题,要么换去垢剂,要么换protein assay方法。 (2)是否需要在以后的步骤里面去掉或者置换掉去垢剂, 去掉或者置换掉去垢剂是一件很麻烦的事情。因为很多去垢剂会形成胶束结构,分子量非常大,所以没法用简单的透析或者超滤来去掉。比如大家常用的Triton X100和NP40, 单体分子量是628,胶束的单体聚集数是140, 所以胶束的分子量有87KD了,这显然是没有办法用透析来去掉的。相比之下CHAPS单体分子量615,聚集数是10, 胶束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。 (3)是否需要在以后的步骤里面用到离子交换层析或者疏水作用层析, 离子型去垢剂会与相应离子交换柱结合得很好,干扰蛋白质的纯化。所以如果要用到离子交换柱,要用非离子型或者两性离子型的去垢剂。另外,由于去垢剂有疏水基团,一般用了去垢剂之后,就不应该在后续步骤里采用疏水作用层析的方法了。 27 (4)如果在后续步骤中选用凝集素层析, 选用的去垢剂是否构成干扰, 凝集素是一种植物中提取的一系列可以与糖基结合的蛋白。因为很多膜蛋白都有糖基修饰,凝集素层析可以利用这种性质来纯化一些膜蛋白。类似与Octyl Glucoside 的去垢剂,亲水基团是糖或者糖的衍生物,有可能与凝集素结合,降低凝集素的纯化效果。比如ConA agarose常常被用来纯化具有High-mannose type N-glycan的蛋白质,与mannose和glucose都能结合。如果此时用Octyl glucoside,就无法纯化蛋白了,因为Octyl glucoside的亲水基团是一个glucose。 (5)是否需要用弱的去垢剂来去掉soluble protein? 有时候用去垢剂并非完全是用来溶解膜蛋百,其实也可以用来去掉一些可溶蛋白杂质。比如Sodium cholate是一种很弱的去垢剂,虽然不能用来很有效的溶解insulin receptor之类的膜蛋白, 但是可是用来处理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白杂质。 (6)是否需要用去垢剂来做Two phase partitioning, Triton X114是一种很特别的去垢剂,在室温下很容易溶解在水中,但是在,,摄氏度以上会从水相中脱离出来,并且连带的把膜蛋白也一起拽出来。这样呢,就可以把膜蛋白和可溶蛋白分开。这种方法叫做,two phase partitioning。我并不太喜欢这种方法,因为有一组人做了这个实验,感觉分得并不是那么干净,在可溶相还是有不少insulin receptor。 (7)去垢剂的用量是否足够? 要充分的溶解膜蛋白,去垢剂的用量必须足够才行。我们在试验中,先测了一下起始样品的蛋白总浓度,然后以detergent : protein 5:1的比例加去垢剂。 (8)选用的去垢剂是否影响所纯化蛋白的活性, 有些情况下,某些十分娇贵的蛋白质对一些去垢剂很敏感。问题是,很难预先就知 28 道那种去垢剂会降低蛋白活性。但是,我觉得大家至少得意识到,去垢剂很有可能干扰蛋白活性的。我举一个例子。我是做糖基转移酶的。有一种酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一种膜蛋白,跟muscular dystrophy有关系,是一个研究热点。很多实验室都怀疑这种蛋白是糖基转移酶,但是很长一段时间里面,很多实验室发现表达的重组蛋白都没有活性。一直到前两年,终于有一个实验室证明了这个蛋白是有活性的。之所以很多实验室之前都不成功,其中一个重要因素就是去垢剂。Triton X100和NP40是很常用的去垢剂。这个成功的实验室发现,如果用常规浓度下的Triton X-100,表达的Protein O-mannosyltransferase完全没有活性,相比之下用了Octyl thio-glucoside就有活性了,所以呢,如果大家试图表达一个膜蛋白,却没有活性,不妨换一下去垢剂,说不定会有意外的惊喜。 :十八:凝集素层析 我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后,紧跟着的一步就是用 Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素(Lectin:中的一种,而Lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修饰。根据这个性质,用固定有适当的凝集素的beads,比如WGA agarose或者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意,只能是部分提纯,凝集素层析并不能一步登天,让蛋白质比活力一下子提高上千倍,至多几十倍就已经很不错了。但尽管如此,凝集素层析是一种很好的办法,因为buffer条件非常温和,洗脱液是加了糖的buffer,透析什么的也方便,非常非常适合于和其他层析方法偶连起来用。 纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里,我先向大家介绍一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳动物细胞中最常见的一种糖基修 29 饰。 这种糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有这个sequence, N-X-S/T , 最前面的Asparagine多半被N-glycan修饰。N-glycan是一个Oligosaccharide 结构,好像一个分叉的树枝一样。膜蛋白的新生肽链在被翻译合成的同时会被直接塞入ER lumen,同时就会被加上一整个树枝状的N-glycan core。这个N-glycan加上去之后,并不是就大功告成了,而是要经历一系列“裁减”,有的糖基会被去掉,新的糖基又会被加上,这样最后的N-glycan structure往往是千奇百怪。 但是N-glycan的“主干”都是相似的. Man Man \ / \Man/ | GlcNAc | GlcNAc | N-X-S/T Man代表Mannose甘露糖,而GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺. 保留在ER或者Cis-Golgi的膜蛋白,N-glycan往往是High-mannose type。在这种N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修饰。最适合于纯化这种蛋白的凝集素是ConA。ConA主要识别alpha-mannose, alpha-glucose和alpha-GlcNAc,所以可以这三种糖溶液来做洗脱液。分泌出去的蛋白,或者已经到细胞表面的膜蛋白的N-glycan往往是complex type。这种complex type N-glycan的末端往往修饰有Sialic acid:唾液酸,一种带负电的糖:和GlcNAc。而WGA主要识别GlcNAc和Sialic acids, 30 所以特别适合于纯化这种类型的蛋白,洗脱液可以用GlcNAc和Sialic acid溶液。 最后需要指出来是,纯化一种特定蛋白,选择用什么凝集素是完全经验性的,需要提前测试才知道的。 :十九:MDA-BF-1的启示 凝集素层析实际操作起来很简单,跟过简单的Ni柱子一样。拿到洗脱的蛋白之后,我们就着手开始测活,分析纯化的效率和倍数。胰岛素受体不是酶,所以测活是利用胰岛素与受体的特异结合。具体的测活步骤非常简单,就是把I-125标记的胰岛素和纯化的组分混合然后孵育一段时间。然后加PEG :Poly ethylene Glycol ) 6000沉淀胰岛素受体,而游离的胰岛素不会被沉淀下来。说到PEG沉淀,Dr.Lin讲了她自己闹的一个笑话。是这样的,她实验室发现了一个蛋白质因子 MDA-BF-1。这个因子对Osteoblast:成骨细胞:的增长有促进作用。 然后呢,她就想把这个因子的受体给找出来。首先一步呢,就是得有一个测活方法。所以她就比照insulin receptor的测活方法而设计了一个方法, 其中连PEG沉淀都是一样的。结果呢,这个测活试验完全失败了。问题出在PEG沉淀这一步。PEG作为一种多元醇,可以想像为一种“分子海绵”,可以吸附水分子。这样样品中蛋白的有效浓度实际变大了好多,容易出现聚集然后沉淀的现象。这就是为什么insuline receptor可以被沉淀下来的原因。而游离的胰岛素本身分子量很小,只有不到10KD,而且非常易溶,所以即使加了PEG,也沉淀不下来。而Dr. Lin发现的MDA-BF-1因子,分子量相对insulin大了好多,有50多KD,所以游离的因子也能被PEG沉淀下来。听完这个小插曲,我感觉挺吃惊,作为一个有经验的教授,Dr.Lin在没弄清楚原理的情况下竟然就胡乱套用protocol 。所以呢,我感觉做实验,仅仅是follow protocol把实验完成了,是远远不够的。一定得搞清楚原理是怎么回事,这样出了问题才知道怎么去改进。 31 MDA-BF-1不仅仅给我以上的启示。Dr.Lin给我们做了一个seminar, 讲述她的研究进展。 其中她重点谈到了MDA-BF-1这个因子。 她实验室现在正在做的是试图用蛋白质纯化的办法来找出MDA-BF-1的受体。她的测活方法是这样的,首先表达MDA-BF1的重组蛋白,然后用同位素标记,然后做binding assay。这个binding assay 很麻烦,因为没办法用简单的手段把游离的MDA-BF-1和与受体结合上的MDA-BF-1分开,只能用gel filtration column来分开,每做一次assay都很麻烦。虽然Dr.Lin提到她们还没有找到那个受体,我个人觉得这个方法不是很明智。为什么呢?纯化 蛋白的过程中,各种膜蛋白都处于一种被去垢剂溶解的匀浆状态,这种情况下,一些正常生理条件下不会与MDA-BF1结合的受体可能也会与其结合。 这样一来,纯化出来的东西就是乱七八糟的了。另外一种可能性是: 有很多膜蛋白能与MDA-BF-1相互作用, 但是只有一种膜蛋白能够启动下游的信号传导, 促进Osteoblast的增长。这种binding assay的测活方法虽然可以找出与MDA-BF-1结合得最好的膜蛋白,但是找出的膜蛋白可能根本没有信号传导的功能。需要强调的是,蛋白质纯化绝对不是万能的。要想纯化出一个未知蛋白,最最重要的是要有一个简单明了直接的测活方法。Dr.Lin 实验的问题,说到底,就是没有好的测活方法。 这一个模块的纯化试验到此就为止了。我们测活之后,比较了各种去垢剂的纯化效率,发现Triton , CHAPS, Octyl Glucoside都还比较好,Sodium Cholate则差好多。 原始的实验手册上还有进一步的insulin affinity chromatography和其他分析。而教员为了满足很多学生做做重组蛋白表达纯化的愿望,用一些比较白痴的的实验取代了原有很经典的实验。比如一个实验是从SF9里面纯化一个his tag的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做这个试验之后,几乎要抓狂了。我这一组其他几个人还把这个试验当宝,抢着做。而我最后选择去跑了一个2D gel。就这样,第三个模块的实验结束了。 32 :二十:钙调蛋白 纯化胰岛素受体的模块结束之后,我们这一组人进入到最后一个模块,做钙调蛋白的纯化和分析。钙调蛋白(Calmodulin)十分重要,几乎在所有真核细胞里面都能找到。这个蛋白只有148个氨基酸,大概16KD,比较小。有Ca2+结合的情况下,钙调蛋白的构象可以发生较大的改变,从而激活一系列酶的活性,比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase等等。这一个模块的实验中,我们是从鸡胗里面提取和纯化钙调蛋白,然后再做一些分析。 这一个模块的纯化设计,可以说是最大限度的利用了钙调蛋白的特殊性质,我觉得设计的很精彩。不过我对这个模块的实验经历并不是很满意。教员的实验助手只有一个人,而且非常不称职,对实验本身似乎不太了解,也不是很helpful,感觉比前几个模块的实验助手差多了。教员叫Constantin,是一个俄罗斯人,在rutgers当教授。我起初对他印象不佳,后来发现这个人其实很nice,非常和蔼。 整个纯化步骤大概是这样的。首先把鸡胗剁碎匀浆,然后做粗分离,用硫酸铵沉淀的办法把杂蛋白都沉淀下来。然后再做等电点沉淀,把Calmodulin沉淀下来。重溶沉淀之后再做透析来脱盐。然后再过阴离子交换柱DEAE Sephadex A-50。纯化出来的组分再过疏水作用层析柱,就可以得到很纯的Calmodulin了,用Commassie blue都可以染出来。 我们做的实验中没有对Calmodulin的测活实验,可能是因为最后纯化出来的Calmodulin很多,可以做光谱分析之类的实验进行分析,所以就省掉了。但我多少有一点本末倒置的感觉。因为对未知蛋白质纯化,首先就得有一个靠的住的测活方法, 然后才能逐渐制定最优化的纯化策略。另外,在设计测活方法之前,还必须搞清楚,有生物活性的物质是不是蛋白质。一般有下列几种方法。(1)对protease的是 33 否敏感。(2)生物活性不会因为透析而丢掉(3)Urea之类的变性剂是否降低生物活性(4)对化学修饰剂(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是否敏感。 我们提取钙调蛋白所用的组织原料,鸡胗,量挺大的,有一斤之多,红红的一大堆肉。这样的组织,匀浆是一件很麻烦的事情,所以我们用了一个大号的匀浆机,试图把肉都捣烂。但是效果不好,重复了两次,还是有很多肉没有被弄碎,所以只好扔掉了。值得强调的是,对于这样大量组织的匀浆,缓冲液的配方必须有所考虑。首先,离子强度要低一点,高离子强度容易导致蛋白质聚集和沉淀;其次,最好加如EDTA之类金属离子螯合剂。这是因为组织里面会有很多二价阳离子,有可能会与组织里面的一些无机盐:比如磷酸盐:反应产生沉淀,导致匀浆中蛋白质不能完全溶解。最后,如果要在后续步骤中过阳离子交换柱,要避免有primary amine的缓冲物:比如tris:,如果要过阴离子交换柱,则要避免用磷酸buffer。 我们拿到匀浆之后,然后过滤。接着的一步就是硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀的原理我前面提到过,所以就不多说了。我们用了饱和硫酸铵浓度:,,,:来沉淀。 钙调蛋白这个东东很奇怪,没有钙离子结合的情况下很亲水,所以即使用饱和硫酸铵,也沉淀不下来。但大量的杂蛋白都能被沉淀下来。当然也不是所有的杂蛋白,至少血红蛋白就不行,因为硫酸铵沉淀后的上清还是红色的。下一步呢,就是等电点沉淀。钙调蛋白是一个很酸的蛋白,等电点只有4.05,所以可以加硫酸使pH降到4.05附近,蛋白总电荷为零,就容易聚集沉淀。我的感觉是,等电点沉淀并不是很可靠的方法,因为很难保证沉淀过程中蛋白会不会变性。搞不好,蛋白沉淀后就没法重溶了。钙调蛋白溶解性比较好,也比较皮实,重溶起来比较容易。重溶用的是Tris的溶液,由于这个时候样品溶液里面盐浓度很高,不能直接上样到下一步的离子交换柱上,所以需要透析。我们先把样品放到蒸馏水中透析两三个小时,然后再换到一般的缓冲液里。透析大家估计都熟悉,也没有什么技术含量。只有两点值得注意,首先,透析袋不能装满,因为透析过程中样品体积会增加。其次,透析袋空的地方要弄瘪,不能留空气,否则样品体积增大后,扎紧的透析袋可能会受压而破裂。 34 :二十一:离子交换层析 做完硫酸铵沉淀以及等电点沉淀之后,下一步就是做离子交换层析(ion-exchange chromatography)。离子交换层析原理很简单,利用蛋白质表面的带电基团和resin上带相反电荷的ion exchanger group相互结合来纯化蛋白。离子交换柱和affinity chromatography一样,属于absorption/desorption型的层析方法,与gel filtration完全不一样,其中一个最大的优点是,样品体积可以很大,最后的洗脱样品的体积可以小很多,这样实际起到了一个浓缩样品的作用。还有一个优点是,离子交换层析其实不需要柱子,可以用batch 的方法:在离心管里面混合beads和样品:。当然如果beads量多情况下,batch方法平衡得不是很好,导致resolution不是很好。这一点我们做实验的时候深有体会,以后的一篇中我会提到。我们纯化钙调蛋白用了柱子做纯化,原因是因为所用的beads 相当于Sephadex G50再加上阴离子交换基团,所以实际上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合体。 Calmodulin分子量比较小, 所以很容易和分子量大的杂蛋白分开。 离子交换柱分为阳离子交换柱和阴离子交换柱,前者主要用来纯化偏碱性的蛋白质,后者则用来纯化偏酸性的蛋白质。绝大部分蛋白都偏酸性,所以阴离子交换柱用得更加普遍一些。常用的阳离子交换剂主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl两种。Carboxymethyl比sulfopropyl要弱一些,所以同样的蛋白与这两种基团结合,后者的洗脱盐浓度得高一些。常用的阴离子交换剂有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine两种。后者比前者强,适用的pH也更宽。选用何种离子交换剂要根据实际要纯化蛋白的性质来决定。比如我们纯化钙调蛋白就用的是弱的阴离子交换柱DEAE,因为前面我提过,钙调蛋白的pI很低,蛋白很酸,与弱的阴离子交换剂也能结合得很好。而很多其它的杂蛋白没有这么酸,所以结合不上。这样, 35 用DEAE实际上可以有效的除去很多杂质。 离子交换柱真正跑起来时非常简单,没有什么技术含量,但是第一次纯化一种蛋白的时候,一定得先摸清起始条件。 首先要确定用什么缓冲液。缓冲物由于自己带电,所以也可以与ion-exchanger 结合。这种结合会带来两方面的干扰,一个是降低了缓冲物的浓度,因而降低了缓冲能力,另一个是与蛋白质竞争ion-exchanger。所以呢,如果用阴离子交换柱, 要避免用磷酸buffer之类的带负电的缓冲物,如果用阳离子交换柱,则要避免用Tris buffer之类的带正电的缓冲物。有的缓冲物是两性离子(zwitterionic),比如HEPES,所以阴阳两种离子交换层析都适用。如果待纯化的蛋白是膜蛋白,要用去垢剂,则应该选用非离子型或者两性离子型的去垢剂,道理跟上面是一样的。 第二个要注意的起始条件是pH。有些时候要分离的蛋白的活性对pH非常敏感,所以pH没有太多选择。但很多情况,应该根据待纯化蛋白的性质而进行选择。以阴离子交换柱为例,如果蛋白结合得不好,可以提高一下pH,如果蛋白结合得太紧,需要高盐洗脱的话,则应该降低一下pH。要确定最适合的pH,可以做一个简单的小实验:以阴离子交换柱为例:。配pH从5.0到9.0,间隔为0.5的一系列缓冲液。用这些buffer先把beads平衡好了,然后向每一种pH平衡好的beads里面加一小等分的样品。孵育之后,取上清测活。如果蛋白质结合上去了,上清的活性就没有了。然后,取比活性刚刚开始结合的pH高0.5单位的pH作为离子交换层析实验的pH。注意,这里pH不是越高越好,pH太高,杂蛋白也能结合上,会降低ion-exchanger 的capacity。 确定了buffer和pH, 下一步要确定的是上样时的起始离子强度,也就是样品起始盐浓度。用来确定盐浓度的小实验是这么做的,配一系列盐浓度从0.1M到1M:间隔0.1M)的缓冲液。用这些buffer平衡 beads, 然后加入一小等分的样品, 36 孵育之后,取上清测活。低盐浓度下的上清应该没有活性,因为蛋白可以与beads结合 ,较高盐浓度下, 上清中应开始出现活性。 然后选择刚刚低于洗脱蛋白所需盐浓度的浓度作为样品的起始盐浓度。这样做 的好处是, 一些与ionexchanger结合较弱的杂蛋白,一开始就不会结合到beads上去。另外,实际跑样品之前,如果样品体积比较大:比如数百毫升:,必须测一下电导率以确定起始盐浓度符合要求。如果低了,就应该加盐,高了,就应该加水。 :二十二:失败中的启示 离子交换层析之后是最后一步纯化,疏水作用层析 (hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC和硫酸铵沉淀是同一个原理。蛋白质表面有一些疏水区域,如果在蛋白质样品溶液里面加足够的盐,就会与这些疏水区域争夺水分子。没有了足够的分子,这些疏水区域倾向于与其他疏水区域结合。HIC的beads上衍生有非极性基团,可以与蛋白质的疏水区域结合,这样蛋白质就能bind到柱子上。要想把蛋白质洗脱下来,则要用低盐缓冲液冲洗,盐浓度下降之后蛋白质与柱子的疏水相互作用也被削弱,所以能被冲洗下来。由于HIC要求样品的起始盐浓度很高,所以特别适于作为硫酸铵沉淀或者离子交换层析后续步骤。因为硫酸铵沉淀:无论是上清还是沉淀:和离子交换层析的产物,盐浓度都非常高,如果直接再跑HIC,不但省了透析脱盐的一步,还进一步纯化了蛋白。现在常用的HIC resin上的疏水基团有两种,一种是Phenyl 另一种是Octyl。比较而言,Octyl group更加疏水一些。我们这一次的实验中用的是Phenyl sepharose。值得强调的是,对于HIC而言,resin的衍生基团并不是越疏水就越好的。因为如果太疏水的话,与蛋白质的结合会十分紧密,以至于要加入有机溶剂,才能冲洗下来。但是有机溶剂同时又有可能使蛋白变性。 疏水作用层析特别适用于纯化钙调蛋白。因为钙调蛋白在有钙离子结合的条件下,高度疏水,即使在低盐浓度下也可以很牢固的与HIC column 结合。洗脱钙调 37 蛋白时,用含有EDTA或者EGTA的缓冲液。失去钙离子的钙调蛋白疏水性会降低很多, 这样很容易被冲洗下来。 HIC这一步,我感觉要比前一步离子交换有用的多。为什么呢,这要从我们一组实验中的失败说起。跑DEAE柱子需要我们自己装柱,大小跟过去跑S-300柱子差不多,装好柱子之后我们就开始上样。起初这个柱子没什么问题,但在样品快要上完的时候,不知为何柱子里面大量的beads漏到了柱子的玻璃保温夹层里面。我们一看大事不好,只好把柱子停了,然后把beads全掏了出来,准备用batch的方法来洗脱蛋白。我们用了一个tissue culture过滤media的过滤器来做这件事情。beads 放在过滤漏斗里面,加含盐的缓冲液搅拌洗涤,然后抽真空让液体过滤出来。按道理,绝大部分钙调蛋白应该被0.9M NaCl的buffer冲洗下来。但是我们又发生了意外,冲洗的过程中过滤器被碰倒了,beads和洗脱液撒了一桌子,眼 看要成功了,竟然发生这种倒霉事情,全组人都很depressed,都有一种要就 义的感觉。教员Constantin比较有经验,他要我们把0.9M NaCl之前的低盐洗脱液混在一起直接做下一步疏水作用层析。这样一来,我们等于绕过了离子交换这一步。最后纯化纯化出来的蛋白让我们大吃一惊,不但非常纯不说,总量大概有几十个毫克,跟手册上给的通常产量差不多。这个结果说明一个问题,就是离子交换这一步虽然看起来很fancy,但对于钙调蛋白的纯化并不是那么重要。蛋白质纯化的步骤并不是越复杂越好,简单,快速,便宜的步骤才是最好的。 :二十三:正相与反相 我们纯化出钙调蛋白之后,就开始进行一些蛋白质化学的分析。主要是蛋白酶消化,反相HPLC分析,MALDI-TOF质谱之类的分析。我觉得在这个课程里面加一个质谱分析并不是那么有用,因为基本上只是演示实验,只是讲了讲皮毛而已。相比之下反相HPLC在蛋白质纯化中要重要得多。 HPLC的全称是High Performance Liquid Chromatography :高效液相色谱:,这个 38 名称听起来好像很尖端的样子,其实HPLC组成部件非常简单,主要是三部分,泵,柱子,和UV monitor。反相HPLC跟一般的色谱的一个显著不同是压力。为了保证纯化蛋白的分辨能力,反相HPLC柱的matrix材料颗粒非常精细,所以必须施加很大的压力才能跑得动柱子。相比之下,反相HPLC所需压力比一般gel filration柱子压力大十倍都不止。反相HPLC的分辨度十分惊人,远远超过其他色谱方法。分辨度高到什么地步呢,我举一个自己的例子。我原来在E.Coli里面表达EGF repeat,大概有7到8KD的样子,然后用体外反应加上一个fucose糖基。这个fucose分子量只有146。就这么小的区别,即使跑在SDS-PAGE上也是看不出来的,但是用反相HPLC可以很完全的把没有糖基和修饰上糖基的EGF repeats分成两个峰。可见反相HPLC有多么强大了。 反相HPLC虽然很强大,但是它最大的弱点是不能用来分离大的蛋白,只能用来分离小肽或者小蛋白:比如histone:。具体说起来,大于30KD的蛋白就可能不行了。原因是洗脱相里面用得是有机溶剂,容易使大蛋白,尤其是带有很多二级结构的蛋白变性。 反相HPLC为什么叫反相(reverse phase)呢? 这其实跟正相(normal phase) HPLC有关系。正相HPLC依靠提高流动相的极性来洗脱。而反相HPLC则相反,依靠降低流动相的极性来洗脱。正相和反相HPLC柱子的材料都是由silica gel:硅胶:构成的。反相HPLC柱子的silica gel上面还有衍生的alkyl group,所以疏水性强了许多。正相HPLC一般用来分离脂类分子。脂类分子有少许极性,如果样品溶解在有机溶剂里面,再过柱的话,可以与柱子的silica gel结合上。如果在流动相里面逐渐提高极性成分,脂分子就会被洗脱下来。反相HPLC则是用来分离蛋白质的。蛋白质有部分疏水性质,过反相柱的时候,可以与silica gel上的alkyl group相互结合。但是如果在流动相里面逐渐提高非极性成分:比如acetonitrile:,蛋白质就会被洗脱下来。 大家可能注意到,反相HPLC的原理和疏水作用层析的原理很相似。但是,反相 39 HPLC里面的蛋白质与柱子的疏水作用比一般疏水作用层析要强得多。原因就在于反相HPLC流动相中含有TFA:三氟乙酸:。TFA是一种强酸,所以能很有力质子化蛋白质中的羧基,是之不带负电。同时又能与蛋白质中正电基团形成离子对,进一步增加蛋白质与柱材料的疏水相互作用。 反相HPLC具体跑起来很简单,主要是操作仪器,先把蛋白质样品和0.1%TFA的溶液混合一下,然后上样,用0.1%TFA冲洗若干分钟,使得蛋白样品和柱子结合上。然后逐渐增加流动相中的acetonitrle:乙晴:浓度,洗脱蛋白。 :二十四:尾声 蛋白质纯化第十三天,也就是最后一天的时候,大家基本上都松弛了下来,开始准备狂欢。先是每人发了一件纪念T shirt,然后在CSHL的酒吧里面开酒会,再接着就是龙虾宴。不过气氛最热烈的还是龙虾宴之后的诗会。诗会我还是第一次碰到,要求每人写一首跟蛋白质纯化有关的诗,并且当众朗读,场面十分热闹和搞笑。我好不容易写了一首,是这样的: My protein My protein used to be wild, Like a naughty child, He likes to play seek and hide, which makes me feel really tired, But now I can find him no matter it is day or night, Because from Dick, Al, Sue-hwa and Constantin, I have learned how to Purify! 40 诗会之后,绝大部分同学和老师都在活动室打乒乓球或者台球。而我由于住得近,就直接开车回学校了。回想起来,这一次的课程十分令人难忘,认识了很多新朋友,学到了很多新知识,大大开阔了眼界。当然,指望在短短的两个星期就学会所有蛋白质纯化的技术是很不现实的,但是这个课程至少让我们认识到,蛋白质纯化虽然很复杂,但是本身并不是那么高不可攀。只要用心去揣摩和尝试,就一定可以做得很好。 除了,,天的课程,写这一系列学习笔记,也让我收获不小。因为写的过程中,我认真的复习了所做实验的记录和课程的教材,对实验设计的理解加深了好多。这也算是除了在BBS上灌水外的一个意外收获吧。 有网友在版上问,“本文献给YL”中的YL是不是杨澜,答案是否定的。因为杨澜显然不懂生物,更不懂蛋白质纯化,^_^ 。YL是我的一个好朋友。课程还没结束的时候,我有一次打电话向她吹嘘我学到的新知识,并且夸口说会在MITBBS生物版写一些总结。然后她称赞我,说善于总结是我的优点云云。听到这些话,我心里有些飘飘然,因为我不常听到超极大美女的夸奖。可是很快,我就意识到不能光说不练,蒙混过关,所以只好咬着牙硬着头皮一点一点的挣扎的写到现在。所以,没有YL的鼓励,就没有这一系列文章。把这个系列献给她,算是表达我的感谢把。 最后,如果有同学对蛋白质纯化十分感兴趣,我在此推荐两本参考书。一本是我们这个课程的教 材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual . C old Spring Harbor laboratory Press.另一本是 Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to Protein purification Academic Press. : 全文 企业安全文化建设方案企业安全文化建设导则安全文明施工及保证措施创建安全文明校园实施方案创建安全文明工地监理工作情况 完: 41 2007-12-2 22:44 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(一) 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(一) 发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 28 12:16:34 2006), 转信 [url= 1.html][/url] 本文献给YL (一)新的开始 去年(,,,,)四月份我参加了冷泉港实验室开设的《蛋白质纯化与鉴定》 培训课，并写了“从纯化到星辰”系列短文来回顾这个课程。一开始只是抱着写 着好玩，八卦一下的想法，写到后来整个系列就变成了很严肃的学习笔记。起初 我还担心MITBBS 生物版的网友会觉得这种形式很枯燥无味，没想到大家反应还 挺热情，让我很受鼓励。 “从纯化到星辰”只是开了一个头。今年我想向大家介绍冷泉港实验室开设 的另一个很重要的课程，《小鼠分子胚胎学》(Molecular Embryology of the Mouse)。之所以今年去学习这门课程是因为我希望利用动物模型来研究复杂的人 类疾病。我一直认为简单的体外实验体系是不可能让我们真正理解人类疾病中出 现的复杂现象的。我举一个简单的例子吧。我做cancer metastasis，研究了两 个有相同遗传背景的人结肠癌细胞株A和B。A是从病人的primary tumor分离出来 的，一年之后这个病人出现癌转移，B是从扩散到淋巴结中的癌症中分离出来的。 我当时就猜想B应该有更强的转移能力。在做细胞培养的时候我注意到B的增生速 度要比A快很多。同样20%的初始密度，B三天就能长满，而A则要十多天才能勉 强到80%。我注意到这个现象之后，高兴坏了，愈发肯定A的转移能力肯定比B弱 很多。为了验证这一点，我把这两个细胞株分别注射到裸鼠血液循环系统里面 诱导metastasis。大大出乎我意料的是:两个细胞株几乎是在同时诱导出 42 了metastasis～后来我又翻查了别人的研究，发现不少实验室都有类似的发 现。结论是不能用癌细胞在体外培养中的性状来预测其metastasis的能力。 由此可见，审慎选择合适的系统和模型是十分重要的。 去年年初申请蛋白质纯化课的时候，我就对小鼠课程产生了浓厚的兴趣。 但是那个时候我只有生化的背景，做的研究跟小鼠也没有任何关系。这种情 况下，申请这个课程是很难被录取的。所以我最后决定先去上蛋白质纯化课， 等待时机成熟之后再去申请上小鼠课程。去年年底答辩之后，我转到了一个 新的实验室做博士后，研究cancer metastasis。虽然我做的动物实验还是非 常有限，但觉得时机已经成熟，于是在二月份的时候递交了申请。 冷泉港的《小鼠分子胚胎学课》是一个门阑很高的课，每年有超过六十人申 请，但只有十四个名额。而且主管教师喜欢diversity，喜欢搞平衡。以今年为 例，一共十四个学生，一半女生一半男生;六个研究生六个博士后两个faculty; 所有学生做的方向都不一样。我能被选上是极端走运了，因为我正好认识一个主 讲老师，我还是他一篇文章的第三作者。另外这个课的时间有三个星期，比蛋白 质纯化课多了一个星期，学费也贵了不少，要三千五百刀。我年初拿了一个博 士后的fellowship，每年有额外经费用做开会买电脑什么的。所以就不用自己 掏腰包了。现在想起来，真是撞大运了。 四月底收到冷泉港的录取 通知 关于发布提成方案的通知关于xx通知关于成立公司筹建组的通知关于红头文件的使用公开通知关于计发全勤奖的通知 之后，心里一阵狂喜，但同时又在琢磨这个 课到底会教些什么。六月六号我开车赶到了冷泉港，一年之后又回到了熟悉的 环境，感到十分激动。 2007-12-2 22:45 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(二) 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jun 29 12:29:50 2006), 转信 本文献给YL 43 (二)梦之队 六月六号晚上，讲课老师和学生在冷泉港Beckman Neuroscience Building 的 Plimpton conference room会面，主要是相互认识，同时介绍这门课的光荣历史 和计划安排。冷泉港所开课程中历史第一悠久的是《高级细菌遗传学》，有五十 多年的历史，而第二悠久的就是《小鼠分子胚胎学》了。八十年代初的时候，转 基因老鼠技术刚刚诞生不久，Watson提议开一门课程教人做显微注射。于是 ,,,,年开了第一次课，一直延续到现在，到今年已经是,,届。在二十多年 的时间里面，授课内容从单一的显微注射拓宽到小鼠胚胎发育的各种实验技术。 这门课实验部分覆盖面之广是我上课之前完全没有意识到的。有多广呢,大家可 能都熟悉一本厚厚的实验手册叫做“Manipulating the Mouse Embryo:a laboratory manual”。这本手册描述的实验,,,我们都做过或者演示过。而且 最难最有用的实验技术我们必须自己动手做。按主讲老师Michael Shen的说法就 是，这些技术是dying technique。因为很多小鼠胚胎发育技术比较复杂，如果没 有人手把手教，只是看手册的话，是不可能学会的。这就是为什么所有的研究所 和大学都有transgenic mouse facility的原因。依赖transgenic mouse facility来帮忙当然是很简单了，但是有些时候还是得自己动手做。我举一个例 子吧。世界上最早的基因敲除老鼠是由三个不同的实验室在,,,,年做出来的。 而在国内，第一个基因敲除老鼠一直到,,,,年才在上海生化细胞所胡赓熙实 验室诞生。比国外整整迟了十一年时间～说起来难以置信，但也可以理解，因为 大部分回国的中国科学家也不知道怎么做这些实验。 小鼠胚胎实验这么复杂，大家可以想像得到，教师队伍必须非常有经验才能 传授这些技术。事实上，这门课的教师队伍的水平让人目瞪口呆，毫不夸张的 说就是一只全明星梦之队。跟《蛋白质纯化课》比起来，《小鼠分子胚胎学》 的教师队伍就象大海和小溪的关系。首先《小鼠分子胚胎学》常驻教做实验的 老师就有六个人，而且都是教授级别的，而《蛋白质纯化课》教做实验的好多都 是研究生;其次，应邀做报告的教授有近三十人，人数比《蛋白质纯化课》多了 一倍不说，水平可以说是星光灿烂。很多应邀做报告的教授自己就是实验高手， 我们做实验的时候，他们就会到实验室来逛，并且手把手的教做一些技术。另外 44 有些技术比较特殊，即使是主讲的六个老师也不是很熟悉，这样就完全依靠应邀 做报告的教授亲自动手来教。相比之下《蛋白质纯化课》就差太多了，为了省 旅费，都是就近找的冷泉港教授讲课。而这些教授做的东西往往跟蛋白质纯化 关系不是很紧密，到最后我觉得没有学到什么东西。第三，整个实验课中，后 勤做得非常好。主讲老师提前四天就到冷泉港准备老鼠交配。冷泉港动物房专 门提供了两个房间用来养课程用的数千只老鼠。因为很多实验技术需要反复重 复才能学会，所以讲课老师准备了几乎是无限量的老鼠来供我们练习。每天做 完实验之后，一个硕大的红色塑料袋往往装满了老鼠尸体。到后来，老鼠供应 量超过了学生杀老鼠的速度，即使不停的dissect，也杀不完，让人ft不已。 另外仪器也是最先进的，由各个公司免费借用，每个人都有一台很好的 dissecting microscope，另外每两人有一台microinjector。有些应邀做报告 的教授看到我们一共十四个学生竟然有七台microinjector，都吃了一惊。另 外，我们还有一台很先进的confocal microscope ，三台fluorescence microscope，一台paraffin 切片机，和一台低温切片机。所有这些机器都是全 新的。各个提供仪器的公司包括Zeiss, Leica, eppendort, Olympus，都派了 技术人员来蹲点，随时为我们解疑答难。冷泉港为了这个课真的是下了血本， 算上十四个学生交的学费，不考虑学生和老师的吃住，冷泉港还要投入八万美 元才能把缺口填上。 2007-12-2 22:45 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(三) 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 1 09:14:06 2006), 转信 本文献给YL (三)五湖四海 《小鼠分子胚胎学》的老师和学生可以说来自五湖四海。主讲老师(instructor) 有两位---UMDNJ的Michael Shen和杜克大学的Blanche Capel。辅讲老师 (co-instructor)也有两位---Stowers的Paul Trainor和北卡的David Threadgill。 45 Michael 和Blanche在2003~2004是辅讲老师，之后转成主讲，今年则是最后一年执 教这个课。明年就会由Paul和David接班。我博士实验室和Michael 合作过，我还 是他一篇文章的第三作者。前面提过，如果不是因为认识他，我是绝无可能被这 个课录取的。所以我对他是相当感激的。以前虽然合作过，但是我没有见过他。 上了这个课之后才对他有些了解。一开始觉得他有点浮，喝酒之后还会比较疯， 比如跳到桌子上跳舞什么的。但是很快我就发现这老哥在学术上非常牛，分析 问题往往是一针见血。比如metastasis领域还主要停留在用裸鼠xenograft为 研究手段的层次上，Michael则认为这种研究方法完全不对。他的想法和我的 想法可谓是不谋而合。Blanche Capel是一个人特好的中年妇女，据说是南方 的大户人家之女，做了几年家庭主妇之后再去做博士和博士后的。Paul和 David这两位教授人非常nice，科学也做得很好。Paul比较年轻，还是 assistant professor。David Threadgill年纪大一些，小鼠遗传学功底非常 深厚。除了主讲老师和辅讲老师以外还有两位经验极其丰富的助教(assistant): Diana Escalante-Alcalde和Jaime Rivera-Perez。Diana是墨西哥人，在墨 西哥城一个研究所当教授。Jaime则在北卡一个实验室，很快就要搬到麻 州大学去做faculty了。这两位助教人特别特别好，有问必答，百问不烦。 现在来谈谈我在课上的同学。Malgosia---我博士实验室的同事，人其实 不错，只是非常情绪化。所以我总是尽量避免招惹他。她在做一个糖基转移酶 的knockout，而我做了这个酶的生化分析。Daryl---摩门教徒，在德州做小 儿科医生，也做不少研究。人巨nice，有五个孩子。Felicia---台湾人，也 是医生，在BU做医生。她动手能力很强，人也不错。只是有时候会有一种让 人不爽的优越感。我猜这是她为什么三十好几了还没结婚的原因，:-)。 Malin---可爱的小女生，刚开始读博士，瑞典人，来自karolinska研究所。 Clemens---德国佬，年纪比较大了，在fox chase cancer center做博后。 Christina---在UCSF读博士，做bioinformatics，人挺聪明的。 Angelique---冷泉港Hannon实验室研究生，才二年级就已经在Nature上 发了一篇第一作者。Sebastien---法国男生，在巴斯德研究所做博士后， 据说专门学过跳舞。Elia---西班牙University of Barcelona的研究生， 不过马上就要去伦敦做博士后了。Elia是所有同学中唯一的烟民。她人 46 十分友好，每次看到我总是主动和我打招呼。Nitzan---犹太人，从以 色列移民过来的。现在在芝加哥大学用分子生物学来研究人类进化。 他老板竟然还是个中国人，叫蓝田。我最近还在一个中文网站上看到过 对他的介绍。Nitzan这老兄把日本人贬得一钱不值，不知道是不是受了 他老板的影响。Rajika---印度女生，在冷泉港David Spector实验室做 博士后。Dave---在Berkeley做博士后，在一个zebra fish的实验室做。 不知道为什么跑来学小鼠胚胎学。Dave的绘画功底了得，我们课程的 T-shirt就是由他设计的。Zhengyi---来自Washington Univ的博士后。 这老哥人很不错，做实验也很好。 谈完老师和同学，现在谈谈受邀做报告的教授。这里面牛人很 多，我只想谈谈两个诺贝尔奖级别的教授。第一个叫Ann Mclaren， 从英国来。这是一个八十四岁，个头特矮，还驼背的老奶奶。她其貌 不扬，但是很难想到的是，她其实是小鼠胚胎发育的祖师级人物之一。 在六十年代，她发展了一系列技术，证明可以把着床前 (pre-implantation)胚胎从怀孕小鼠分离出来，进行体外培养和改造， 然后重新放回到小鼠的子宫里面，让其继续发育。这是一个极其伟大的 贡献。可以想像，没有Ann的贡献，所有现在这些transgenic 和 knockout mice都是不可能出现的。主讲老师Michael跟我们说，在这个 课上教学生做一些实验是很有压力的，因为发展这些技术的Ann会在旁 边看，搞不好还会当面说教的不对，让人下不了台。对我来说，能受 到Ann 的指导，可谓是莫大的荣幸。因为这些前驱性的工作，Ann获得 过2002年日本大奖 ([url=)][color=#154ba0] 02_1_2.htm)[/color][/url]。 另外Ann其实是一个铁娘子，说一不二，很直爽的那种人。据说原来她 有一个竞争对手，和她想做一样的东西。然后Ann去信说:XXX啊，我 知道你想做某某方向，但是我也感兴趣。现在我给你六个月时间，如 果六个月时间你还没有拿到任何结果，我就不客气也做这个了。哈哈。 真是一个有意思的老奶奶。除了Ann有希望得诺贝尔奖外，另一个教授 47 Oliver Smithies也很有希望。我会在以后介绍他的报告。这是一个八 十出头的老头，在北卡当教授。人非常好，而且很风趣。他的贡献很多， 但是最大的一个是证明了可以用同源重组(homologous recombination) 的办法来修饰哺乳动物细胞的genome。凡是做过mouse knockout的同学 应该马上意识这是多么了不起的一个贡献了把。没有Oliver的这个发现， mouse knockout只是科学幻想而已。正因为这个贡献，Oliver荣获了 2001年的lasker awards。由于50%的lasker获奖者后来都获得了诺贝尔 医学奖。我觉得如果诺贝尔奖要奖励mouse knockout技术的话，Oliver 一定会拿到的。 2007-12-2 22:46 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(四) 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jul 4 21:15:40 2006), 转信 本文献给YL (四)基本功 六月七号的早上，整个课程正式开始。每天的安排都是早上由一个教授做三个小时 的讲座，下午做实验，然后晚上又是一个教授做三小时的讲座。六月七号早上的报告是 主讲老师Blanche Capel做的，主要是介绍小鼠做为实验模型动物的历史，以及小鼠遗 传学的基本知识。这个课程主要涉及小鼠的发育，遗传上的东西谈的比较少，算是一个 不足之处。Blanche的报告比较系统，介绍起来会颇费笔墨，所以我想推迟到以后的连 载中来仔细讨论。首先介绍一下六月七号第一天的实验课所教的一些基本技能。 万事开头难，要想把小鼠实验做好了，需要会一些基本功。首先一个问题是怎么避 免老鼠咬你。按照主讲老师Blanche的说法就是“you have to feel comfortable with mice before mice feel comfortable with you”。这个说法是很有道理的。实验室 用鼠本来就是从宠物鼠繁殖而来，性情比较温和，只要不去猛烈刺激它，它就不会咬 你。如果处理老鼠的时候有足够信心，动作就不会很笨拙，这样老鼠就不会因为紧张而 48 乱咬。 避免刺激老鼠的一个诀窍是让老鼠的两个前爪有东西可抓。如果把老鼠放在平 滑的桌面上，老鼠就会挣扎得很厉害，很难控制。要想控制好老鼠，最好的办法是在拽 住尾巴把老鼠拖出来之后，立即把老鼠放在鼠笼铁盖上，让老鼠两个前爪抓住盖子的铁 条。如果必须得在实验台上操作，最好垫一层质地粗糙的纸巾，把老鼠放在上面。当然 说起来很简单，如果没有经验的话，一开始跟小鼠打交道还是很狼狈的。上这个课之前， 我动物实验的经验基本为零，只做过裸鼠的一些简单试验。裸鼠的牙齿比较弱，所以跟 裸鼠打交道，我从来不怕被咬。正常的老鼠咬起人来就厉害多了。在这个课程中我多次 被老鼠咬，不过运气好只是咬破手套而已。 实验课里面我学到的第二个基本功是杀老鼠。课程老师都是爱鼠之人，在课程里面 反复强调要人道对待小鼠，不能给小鼠带来太多痛苦。处死老鼠的办法有很多种，最人 道的办法是头颈脱臼处死法(cervical dislocation)。也有人用断头台砍头处死，或者 是用CO2闷死老鼠(比如我所在的学校)。具体的方法操作起来很简单，让左手大拇指 和食指顶在老鼠脑后把老鼠压住，然后右手拽住老鼠尾巴根部用力往后拉，让老鼠的脊 椎和大脑迅速断开。脊椎和大脑断开的时候，压在老鼠脑后的手指可以感觉得出来。处 死之后，老鼠有时候还会有挣扎，但往往是条件反射。测试老鼠是否已经死亡的办法， 是用手轻碰老鼠的后爪，如果老鼠还有反应，说明还没死。课程一开始的时候，很多女 生杀老鼠都有问题，不太敢用手指按住老鼠，而是用镊子之类的工具。我觉得这样做法 不是很合适，因为没法确定是否真的脱臼了。 如果你从来没有用这种办法杀过老鼠， 最好先处死一只被麻醉的老鼠，弄清楚老鼠头颈脱臼的手感，这样再杀老鼠的时候就知 道该用多大力气了。否则力气太小，弄不死老鼠，力气太大又可能弄得血肉模糊，甚至 把老鼠整个头部给扯下来。 第一天实验教的第三个基本功是腹腔注射(intraperitoneal injection)，简称 IP injection。对我们来说，IP injection非常重要，因为很多实验都是所谓的存活手 术(survival surgery)，需要麻醉小鼠，而一般用IP injection 来导入麻醉剂。IP injection的第一步是要把老鼠束缚住，露出腹部。正确的做法是用左手的大拇指和食指 牢牢的捏住老鼠颈背处(scruff)，让老鼠不能转过头来咬你，然后右手拉住老鼠尾巴， 让老鼠面朝上整个身体绷紧，然后左手小指和无名指按住老鼠尾巴根部。这样一只手就可 以让老鼠动弹不得。大家可能意识到一个问题:小鼠的四肢没有被固定住，万一注射的时 49 候小鼠四肢乱动怎么办啊,事实上，小鼠一旦发现自己头部不能转动，会自觉变得非常平 静，四肢不会有任何动作。这是一个很有意思的现象，有人说是装死，但我觉得更有可能 是一种自然的条件反射。因为很多哺乳动物母兽转移幼兽的时候，是用嘴叼住幼兽的颈背 的，这个时候幼兽就会自觉的停止挣扎。上这个课之前我也在裸鼠上做过IP injection， 但总要花很大力气，因为固定的不好，小鼠头可以转动，以至于下肢乱动，有时候竟然会 踢掉针头。所以束缚住老鼠的头部是关键中的关键。固定住老鼠之后，下一步就是扎针。 扎针点可以选小鼠腹面中线上，从尾部到头部的第一对和第二对乳头之间的位置。针头应 该朝向小鼠头部，倾斜二三十度角插入小鼠腹腔。这个位置斜插比较理想，因为即碰不到 胸腔，也碰不到腹腔最主要的脏器，最坏的情况也就是扎到肠子罢了，对老鼠影响不大。 另外我习惯把整个针头都插入，这样确保不仅穿透皮肤也穿透了肌肉层。否则的话，注射 的地方会出现一个大包，还得重来。 2007-12-2 22:46 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(五) 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 8 02:58:55 2006), 转信 本文献给YL (五)shock and awe 上一节里，我提到了六月七号第一天所涉及的动物实验基本功。有网友可能因此觉得 这个课教的东西很简单。要这么想就大错特错了，这个课程的特点是前难后易，第一天的 实验就很麻烦。一下午实验下来，我好像脱了一层皮，整个感受可以用shock and awe来 形容。想到还要这样再熬,,天，我就直哆嗦。当时甚至有了要求退钱走人的想法。当然 了，我最后还是坚持住了，十天之后重温第一天实验的时候，突然觉得其实一点也不难。 当然这是后话了。 为了让大家理解第一天实验的重要性，我先简单介绍一下小鼠的着床前胚胎发育(pre -implantation embryo development)。雌鼠和雄鼠交配之后，从卵巢排出的卵子在输卵 管壶腹部(ampula)受精。大概在1.5dpc(days post coitum，交配后天数)的时候，受 50 精卵开始分裂成双细胞胚胎，并在一天左右的时间里分裂成八细胞胚胎。在这个分裂过程 里面，细胞虽然进行分裂，但是并没有生长，所以整个胚胎的体积没有太大变化。从八细 胞胚胎开始，分裂的细胞开始表达一些细胞粘连分子，以至于所有细胞团缩在一起，形成 一个桑葚般的结构，叫作桑葚胚(morula)。这个时候大概是2.5dpc。桑葚胚继续发育， 在3.5dpc的时候演化成囊胚(blastocyst)，并从输卵管进入到子宫。囊胚是一个三分之 一满的球形结构。表面细胞组成所谓的滋养外胚层(trophectoderm)，最后会发育成胎 盘(placenta)的一部分;内部的细胞则称为内细胞群(inner cell mass)，最终会发 育成胎儿。到了4.5dpc 的时候，囊胚从包被其表面的蛋白质壳状结构透明带(zona pellucida)中孵化出来，然后与子宫内膜相互接触，引发子宫形成一种海绵状细胞组织包 裹整个胚胎。这层组织称为蜕膜(deciduum)。至此，胚胎被完全固定在子宫里面，直到 发育完全。这个固定在子宫的过程被称为着床(implantation)。 着床前胚胎(pre-implantation embryo)有几个特点很有意思:第一，从上面的介绍 可以知道，这个阶段的胚胎很容易从怀孕雌鼠取出来。只需要冲洗输卵管或者子宫就行了 ;第二，这个阶段的胚胎容易进行体外培养。只要一般的细胞培养条件就可以了。相比之 下着床后胚胎(post-implantation embryo)的体外培养就要麻烦得多;第三，也是最重 要的一个特点，就是如果把着床前胚胎(pre-implantation embryo)放到怀孕或者假孕 的雌鼠输卵管或者子宫里面，这些胚胎可以继续发育成熟。 正因为以上三个特点，我们可以通过改变着床前胚胎基因结构的办法来获得转基因小 鼠和基因敲除小鼠。以基因敲除老鼠为例，就是首先从怀孕小鼠子宫里面获得囊胚( blastocyst)，然后把目的基因一个拷贝被敲除的胚胎干细胞(embryonic stem cells) 显微注射到囊胚里面，并且把囊胚放到假孕的小鼠子宫里面发育成所谓的嵌合体小鼠( chimera)。之所以叫嵌合体，是因为这种小鼠身体各器官组织有一部分细胞由原有囊胚 发育而成，另一部分则由注射入囊胚的基因敲除胚胎干细胞发育而成。如果运气好的话， 一部分性腺细胞也是由注射入囊胚的基因敲除胚胎干细胞发育而成，从而产生基因敲除的 卵子或者精子。这种现象就是所谓的性腺遗传(germ line transmission)。把这种嵌合 体进行近一步交配的话，就可以最终获得基因敲除老鼠。我们六月七号第一个主要实验是 子宫冲洗(uterine flushing)，目的在于从怀孕雌鼠(3.5dpc)子宫里面分离囊胚( blastocyst);第二个实验是胚胎子宫转移，目的是练习把囊胚放到假孕的老鼠(2.5dpc 51 )子宫里面让其继续发育。上面刚刚提到，这两个实验是做基因敲除老鼠的两个关键步骤 。虽然一般都是由transgenic mouse facility来做，但是如果做大量的基因敲除的话， 还是自己会做比较方便，快速以及省钱。 2007-12-2 22:47 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(六) 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 8 23:15:36 2006), 转信 本文献给YL (六)Uterus/womb/matrix 我们这个课程设备比较先进，演示试验用的显微镜都接了摄像头，跟一个三十寸的液 晶大电视相联。所以老师演示什么实验，我们是看得一清二楚。负责演示子宫冲洗( uterine flushing)和胚胎子宫转移(uterine transfer)这两个实验的是Michael Shen 。他做起来倒是轻车熟路，干净利落，让人觉得好像只是小意思而已。但我心里十分紧张 ，因为我在本科的时候动物实验就是稀里糊涂的，到美国几年更是最近两个月才做点最简 单的动物实验，不知道自己能否挺过去。但是紧张也没用了，只有硬者头皮上了。 第一个实验是子宫冲洗(uterine flushing)。首先是怎么将老鼠开膛破肚。这一步 比较简单。把老鼠头颈脱臼处死之后，腹面朝上，喷些70%乙醇，用纸巾把脱落的毛擦掉 。然后如果是按Michael的办法，就是在老鼠腹部沿着头尾中线的方向把皮肤剪开一个小 口，然后用手把这个小口向两边撕开，这样被肌肉层包裹的整个腹腔就可以看得见了，然 后就是把肌肉层剪开，露出腹腔的脏器。Ann Mclaren喜欢的办法，是在老鼠腹面头尾中 线的中点处切开一个跟中线垂直的小口，然后用手把这个小口向头尾两边用力撕开。这样 一来，小鼠的整个身体都被剥皮了，只要剪开肌肉层就可以了。 将老鼠开膛破肚以后，下一步就是找到子宫了并把子宫分离出来了。小鼠的子宫是一 个“V”形的对称的管装结构。大概位于腹腔中偏背部的位置。子宫分叉的两部分称为子 宫角(uterine horn)。两个子宫角分别与左右两侧的输卵管以及卵巢连在一起。有意思 52 的是卵巢的脂肪垫(fat pad)将两侧的肾脏和卵巢又连在了一起。所以找到子宫的诀窍 就是找到肾脏。两个子宫角在靠近老鼠尾部会聚在一起，称为子宫颈(cervix)。子宫颈 则通往阴道。找到子宫颈比较容易，因为膀胱和子宫颈在一个位置，而膀胱很容易找到。 打开腹腔之后，首先看到的是乱七八糟一堆肠子，以及靠近头部方向的好几片肝脏。我的 经验是，如果你过去完全没见过子宫是什么样的，最好先找小鼠的左子宫角，然后顺藤摸 瓜找右子宫角。为什么要这样找呢,因为小鼠的胃和脾脏都在左侧，比较容易辨认，而左 边的肾脏就埋在胃的下面(以腹面朝上)，且靠近脾脏。实际操作起来很简单，首先把小 鼠的肠子尽量往小鼠的右边扒开，露出胃，然后用镊子翻开胃，找到肾脏。找到肾脏之后 ，卵巢，输卵管和子宫角就一目了然了。我对小鼠的解剖构造不是很了解，所以第一次解 剖找子宫时糗了一把，把胃认成了肾。当然以后这个错误再也没犯过，而且可以几秒钟之 内就把子宫给分离出来。我这里强烈推荐一本介绍小鼠解剖构造教材的网络版，有兴趣的 同学可以去看看[url][/url]。 子宫角有一侧附着有腹膜(mesometrium)，有很多血管和脂肪组织，比较脏，需要 在冲洗子宫之前去掉。这时左手用镊子把子宫角拉起来，露出腹膜，然后用解剖小剪刀把 腹膜组织尽可能的剪掉。接着就在靠近子宫与输卵管接口处剪断，并把左子宫角拉出来， 露出子宫颈。下一步要在子宫颈剪一刀，把子宫和阴道分开。此时比较重要的是不能把左 右两个子宫角也剪断了，这是因为子宫颈开口比较大，冲洗用的针头需要通过子宫颈插入 子宫角。下一步就是分离右子宫颈，步骤跟前面说的一样。分离子宫上面可能会有不少血 污，所以可以短暂的在干净的kimwipe纸巾上放一下，吸掉这些脏东西。 将分离的子宫放在35mm或者100mm培养皿的盖子上，然后就可以在解剖显微镜下进行 冲洗了。这里之所以用培养皿的盖子还不用培养皿本身是因为培养皿盖子的盖沿非常浅， 便于操作，这是我总结出来的经验。冲洗之前首先应该把显微镜调成暗视野，这样乳白色 的子宫更清楚一些。用来冲洗用的工具是26,30 gauge针头和一毫升的针管。操作之前针 头必须在砂纸上磨钝，否则很容易把子宫刺破。我们用来冲洗子宫用的培养液是M2，每个 子宫角大概需要三四百微升的M2 media来冲洗。冲洗过程本身看起来很简单，就是把针头 通过子宫颈插入子宫角。前面我提过，子宫颈开口比较大，所以只需要非常轻柔的用针头 53 去试探子宫颈口就可以，针头往往很容易进去。这里千万不能用蛮力，否则一旦把子宫戳 破了，就很难找到子宫的通道了。我第一次做的时候非常弱，把子宫颈部戳的稀烂，所以 最后根本不知道针头是否进入了子宫管道结构里面，然后就胡乱冲洗一下，居然还拿到了 两三个囊胚。后来我就学乖了，用针头非常轻的试探子宫颈口，插入之后进入到一个子宫 角。然后再用镊子把针头插入的子宫部位和针头一起夹起来，防止注射的培养液反冲出来 。下一步就是注射培养液了。注射的瞬间，你会发现整个子宫角会突然膨胀起来，并且变 的透明一些，这就说明冲洗成功了。接着再冲洗另一个子宫角。冲洗完之后把子宫扔掉就 可以开始找冲洗出来的囊胚了。 囊胚只有针尖大小，直径还不到一百微米，必须用解剖显微镜才能观察到。子宫冲洗 出来的绝大部分是脂肪滴之类的脏东西。不过根据我的经验，这些杂质并不容易和囊胚弄 混。因为首先囊胚是沉在底部的，一般杂质则是浮在液面上，如果轻轻晃动一下容器，囊 胚只会轻轻的扰动少许;其次，囊胚的折射比较特别，在显微镜下看特别晶莹剔透，十分 好看。 找到囊胚之后，下一个问题就来了，囊胚这么小，怎么才能方便进行转移呢, 2007-12-2 22:47 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(七) 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jul 11 23:08:27 2006), 转信 本文献给YL (七)口吸管和蓝珠子 上一篇提到子宫冲洗出来的囊胚只有针尖大小，要想方便快速的转移囊胚需要用一种 特殊的工具叫做口吸管(mouth pipette)。在我的印象中，不能用嘴吸溶液是从中学就 开始强调的常识。所以刚开始用这个工具时感觉特别新鲜。课程结束后，我还把自己用的 口吸管带了回来，算是纪念品。 54 口吸管的结构很简单:首先是一端拉细了的毛细玻璃管，这个毛细玻璃管通过一个接 头固定在一个硬塑料管(直径大概半个厘米，长大概四五个厘米)上;硬塑料管的另一边 接着一条长大概半米的软塑胶管;最后软塑胶管另一头接着一个硬塑料的吸口。 口吸管结构中最重要的是用来吸取胚胎的毛细玻璃管。要实现精细的控制囊胚的吸取 和喷出，毛细玻璃管的直径应该稍大于囊胚的直径，但又不能太大。上一篇提到囊胚的直 径大概是一百微米左右，而一般的毛细玻璃管直径却有1.5毫米，很显然必须拉细毛细玻 璃管才能使用。拉毛细玻璃管的过程很简单，首先用酒精灯的火焰烤融毛细玻璃管的中间 位置，然后把两头向相反方向用力一拉，形成一个细丝。然后把拉细的部分按在大姆指上 ，用指甲把拉细的部分给压断。这样就做成了两个开口平整，一头细一头粗的吸管。按道 理拉细的部分直径最好是两百微米左右，但根据我的经验如果只是一般的转移一下囊胚， 三四百微米粗的吸管也可以用。可以想象的是，吸管这么细，非常脆弱，很容易折断，所 以最好一次做个上十个备用。顺便提一下存放这些吸管的办法。揉一个橡皮泥棍子，放在 15厘米的大培养皿里面，然后把吸管水平的粘在橡皮泥棍子上，这样既好拿，又不会弄脏 吸管。 操作的时候把吸口叼在嘴里，一手拿着硬塑料管，同时用显微镜观察囊胚就好了。起 初我怀疑操作起来可能很麻烦，因为觉得吸上了囊胚之后就得用嘴继续含着吸口防止液体 又洒出去。事实上这个担心根本没有必要。因为拉细的一端毛细管作用非常明显，一旦吸 上一些液体后，这些液体就定在那里了。只要不用嘴吸或者吹，囊胚是掉不出来。所以吸 了一些囊胚之后，嘴完全可以松开吸口说话什么的，甚至把整个口吸管放在实验台上也可 以。 有洁癖的同学可能会觉得这种口吸管很脏，那么怎么保证口吸管吸口一定干净呢,这 一点没有人教，但是我总结出来了一个办法，就是在不用的时候把口吸管挂在显微镜的目 镜上。这样吸口悬在空中，要弄脏也很困难了。同时要用口吸管的时候往往是在显微镜下 操作，所以放拿都很顺手。 由于绝大部分学生没有用过口吸管，主讲老师要我们首先用一种蓝珠子来练习。这种 蓝珠子大概是Biorad卖的Affi-blue beads，本来是用来纯化蛋白用的，由于直径和囊胚 55 的直径很相似，用来模拟囊胚再好不过了。这种蓝珠子一方面用在练习中，另一方面可以 用作参照物来确定吸管的直径合乎要求，所以挺有用的。 上一篇提到子宫冲洗出囊胚，下一步就是要把这些囊胚转移到干净的M2培养液中洗干 净。这里有一个问题。囊胚这么小，如果放在一个盛满培养液的培养皿里，一下子就找不 到了。所以方便的办法是在一个培养皿里面准备数个五十微升培养液的液滴，把囊胚转移 到这些液滴里就很好找了。由于这些液滴很容易变干，所以必须倒入矿物油覆盖这些液滴 。 用口吸管转移胚胎到液滴的一个大忌是吹进气泡。因为吸管很细，一吹进气泡就是一 大堆小气泡，往往会覆盖整个液滴，挡住视线。这些气泡很麻烦，因为基本没有可能去掉 ，所以只能凭感觉用口吸管伸到气泡下面把囊胚吸出来。我们一开始做的时候不少学生都 犯了这个错误，所以弄得很麻烦。其实要解决这个问题也很简单，就是在吸囊胚之前，先 吸一点液体，这样不至于在吹出胚胎的时候，也吹出气泡。 2007-12-2 22:48 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(八) 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 15 20:34:20 2006), 转信 本文献给YL (八)Matrix Reloaded 六月七号第一天实验中最重要的一个项目是胚胎子宫转移(uterine transfer)。 这个实验的目的在于把经过体外培养和修饰过的囊胚(blastocyst)放回到假孕小鼠的子 宫里，使之着床(implantation)并且正常发育。没有这个技术存在，基因敲除小鼠是绝 对做不出来的。前面提到过，Anne Mclaren一手发展了这个技术，奠定了小鼠胚胎研究的 基础。原始的文章发表在Nature上，有兴趣的同学可以查阅一下:McLaren A. and Biggers J.D. 1958. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early embryos. Nature 182:877-878。 56 把囊胚(blastocyst)放入子宫(uterus)本身并不能保证囊胚的正常发育，只有 当囊胚正确的着床(implantation)之后才能进一步发育。而顺利的着床(implantation )需要怀孕雌鼠在特定时间“窗口”大量分泌一些激素。由于这种激素分泌“窗口”非常 短暂，为了不错过这个“窗口”，必须把3.5dpc的囊胚转移到2.5dpc而不是3.5dpc的假孕 小鼠。 “Manipulating the Mouse Embryo: a laboratory manual”介绍子宫转移的 protocol中没有怎么强调这个时间的问题，但是我觉得这一点很重要。 现在我来介绍这个实验技术。首先给代孕的小鼠腹腔注射麻醉剂avertin，让它睡 着。然后把小鼠放在一叠粗糙的纸巾上，开始找寻适当的切口位置，把卵巢和子宫拉出来 。怎么寻找切口位置呢,由于这是所谓的存活手术“survival surgery”，可以想像要想 小鼠在手术后尽快恢复过来，这个切口必须离卵巢和子宫很近，并且不能太大。一开始做 这个实验的时候，我觉得找切口是个很麻烦的事情，后来做了几次就觉得简单多了。我觉 得关键是弄明白子宫和卵巢的大概在小鼠身体中的位置。前面一篇中我提到过卵巢和肾脏 通过卵巢脂肪垫连在一起。它们位于小鼠腹腔背面，贴在腹膜上面，离脊椎和胸廓(rib cage)都很近。我们课程一个资深的教授Patric Tam教了我一个trick 来确定合适的切口 位置。以小鼠左侧的卵巢和子宫为例。首先让小鼠左半边身体朝上侧躺，用70%乙醇清洁 一下小鼠身体表面。然后用手触摸找到小鼠的脊椎和最下面(以头为上，尾为下)的一根 肋骨。这根肋骨和脊椎形成大概一个直角，在这个直角下面一点(大概一厘米)，紧靠脊 椎的地方，与脊椎平行的做一个大概半厘米到一厘米长的皮肤切口。注意，皮肤切口最好 不要太大。切开皮肤之后下一步要切开肌肉层和腹膜。由于肾脏什么的内脏紧贴着腹膜， 这一步要格外小心。我的做法是用精细的镊子把肌肉层什么拉起来，然后用解剖用的小剪 刀一点一点的剪开。这个开口不能太大，几个毫米就差不多了。腹膜被剪开之后，接着就 是把卵巢找出来，这样就可以轻易的确定子宫起始的位置了。卵巢本身很小，不好找，但 是卵巢的脂肪垫是很大的一团白色的东西，比较容易辨别。很多时候透过肌肉层就可以看 得到。这个时候用小镊子伸入腹膜切口，把脂肪垫拉出来。脂肪垫和肾脏联系不紧密，但 和卵巢联系比较紧，所以连带把卵巢，输卵管，和一部分子宫都拖了出来，以与脊椎垂直 的方向放在小鼠的身体上。然后用一个小牛头犬钳子(small bulldog clamp)夹住脂肪 垫，也放在小鼠身体上。这样子宫就不容易缩回去。 57 实验到这里都可以在实验台上完成，下面是把囊胚转进子宫，必须在解剖显微镜下 完成。把小鼠转移到显微镜下后，第一步是要在靠近卵巢的子宫上扎一个洞。我们用的是 30gauge的针头。有同学可能会问，为什么不能更粗的工具戳洞呢,这是因为穿孔过大的 话，子宫很容易被弄烂，转移进入的囊胚就很容易再掉出来。另外在子宫上面有很多毛细 血管，一旦被戳破会弄得血肉模糊，用很细的针头就可以避免这一点。第一次做这个活， 感觉会困难。因为子宫很脆弱，用力过大，针头会把整个子宫戳穿。我试了好半天才做成 功。我的做法是左手用钝的镊子把子宫稍微拉一起来一点，然后右手拿针头与子宫近似平 行的轻轻扎入。这个时候拿针头的右手不能乱抖，否则针口就会被弄烂。一旦觉得针头进 入了子宫之后，轻而又轻用针头在子宫的管状结构里面试探，看能不能自由的移动。如果 可以自由移动的话，说明针头是在子宫里面，扎针成功了。然后把针头取出来。 下一步是把载有囊胚的口吸管通过针口插入子宫里，然后把囊胚吹入子宫。实验作 到这里，按说很简单把。结果我发现了一个新问题。当我拿起载有囊胚的口吸管回到显微 镜下准备转移的时候，突然发现找不到针口了～因为针口非常小，一旦拔住针头，针孔就 看不见了，一点痕迹都没有。我第一次做的时候，没什么经验，只好硬着头皮用口吸管这 里戳戳那里戳戳，结果把子宫完全戳烂了也没找到原来的针口。第二次做的时候我就学聪 明了。我先把载有囊胚的口吸管挂在目镜上，然后扎针。扎成功之后，我用左手扶住针头 ，使针头继续留在在子宫里面。然后用右手把口吸管吸口放在嘴里，然后再拿住口吸管的 吸管和针头放在一起。然后再把针头拔出来，同时把口吸管插入。这样就不会出现找不到 针口的情况了。插入口吸管的时候也要小心，避免把针口弄烂，同时也要轻轻的在子宫里 面试探，看是否能够自由的在子宫里面移动。一旦确定正确插入了，下一步就是把口吸管 里面的囊胚吹进子宫了。把囊胚吹入子宫是很容易的事情，只要注意两个问题就行了。一 个是有时候整个吸管会堵塞住，比如扎到了毛细血管，有出血现象的时候;另一个是要确 定所有囊胚都完全进入了子宫。尤其后一个问题要注意一下。有同学会觉得使劲把口吸管 中所有的东西都一古脑吹进去不就结了吗。但事实没这么简单，因为这样会给子宫带来很 多气泡，有可能降低囊胚最后着床(implantation)的效率。我的做法比较简单，在吸取 囊胚之前先吸上一部分培养液，记住此时液柱高度，然后再吸囊胚。注射囊胚进子宫的时 候，我的眼睛不看目镜，直接观察口吸管的液柱，然后用力吹，直到液柱高度降到吸囊胚 之前。这样可以百分之百保证所有的囊胚都能进入子宫。 58 成功把囊胚注射入子宫后，就开始收尾了。把卵巢和子宫重新塞回到腹腔里面。由 于一开始的时候，肌肉层和腹膜的切口很小，只有几个毫米，所以可以不用缝合。只需要 用金属创伤夹(wound clipper)把皮肤切口钉起来就行了。然后把老鼠放回笼子里，过 十几天看老鼠是否怀孕就行了。 课程第一天做了子宫冲洗和子宫转移之后，我感觉象脱了一层皮，觉得能勉强做出 来已经是侥幸了。可是，我万万没想到的是，第二天的实验比第一天的实验要难暴多，可 以说是mission impossible。 2007-12-2 22:49 bioin ---CSH小鼠分子胚胎课侧记(九) 生命之初 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jul 17 18:02:33 2006), 转信 本文献给YL (九)abcdp 和毛色遗传 介绍完第一天的主要实验，现在我来谈谈第一天的讲座。六月七号早上三个小时的 讲座由Blanche 作，主要是介绍小鼠的基本常识。这三个小时里面涉及的东西挺多，其中 很有意思的一部分是介绍小鼠毛色遗传的基本知识。由于比较好观察，毛色是小鼠遗传学 最早研究的一个生理现象。对于做基因敲除老鼠的同学来说，懂一点毛色遗传的基本知识 是很有用的。比方说，确定是否拿到嵌合体小鼠(chimera)就是通过看小鼠是否有混合 的毛色。另外还可以用决定毛色的基因作为基因敲除的标记，这样光看毛色就可以知道是 杂合还是纯合的基因敲除老鼠。这样的做法可以省下很多做southern blot的时间。 先介绍毛色怎么来的。毛发的色素来源于毛囊(hair follicle)中的黑色素细胞 (melanocyte)。黑色素细胞生成并分泌出色素颗粒，而发干(hair shaft)中的髓质( Medulla)细胞和皮质(cortex)细胞在生长过程中吸收这些色素颗粒，因此展现出颜色 。黑色素细胞生成的色素可以分为两种:真黑色素(eumelanin)和类黑色素( pheomelanin)。真黑色素又有黑色和褐色两种，而类黑色素则是黄色的。 59 决定小鼠毛色基因位点有好多个，但是实际中最常遇到的有五个，分布于不同的五 个染色体。第一个基因是二号染色体上的agouti，这个基因的产物是一个分泌蛋白，可以 阻抗促黑激素(Melanocyte-stimulating hormone, MSH)的活性。MSH的功 能是确保黑色素细胞只产生黑色和褐色的真黑色素，但由于agouti基因产物的影响，黑色 素细胞某些时段也会产生黄色的类黑色素。最后的效果就是，毛发顶端以下会有一段是黄 色，而其他部分都是黑色或者褐色。这样的效果被称为agouti毛色。由于真黑色素可以是 黑色或者褐色，所以有黑agouti或者褐agouti。黑agouti的老鼠毛发总体呈现一种稍带褐 色的灰色，而褐agouti的老鼠毛发则是金黄色的。Agouti 这种毛色的小鼠非常常见，比 如用来显微注射囊胚的胚胎干细胞往往来自于129小鼠品系，129的毛色就是agouti。另外 agouti 毛色是显性遗传的，基因型往往用A表示，而non-agouti则用a来表示。 第二个基因位点是四号染色体上的brown。这个位点决定了生成的真黑色素是黑色 的还是黄色。黑色是显性遗传的，用B来表示;褐色则是隐性遗传的，用b来表示。这个基 因产物是黑色素合成路线中的一个酶。黑色的non-agouti毛发基本是纯黑的，这样毛发的 老鼠也很常见，最有名的是用来做基因敲除的C57BL/6小鼠品系。 第三个基因位点是七号染色体上的albino。这个位点决定的毛色没有人不知道的了 。这个位点决定了小鼠是白色还是非白色。好多人提到实验用的老鼠就知道小白鼠，小白 鼠的毛色就是albino。不过确切的讲，小白鼠是一种白化病的老鼠，并不是正常的老鼠。 Albino是白化病的意思。非白色是显性遗传的，用C表示;而白色是隐形遗传的，用c表示 。Albino位点的基因表达产物是酪氨酸酶(tyrosinase)，催化黑色素生物合成的最早一 步。如果小鼠没有这个酶，黑色素就没有办法合成，因此呈现白色的毛发。由于是因为黑 色素合成的早期步骤受了影响，这个形状一旦产生会完全掩盖其他毛色的性状。知道这一 点很重要，就不会错误的以为把纯白和纯黑的老鼠交配能拿到纯灰的后代，^_^。白色的 小鼠品系很多，比如BALB/c，常用在免疫研究中，也用来做单克隆抗体。 第四个基因位点是九号染色体上的dilute。这个位点与其他毛色位点配合在一起， 60 产生一种冲淡的颜色。不冲淡的颜色是显性，用D表示;冲淡则是隐性遗传，用d表示。产 生冲淡颜色的原因是黑色素细胞的形状异常，产生的色素颗粒数量没有变化，但是团聚在 一起，不够分散，这样整体效果就是某种毛色被冲淡了的效果。 最后一个常见毛色基因位点是七号染色体上的pink-eyed dilution。这种性状是隐 性遗传，用p表示。Pink-eyed dilution的老鼠的黑色色素的量少了很多，但是黄色色素 受的影响就很少。所以呈现出来的性状是老鼠有粉色的眼睛，并且毛色被冲淡。比如黑色 non-agouti的老鼠如果有pink-eyed dilution的性状，看起来就象有银色的皮毛。 2007-12-2 22:49 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十) 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 21 17:53:53 2006), 转信 本文献给YL (十)Richard Behringer的练习题 上一篇提到了小鼠的毛色。Blanche在讲课过程专门出了七道关于毛色的练习题 让我们思考。这七道题目是由MD Anderson的Richard Behringer准备的，这老哥精通小鼠 遗传学，是 “manipulating mouse embryo: a laboratory maual”的作者之一。由于实 在没有任何这方面的基础，在讨论这几个题目的时候，我完全是糊里糊涂的。现在上完课 之后，重新研习了一下毛色的基本知识，再来看这些题目，发现一点都不困难。下面就是 这些题目。 (,)albino的雌鼠和albino的雄鼠交配。子代的毛色是什么,C位点的基因型 是什么, (,)albino的雌鼠和黑色雄鼠交配，子代全是agouti。请问亲代的A位点基因 型是什么, 61 (,)黑色雌鼠和褐色雄鼠交配。部分子代是冲淡的黑色和冲淡的褐色。请问亲 代的D位点基因型是什么, (,)一只黑色的雌鼠和一只albino的雄鼠交配。所有的F1子代都是agouti。F1 子代相互交配后，F2子代有五种毛色表型, 包括agouti，albino，黑色，粉眼银色，粉眼 黄色。请问原先黑色的雌鼠和albino的雄鼠的毛色基因型是什么,F1子代的毛色基因型是 什么,F2子代的毛色基因型又是什么, (,)一只黑色雌鼠和一只冲淡黄色的雄鼠交配。所有的F1子代都是黑色。F1子 代相互交配后，F2子代有四种毛色表型, 包括黑色，褐色，冲淡黑色，冲淡黄色。请问原 先黑色的雌鼠和冲淡黄色的雄鼠的毛色基因型是什么,F1子代的毛色基因型是什么,F2子 代的毛色基因型又是什么, (,)一只黑色雌鼠和一只agouti的雄鼠交配。所有的后代都是agouti。请问亲 代的A位点基因型是什么, (,)一只albino雌鼠和一只agouti的雄鼠交配。所有的后代都有颜色。请问子 代和雄性亲代C位点基因型是什么, 下面是我的解答: (,)albino是白色，由于是隐性遗传，亲代这两只老鼠C位点基因型都是cc, 所以子代C位点基因型也都是cc，毛色也是albino白色。 (,)亲代雄鼠毛色是黑色，所以A位点是隐性，基因型是aa。由于子代全是 agouti，基因型只可能是Aa，而亲代雌鼠A位点基因型只可能是AA。 (,)冲淡色是隐性遗传，所以亲代必需至少各有一个d等位基因。而亲代自己 62 都不是冲淡色，所以亲代D位点基因型是Dd。 (,)先看亲代的毛色基因型。首先是A位点。雌鼠是黑色，非agouti，属于隐 性遗传，所以基因型是aa。而所有的子代都是agouti，所以albino雄鼠的A位点基因型只 可能是AA。 再看C位点。亲代雄鼠是albino，所以基因型是cc。由于子代全是agouti没 有albino，说明亲代雌鼠基因型只可能为CC。 再看D位点，由于冲淡色是隐性遗传，如果有亲代有d等位基因，F2子代必然 会显现出来。但事实不是这样，所以亲代D位点基因型全为DD。 接下来看看P位点(pink-eyed dilution)。粉眼冲淡色是隐性遗传，而在 F2子代中出现了这个表型，说明亲代中必然有p等位基因。但是F1子代中没有这个表型， 说明亲代中只有一方有p。亲代雌鼠是黑色，所以表型可以是Pp或者是PP。如果是Pp，雄 鼠的表型只能是PP;如果是PP，雄鼠的表型可以是pp或者Pp。 最后看B位点。F2子代有粉眼黄色表型，是pink-eyed dilution和褐色的组 合。说明亲代必然有b等位基因。而亲代雌鼠是黑色，B位点基因型可以是Bb或者是BB。如 果是Bb，亲代雄鼠基因型可以是BB，Bb，bb;如果是BB，亲代雄鼠基因型可以是Bb，bb。 由上可推测出，F1子代毛色基因型是Aa，Bb/BB/bb，Cc，DD，PP/Pp。 F2子代基因型可以从F1的基因型推测出来。 (,)首先看亲代的基因型。 雌鼠是黑色，所以是non-agouti，隐性遗传。A位点基因型是aa。雄鼠也 63 不是agouti，所以A位点也是aa。 雄鼠是冲淡黄色，所以B位点是隐性，基因型是bb。由于所有F1子代都是 黑色，所以雌鼠只可能是BB。 从亲代到F1到F2都没有albino表型，说明亲代没有c等位基因。所以亲代C 位点基因型都是CC。 再看D位点。雄鼠是冲淡黄色，所以是dd。但是所有F1子代都是黑色，所 以雌鼠只可能是DD。 P位点无疑亲代都是PP。跟C位点道理一样。 F1子代毛色基因型是aa，Bb，CC，Dd，PP。 F,子代毛色基因型可以由上面的结果推测出来。 (,)黑色雌鼠A位点是aa，由于后代都是agouti，所以雄鼠基因型只可能是AA 。 (,)albino雌鼠的C位点基因型是cc，由于后代都有颜色，说明没有albino表 型，所以雄鼠基因型只可能是CC。子代基因型是Cc。 2007-12-2 22:50 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十一) 发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jul 23 18:38:11 2006), 转信 64 本文献给YL (十一)不请自来的邻居 谈完小鼠的毛色，现在又回到Blanche第一天早上关于小鼠基本知识的讲座。上这 个课之前，我对实验用小鼠的分类和进化历史比较糊涂。经过Blanche的讲座和参考一些 材料之后，才算是清楚了很多。 先丛实验用小鼠的分类说起。实验室用的小鼠学名是Mus Musculus，俗名是house mouse(家鼠)。如果用界(kingdom)门(phylum)纲(Class)目(order)科(family )属(genus)种(species)的分类系统。实验室小鼠属于动物界，脊索动物门( chordata)脊椎动物亚门(vertebrata)哺乳纲(mammalia)啮齿目(rodentia)鼠科( muridae)家鼠属(mus)家鼠种(M. musculus)。 小鼠和人有着共同的哺乳动物祖先。这种动物出没非常隐秘，长的跟现在的啮齿目 动物差不多，生活在六千五百万年前。那个时期，正好是恐龙称霸地球的时代，可以想像 哺乳动物每天都生活在恐惧之中，因为一不留神就会进了恐龙的肚子。不过哺乳动物时来 运转，小行星撞地球，气候突变，绿色植物都死光了，很多食草动物也死了，恐龙也没有 了食物，就这样完蛋了。哺乳动物靠吃剩下的种子，奇迹般的熬过了一劫。后来全球气候 恢复正常，哺乳动物终于有了出头之日，到后来称霸地球，一直到现在。 啮齿目是哺乳动物中最大的一只，种类占了所有哺乳动物种类的40%。一般人常说 的老鼠，实际上指所有跟小鼠样子接近的啮齿动物。但跟小鼠亲缘关系最接近的还是大鼠 。小鼠(mouse)和大鼠(rat)同属鼠科(muridae)，在大约一千五百万年前，由共同 的祖先进化而来。家鼠属一直到六百万年才分化出来。 为什么实验用小鼠又叫家鼠(house mouse)呢,这是因为小鼠自从人类文明初先 端倪就是人类的伙伴。大概在一万年前，最后一次冰河时期结束的时候，人类进入新石器 时期。这个时期对人类文明来说是个十分重要的阶段，因为正是在这个阶段，人类开始进 入农业社会时期，由原来的游猎转而开始种植作物。进入农业文明的人类这个时候主要集 中在中东称为新月沃土(fertile crescent)的区域。这个区域西起以色列和黎巴嫩，跨 65 越叙利亚北部和伊拉克，东至波斯湾。这个时候小鼠在哪里呢,鼠科动物起源于印度次大 陆和东南亚。在新石器时期，小鼠主要聚集在巴基斯坦的干草原上面，跟人类本来没有什 么交道。小鼠中的domesticus种向西迁徙，跨过阿富汗和伊朗，与刚进入农业社会新月沃 土的人类来了一次亲密接触。农业社会的特点就是有粮仓，小鼠们乐坏了，感觉找到了天 堂，于是就赖着不走了，跟人类做了邻居。同时小鼠的musculus种向东迁徙与中国境内的 人类文明相遇。到这个时候，小鼠才成为真正意义上的家鼠(house mouse)。当然了， 人类是很恨这个不请自来的邻居的。Mouse这个单词起源于拉丁语的mus，又可以追溯到古 希腊语中的mys和古梵语的mush，意思是“偷窃”。又过了很多年，到了大概四千年前， 随着迁徙的人类，domesticus小鼠从中东到了西南欧;与此同时musculus小鼠也随着中国 的旅行者，穿越俄国，到达欧洲。又过了很多年，一千年前小鼠才随着人类到达地球的其 他大陆。有意思的是小鼠的迁徙史也就是人类的迁徙史，所以可以通过小鼠来研究人类的 迁徙规律。正因为包紧了人类的大腿，小鼠得以迅速繁衍，成为人类之外最成功的哺乳动 物。 2007-12-2 22:50 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十二) 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 1 04:05:25 2006), 转信 本文献给YL (十二)从宠物到实验模型 上一篇提到了小鼠进化的历史，这一篇里我来总结一下小鼠到底怎样成为实验模型 的。有意思的是，小鼠人工饲养和交配的历史比小鼠作为实验模型的历史要早一个世纪。 这是因为有很多人把小鼠当成宠物，喜欢毛色特别，并且行为比较滑稽的小鼠。这股小鼠 宠物热起源于十九世纪的中国和日本，后来又感染了欧洲，最终到了北美。,,,,年， 一个叫Abbie Lathrop的退休女教师，不甘寂寞，盘算靠养宠物鼠来捞点外快。她在麻省 的Granby开了一个mouse farm。,,,,年的时候生物学出了一件大事，就是把孟德尔的 66 遗传定律从废纸堆里翻了出来。结果大家都一窝蜂用各种实验模型来测试孟德尔的遗传定 律。这里面有一个真正的牛人叫William E. Castle，当时在哈佛大学的Bussey 研究所。 这老兄脑子比较活，觉得宠物鼠的毛色用来验证孟德尔的遗传定律再合适不过了。正好 Bussey 研究所离Lathrop开的mouse farm 很近，所以从1902年开始Castle就买了好多宠 物鼠来做实验。这便是小鼠遗传学以至于哺乳动物遗传学的开端。而Castle也被称为小鼠 遗传学之父。现在大家用的实验室小鼠品系大多都是从Lathrop的老鼠农场起源的。 小鼠虽然二十世纪初就被用作研究遗传的模型，但是小鼠遗传学并没有马上红火起 来，而是坐了将近八十年的冷板凳。原因很简单，被一种叫做果蝇的小虫子抢了风头。果 蝇作为遗传实验的模型确实很方便，比小鼠强太多了。但是有两个方面的研究，果蝇是不 能和小鼠比的:一个是癌症，一个是免疫。所以从Castle开始用小鼠做实验一直到二十世 纪八十年代，绝大多数跟小鼠有关的研究都是做癌症和免疫的。这里有个问题，就是 Castle最早拿到的小鼠遗传背景非常杂。用这样的老鼠做实验得出的结论显然是不可靠的 。所以必须得有大量遗传背景完全一样的小鼠“克隆”才行。在小鼠遗传学中，这种小鼠 称为近系小鼠(inbred)。培育近系小鼠很费时间，得要小鼠近亲结婚 (brother- sister mating) 二十代。然后拿到的老鼠各个基因位点都是纯合的。 第一个近系小鼠( inbred)是由Castle的学生，Clarence C. Little 在1909年培育出来的。这个品系叫做 DBA，是根据这个品系小鼠的毛色，diluted brown non-agouti，来命名的。近系小鼠的 交配成功标志着现代实验室小鼠的正式出现，是一个巨大的贡献。Little是个很了不起的 人物，他继承了Castle的衣钵，并且将小鼠遗传学发扬光大。做小鼠的专业户Jackson Laboratory也是Little创建的。 2007-12-2 22:51 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十三) 发信站: BBS 未名空间站 (Sun Aug 6 11:40:31 2006), 转信 本文献给YL (十三)神奇的inbred 67 Blanche在第一天上午的课程中花了很多时间讲解一些小鼠遗传学的基本概念。其 中最重要的一个概念是近系小鼠(inbred strain)。Inbred strain 的特点是所有的基 因位点都是纯合的(homozygous)。严格的定义是经过连续二十代兄弟,姐妹交配( brother sister crossing)的小鼠品系。由于是兄弟,姐妹交配，一旦交配的雌鼠和雄 鼠在某个位点是同样纯合的基因型，以后所有的后代在这个位点都会保持住纯合的基因型 。这样经过多代交配，小鼠所有的基因都会变得纯合。兄弟,姐妹交配是很典型的近亲繁 殖，所以一些有害的隐性基因会显露出来，导致小鼠的生育能力急剧下降，这个现象叫做 inbreeding depression。所以在inbred小鼠出现之前，不少人认为完全纯合的小鼠是不 可能培育出来的。但事实上，只要大规模交配，总能找到能够生育的小鼠，并且过了第八 代之后，小鼠中的有害等位基因往往已经被去掉了，inbreeding depression的现象也随 之消失。不同的inbred小鼠品系有专门的命名，往往是有罗马数字和大写的字母组成，比 如最常见的C57BL/6或者129。按道理说各个地方培育的同样一个inbred品系遗传信息完全 相同才对。但事实上会出现所谓的遗传漂移(genetic drift)现象，所以不同地方培育 的相同品系可能会有微小的不同之处。为了标明这一点，inbred品系名称里面会加上培育 单位的缩写，比如C57BL/6J就是指在Jackson Laboratory培育的C57BL/6J品系。 Inbred strain的的出现是个非常了不起的进步，按一个牛人的说法就是inbred strain对小鼠遗传学的重要性等同于分析天枰对化学的重要性。免疫排斥的遗传机理就是 用inbred strain为模型发现的。上个世纪四十年代的时候，有一帮人用小鼠来研究癌症 。他们发现一个很有意思的现象，一种inbred strain产生的自发肿瘤如果转移到另一种 inbred strain就会出现免疫排斥现象。最后人们终于意识到不同inbred strain的某些位 点的等位基因不一样，并把这些位点命名为组织相容性位点(Histocompatibility Locus )。另外，人们还发现这样的位点还不只一个。问题是怎么知道这些位点编码的基因是什 么呢,要解决这个问题首先得把这些H locus一个一个找出来。Jackson Laboratory的 George Snell在1945年开始用小鼠遗传学的办法来研究这个问题。他的做法是寄信 2007-12-2 22:51 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十四) 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 14 03:46:05 2006), 转信 68 本文献给YL (十四)不归之路 介绍完六月七号第一天上午的课程之后，现在我来讲讲晚上由Patrick Tam讲的 Introduction to mouse development。由于对发育知之甚少，这个讲座让我如坠五里 雾。说来惭愧，过去买过Gilbert编的Developmental Biology，但始终没读进去。这本 书虽然很权威，但是它的编排顺序却很奇怪，比如把几个脊椎动物的发育混在一起讲， 让人感觉很糊涂。Manipulating the Mouse Embryo: a laboratory manual的第二章专 门介绍小鼠的发育，非常之全面，就是挺复杂，初学者不容易理清楚脉络。从这一篇开 始，我将介绍小鼠胚胎发育的最基本过程和一些专有名词。 哺乳动物遗传学是从上个世纪初小鼠的研究开始的，但哺乳动物的胚胎发育学却 是从研究兔子开始的，时间也早了二三十年。现在我们常用的这些小鼠胚胎发育的技术 多是受了兔子胚胎发育研究的启发。上个世纪初小鼠作为实验模型之后，人们对小鼠生 殖方面的了解越来越多，所以哺乳动物胚胎发育研究逐渐转为用小鼠为模型。用小鼠来 研究胚胎发育，第一个难题就是怎么体外培养着床前胚胎(pre-implantation embryo )。从上个世纪四十年代末开始一直到六十年代初，人们才找到特定培养液配方，能让 着床前胚胎生存并且发育下去。大概在同一时候，英国的Anne McLauren发展了胚胎子 宫和输卵管转移的技术，使得体外培养的胚胎能够再被放回小鼠体内，然后发育成胎儿 。这两项技术的发展奠定了小鼠胚胎发育研究的基础。 在第五篇里，我介绍了着床前胚胎的发育，时间是从0到4.5 dpc(days post coitum，交配后天数)。到了4.5dpc的时候，小鼠的受精卵发育成球状的囊胚( blastocyst)结构，包括包被在外面的滋养外胚层(trophoectoderm，也叫滋养层， trophoblast)和填充在里面的内细胞群(inner cell mass)。内细胞群的细胞具有多 能性(pluripotent)的特点。多能性(pluripotent)的细胞能够发育成生物个体的绝 大部分。小鼠胚胎的结构中除了胎盘(placenta)以外，都是由 内细胞群发育而来。从在子宫的着床开始，小鼠胚胎开始进一步发育，内细胞群进一步 分化，逐渐失去多能性，可以说是走向了一条不归之路。 69 4.5dpc到6.5dpc属于着床,近着床期(implantation,peri-implantation)。这 段时间里面，胚胎已经着床，但是原肠化(gastrulation)还没有开始。着床的时候囊 胚中内细胞群的一侧与腹膜一侧的子宫内膜结合在一起，诱发子宫的蜕膜反应(见第五 篇)。前面说过，囊胚是一个三分之一满的球状结构，分为两部分，球皮称为滋养层( trophoectoderm or trophoblast)，球的填充物则是内细胞群(inner cell mass)。 着床时候囊胚的滋养层分为两部分，与内细胞群接触的部分称为极性滋养层(polar trophoblast)，与内细胞群没有接触的部分成为壁滋养层(mural trophoblast);同 时内细胞群也演化为两部分，暴露在囊胚腔(blastocoel)的一层细胞称为原始内胚层 (primitive endoderm)。如果以子宫内膜靠腹膜的方向为上，原始内胚层在绝大部分 内细胞群的下方，所以又成为下胚层(hypoblast)。内细胞群的其余部分称为原始外 胚层(primitive ectoderm)，也叫上胚层(epiblast)，或者叫胚胎外胚层( embryonic ectoderm)。这个结构名称比较混乱，不同的书用不同的名字。 着床时(4.5dpc)的囊胚还是球型结构，着床之后到了6.5dpc的时候，却逐渐形 成了一个上下(以子宫靠腹膜的方向为上)拉长了的囊状结构，有点象具有几层球皮的 橄榄球，称为卵筒(egg cylinder)。包裹整个卵筒的最外层的结构是由原始内胚层演 化而来的腔壁内胚层(parietal endoderm)和腔内内胚层(visceral endoderm)组成 的。这两个结构最终会发育为包裹小鼠胚胎的卵黄囊(yolk sac)。卵筒里层的结构分 为两部分，上半部分是由极性滋养层演化而来的胚胎外外胚层(extraembryonic ectoderm)，胚胎外外胚层上面还有一团称为外胎盘锥(ecto-placental cone)的结 构，看上去好像是卵筒戴的一顶毛绒帽子一样。这两个结构最终会发育成胎盘的一部分 。卵筒里层下半部分是前面提到的原始外胚层(primitive ectoderm)，也叫上胚层( epiblast)，只是形状不一样了。原始外胚层和胚胎外外胚层封闭起来，中间是空的， 称为前羊膜腔(pro-amniotic cavity)。原始外胚层是6.5dpc胚胎里最重要的结构， 因为最后整个胎儿都是由这个结构发育而来。 从6.5dpc开始，小鼠胚胎进入到一个十分关键的发育过程，称为原肠化( 2007-12-2 22:52 bioin 70 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十五) 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 22 22:40:54 2006), 转信 本文献给YL (十五)初现端倪 上一篇里，我提到了着床,近着床期(4.5dpc ,6.5dpc)。从6.5dpc开始一直到 7.5dpc，小鼠胚胎进入了原肠化期。由于小鼠胚胎此时出现的标志结构叫做原条( primitive streak)，这个时期又称为原条期(primitive streak stage)。原肠化的 定义非常模糊，因为不同动物原肠化具有不同的特征。简单的说，原肠化是指动物胚胎 从简单的囊状结构(囊胚，blastocyst)，经历一系列结构重组变化，演化为具有外中 内三个胚层的复杂胚胎结构。如果把胚胎发育比喻为飞机起飞的话，原肠化期之前相当 于飞机在跑道上滑行，原肠化期则相当于飞机加速，脱离地面的一刹那。原肠化期之前 的胚胎只能算是一种热身状态，原肠化期才是胚胎真正开始成型的标志。小鼠胚胎发育 中的原肠化期在显微镜下非常好分辨，因为原肠化之后的胚胎体积突然大了很多，可以 很容易的用镊子分离出来。而原肠化期之前的胚胎在受精之后的六天左右里，体积几乎 没有太大的变化，比受精卵大不了很多。所以仅仅看体积变化，就可以看出原肠化期的 重要性。正因为这个原因，发育生物学家Lewis Wolpert说过一句很著名的话“It is not birth, marriage, or death, but gastrulation, which is truly the most important time in your life”。 上一篇提到6.5dpc的小鼠胚胎看起来就像一个带了顶毛绒帽子的橄榄球。“毛绒 帽子”结构是外胎盘锥(ecto-placental cone)，位于胚胎的近端(proximal end， 也是未来的背面，dorsal)。如果去除包裹胚胎的卵黄囊(yolk sac)，胚胎的主要结 构是一个双层的囊状结构。外层是腔内内胚层(visceral endoderm)，而内层则分为 两部分，近端的一半是外胚胎外胚层(extraembryonic ectoderm)，而远端(distal ，未来的腹面，dorsal)的一半是原始外胚层(primitive ectoderm)又叫上胚层( epiblast)。原始外胚层就象一个杯子，底部是腹面(ventral)。原肠化之前，胚胎 虽然有背腹面之分，但是没有头尾之分。小鼠胚胎头尾的区分是从原肠化期原条结构的 71 形成开始的。原条(primitive streak)是原始外胚层尾部中线(与腹背轴平行)上的 一个沟形长条结构，宽度大概有十到十五个细胞，紧靠在胚胎外外胚层和原始外胚层的 交界处。原条起源于原始外胚层，但是很快向左右两边以及胚胎腹部伸展，在原始外胚 层(primitive ectoderm)和腔内内胚层(visceral endoderm)中间形成新的一层， 称为胚胎中胚层(embryonic mesoderm)。在向胚胎腹部伸展的同时，原条结构也向胚 胎背部伸展，形成一团有很多空隙的结构，叫做后羊膜皱褶(posterior amniotic fold)。这个结构继续生长变大，里面的空隙融合在一起，形成一个空腔结构， 叫做 外胚胎腔(extraembryonic coelom)。 胚胎外体腔的出现把小鼠胚胎中的前羊膜腔( pro-aminotic cavity)一分为二形成了三个空穴。从背部到腹部，依次是外胎盘腔( ectoplacental cavity)，外胚胎腔(extraembryonic coelom)和羊膜腔(amniotic cavity)。另外，在外胚胎腔(extraembryonic coelom)尾部(posterior, caudal)靠 近原条(primitive streak)的地方长出了一团囊状结构，称为尿囊(allantois)。 尿囊最终会发育成脐带(umbilical cord)和胎盘(placenta)的一部分，所以是联系 母体和胎儿重要结构。 从原肠化期开始，小鼠胚胎的结构变得比较复杂，需要看图才能完全明白。由于生 物版无法贴图，我只好提供一些互连网的资源供大家参考。这里我强烈推荐一个网站叫 做the edinburgh mouse atlas project，网址是 [url][/url] 。这个网站对于每个阶段的胚胎都有十分详细的图解，既有切面组织结构，又有三维胚胎照片，还用不同的着色来标明胚胎的各个结构。可以说是一目了然。7.5dpc胚胎图解的网页是 http: //genex.hgu.mrc.ac.uk/Atlas/SBFrames.html?11 。 原肠化期比较短暂，到了7.5dpc 就结束了。从7.5dpc开始一直到12.5dpc，胚胎发 育进入器官形成期(organogenesis stage)。 2007-12-2 22:52 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十六) 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 28 03:24:30 2006), 转信 本文献给YL 72 (十六)O Infundibulum, Where Art Thou? 上一篇介绍了胚胎发育的原肠化期(6.5dpc~7.5dpc)。在此之前，胚胎并没有成 形，甚至看不出来头尾。7.5dpc之后，胚胎进入器官形成期(organogenesis stage) 。这一时期中，最早开始发育的是神经系统，前方外胚层衍生出神经板(neural plate )结构，神经板再演化为神经管(neural tube)最后形成中枢神经系统，包括脑和脊 椎。神经系统的发育开始之后，整个胚胎的躯体规划已经成型，可以看出头尾。与此同 时心脏和循环系统也开始发育，随之而来的是身体其他内脏器官的发育。 终于介绍完六月七号第一天课程的实验和理论课程。现在我来介绍第二天的实验课 程。第六篇和第八篇里面我分别介绍了子宫冲洗和胚胎子宫转移两种技术。子宫冲洗的 目的是分离3.5dpc之后，处于囊胚期的着床前胚胎。但是如果要分离3.5dpc之前的胚胎 ，比如单纯的受精卵，或者桑葚胚，又该怎么办呢,3.5dpc之前的胚胎还在输卵管( oviduct)，所以必须用一种叫输卵管冲洗(oviduct flushing)的方法把胚胎分离出 来。六月七号第一天课程做子宫冲洗实验的时候，我觉得已经难到极限了，觉得自己只 能勉强做出来。眼巴巴的等到第二天，以为实验会轻松一点，结果完全出乎意料。这一 天的实验难得让我要吐血，第一天的实验在我眼里突然变得十分简单了。第一个非常难 的实验就是这个输卵管冲洗。 同是冲洗，为什么输卵管冲洗就比子宫冲洗难很多呢,原因很简单，输卵管比子 宫小了很多。输卵管直径只有子宫直径的三四分之一的样子，只能勉强容下一个30 gauge的针头。输卵管的一端和子宫联在一起，很自然的想法是把针头伸入输卵管的子 宫接头然后进行冲洗。但是问题没这么简单，因为这个接口有防止倒灌的结构，为了防 止进入子宫的胚胎回到输卵管中，所以这样冲洗液进不到输卵管里面。能不能把输卵管 一分为二，把针头伸入断开的输卵管进行冲洗呢,遗憾的是，这基本是是不可能的，因 为输卵管太细了，针头从断口处很难找到管道伸入，再加上输卵管组织很脆弱，往往针 头把输卵管戳烂了也进不了管口。这样一来只能冲洗输卵管的另一个开口，叫做漏斗口 (infundibulum)。输卵管和卵巢没有连在一起，卵巢排出的卵子通过漏斗口进入输卵 管。漏斗口比输卵管稍粗一些，所以30gauge的针头可以方便的插入 73 2007-12-2 22:52 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十七) 发信站: BBS 未名空间站 (Wed Aug 30 21:46:05 2006), 转信 本文献给YL (十七)不可能完成的任务 输卵管冲洗(oviduct flushing)是第二天实验课中的第一个实验。用这种办 法分离了0.5dpc到3.5dpc胚胎之后，下一个问题就是怎么把这些胚胎放回到小鼠体内， 使它们正常发育下去。事实上有两种办法，一种是体外培养，让胚胎自己长到囊胚的阶 段，然后放回到小鼠的子宫里，也就是胚胎子宫转移的方法(Uterine Transfer)。这 种方法比较简单，但是胚胎在体外培养的条件下最后不一定能正常发育，所以最好的办 法是把这些胚胎转移到输卵管里面。这种方法叫做胚胎输卵管转移(Oviduct Transfer )。输卵管转移是胚胎发育学最难做的一个手术，非常需要技巧。但是这个技巧又很重 要，比如要做转基因小鼠，把注射了外源DNA受精卵放回到假孕的小鼠体内发育，就需 要用这个技术。第二天以及接下来的几天中，我反复试了多次，都没有做出来。沮丧之 余，我向Anne McLauren老奶奶讨教，结果她人家说，实在是没有什么窍门，反复练习 很多次自然就会了。 输卵管转移中代孕的小鼠必须是0.5dpc的假, 2007-12-2 22:53 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十八) 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Sep 7 14:28:23 2006), 转信 本文献给YL (十八)选择之苦---P.G.D 74 六月八号上午作报告的教授是德国马普研究所的Davor Solter。他主要介绍着床 前胚胎发育(pre-implantation development)。提到着床前胚胎发育，就必须从排卵 (ovulation)开始讲起。雌鼠到六个星期大的时候，就可以生育了。这个时候雌鼠每 个卵巢(ovary)含有上万个卵细胞(oocyte)。每个卵细胞都被一个叫卵泡( follicle)的结构包裹。排卵(ovulation)就是卵细胞脱离卵泡的束缚的过程。雌鼠 自发排卵是周期性，大概每四天有一次，与发情周期(estrus)吻合。排卵过程由大脑 垂体(pituitary)分泌的促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体 生成素(luteinizing hormone，LH)控制。首先，在促卵泡激素刺激下，卵泡出现积 水，涨大的现象，并逐步移向卵巢的周边部位，同时在卵泡内部，卵泡细胞逐渐和卵细 胞分开。这个时候的卵泡结构称为graafian 卵泡，而卵细胞是个四倍体，还没有进入 减数分裂。然后，黄体生成素的水平突然升高，卵细胞受到刺激之后，核膜降解，染色 体和纺锤体逐渐形成，并移向卵细胞的周边部位。然后就是第一次减数分裂。这个分裂 中，细胞质的分配很不平衡。一组同源染色体和一点点细胞质被排挤出卵细胞，形成一 个很小的圆点结构，称为极体(polar body )。极体起初附着在卵细胞上，之后则会逐 渐消融掉。 而此时，包被在卵细胞外面的卵泡破裂，卵细胞被释放出来，进入输卵管 。这个卵细胞剩余的染色体保持在细胞分裂中期(metaphase)的状态，暂时不进行第 二次减数分裂，等待受精。精子的入侵，激活了卵子进行第二次减数分裂，形成第二个 极体。卵子剩余的染色体，解聚之后形成雌性前核(female pronucleus);而精子的 DNA形成雄性前核(male pronucleus)。做转基因小鼠的最关键一步就是把DNA显微注 射到前核结构中，由于雄性前核相比之下大一点，一般是注射到雄性前核里面。两个前 核逐渐相聚交融在一起，很快进入第一轮DNA合成。然后受精卵分裂成两个细胞。 在第五篇中，我提到过受精卵不断分裂，从二细胞期，到四细胞期，一直到八细 胞期，细胞质并不增加，所以胚胎大小没有增加。在八细胞期之前，细胞并没有紧密的 贴在一起，但是之后细胞表面开始表达一系列细胞粘连分子，使得所有细胞紧贴在一起 ，形成桑葚胚(morula)的结构。 2007-12-2 22:53 bioin 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(十九) 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 11 02:59:49 2006), 转信 75 本文献给YL (十九)崭新的世界 六月八号晚上的讲座是由来自Texas MD Anderson Cancer Center的Richard Behringer作的，主题是Transgenics and insertional mutants。Richard在做基因敲 除和转基因小鼠方面非常有经验，作这个报告再合适不过了。提到Richard Behringer ，我这里向做基因敲除的同学推荐一本他参与编写的书，“Mouse Phenotypes: A Handbook of Mutation Analysis”。这本书写得极其清楚易懂，既涵盖了基因敲除老 鼠的要点和细节，又详细解释了如何对突变体进行表型分析。 言归正传，先谈谈转基因小鼠的历史背景吧。不夸张的讲，转基因小鼠技术的出 现，使得以小鼠为模型的研究进入到一个崭新的世界。有人甚至认为转基因小鼠技术的 出现是人类文明发展的一个里程碑。转基因小鼠的实验技术可以追溯到1966年，加州大 学旧金山分校的Teh Ping Lin在Science 杂志上发表文章，报道说可以显微注射牛丙种 球蛋白溶液到小鼠受精卵的前核(pronuclei)里，如果把这样的受精卵放回到代孕小 鼠体内，还能正常发育成胎儿。这个实验可谓是非常超前，因为六十年代还没有重组 DNA技术，但是正是这个实验证明了技术上向小鼠胚胎引入外源物质的可行性。在那个 时候看，把蛋白质溶液打到小鼠受精卵里，似乎是一个毫无意义的实验，好在Science 还比较有远见，接受了这篇文章。又过了八年时间，MIT的Jaenisch实验室把提纯的 SV40 DNA注射到小鼠囊胚(blastocyst)的空腔里，最后得到的小鼠体细胞组织里面含 有SV40的DNA序列。这是第一个向小鼠胚胎中导入外源DNA的例子。又过了两年，1976年 ，同样这个实验室发现如果用反转录病毒感染四细胞或者八细胞期的小鼠胚胎，病毒的 基因组可以整合到小鼠的生殖细胞里。用病毒来向小鼠胚胎引入外源DNA的办法并没有 很普及。又过了四年时间，到了1980年，Ralph Brinster和同事把信使RNA注射到小鼠 受精卵里，发现可以翻译成蛋白质。随后耶鲁大学的Jon Gordon把外源DNA注射到小鼠 受精卵的前核(pronuclei)中，并发现发育出来的小鼠体细胞组织中带有这个外源的 DNA。转基因小鼠技术到此时才正式成形。又过了一年，又有好几个实验室用同样的办 76 法将外源DNA整合到小鼠基因组里。有的实验室还发现整合到小鼠的外源基因可以遗传 到下一代，说明小鼠的生殖细胞中也整合了外源基因。事实上，把外源基因导入动物并 不希奇，但如果能传给后代，就很不容易了。另外，不为人知的是，动物转基因技术首 先是在小鼠身上实现的。转基因小鼠技术的出现是一件大事，这也是为什么Watson建议 在冷泉港开设小鼠课程的原因。这个小鼠课程最开始设立，就是为了传授转基因中的核 心技术，前核显微注射(pronuclear injection)。 前核显微注射(pronuclear injection)的具体操作过程我会在以后的篇章中介 绍。上一篇讲小鼠胚胎的着床前发育，提到卵子刚受精的时候，来自卵子和精子的DNA 分别解聚，但还没有融合在一起，而是分离的两个小核，称为前核(pronuclei)。前 核显微注射就是把线性的DNA注射其中一个前核中，使之整合到小鼠基因组中。Richard Behringer讲了很多转基因小鼠的技术细节和窍门。随便举几个例子:(,)只有线性 的DNA才能整合到基因组里，但有些时候如果只希望在受精卵里瞬时表达一个基因，就 可以注射supercoil DNA;(,)注射进入前核的DNA浓度不能太高，理想浓度是,到, ng/ml，而用来稀释DNA的缓冲液是10mM Tris pH7.4, 0.1-0.3mM EDTA;(,)有人试 过注射到细胞质里，问题是效率不高，且受精卵容易死。同时远系小鼠的受精卵做前核 显微注射存活率较高。(,)注射进入的DNA最好是genomic sequence，因为cDNA表达 得不好。 必须强调的是，转基因的过程，外源DNA的整合位点是随机的。由于同源重组的关 系，理论上可以直接用前核显微注射的办法来做基因敲除。但问题是同源重组效率非常 低，随机整合的几率要比同源重组几率大很多。Richard Behringer提到有人这么试过 ，显微注射了一万个受精卵，有将近两千个顺利发育成小鼠。其中只有五百只是转基因 小鼠，而只有一只是定点同源重组的小鼠～ 更多的技术细节，大家可以参考Manipulating Mouse Embryo: a laboratory manual, third edition。 ※ 来源:?BBS 未名空间站 mitbbs.com?[FROM: 69.242.] 发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology 77 标 题: 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记(二十) 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Sep 21 12:25:11 2006), 转信 本文献给YL (二十)另一个自己 Lydia Fairchild是有两个孩子的单亲妈妈，怀上第三个孩子之后和男朋友分了 手。生活没有着落，又要养活两个孩子和照顾尚在襁褓中的胎儿，Lydia被逼无奈只得 申请政府资助。根据政府规定，申请此类福利，必须提供DNA证据证明小孩是申请者亲 生的。Lydia和她的前男友很快提供了身体的组织样品。一切都似乎很顺利，可是到了 2002年的一天，社会福利部门的官员突然打电话给Lydia，要她立即去面谈。在这次面 谈中，Lydia得知了一条她怎么也无法相信的消息，DNA检测证实Lydia前男朋友是她孩 子的父亲，但是Lydia却不是两个孩子的母亲～资助申请自然是被拒绝了，更糟的是社 会福利部门怀疑Lydia是一个代孕妈妈，试图骗取联邦的福利资助，于是起诉了Lydia。 而审理此案的法官也准备剥夺Lydia对两个小孩的监护权。眼看山穷水尽，Lydia觉得无 法洗清自己，绝望之余开始和家里人商量怎么带着孩子藏起来。就在这个紧要关头， Lydia案子的检察官在新英格兰医学杂志上的一篇文章中上找到了答案。这个答案也是 小鼠胚胎课第三天早上讲座的核心内容---chimera。 Chimera是古希腊神话中的一个狮头羊身蛇尾的怪兽，在生物学中指嵌合体。嵌 合体是指一个机体拥有来自不同胚胎的细胞和组织。根据这个定义，经过器官移植的病 人就可以认为是嵌合体。Lydia也是一个嵌合体，只是她的情况要复杂很多，医学中称 之为四配子嵌合体(tetragametic chimerism)。这种嵌合体是这样形成的，首先两个 精子分别入侵两个卵子，形成两个受精卵。通常情况下两个受精卵会独立的发育下去， 形成一对双胞胎。但是在非常罕见的情况下，两个胚胎会在发育的早期融合在一起，而 最后只发育成一个胎儿。由于两个胚胎的基因型会有差别，chimera个体一部分组织会 继承一个胚胎的基因，而剩余组织则会继承另一个胚胎的基因。两个胚胎都有全能性， 可以发育成任何一种组织器官，所以理想情况下，嵌合体任何一种组织器官都应该是两 种胚胎分化细胞的均匀混合体。但实际情况往往复杂一些，有的组织只来源于两个胚胎 中的一个。Lydia小孩的基因型代表了她生殖细胞的基因型。而Lydia生殖细胞与DNA检 78 测所用的样品(血样或者口腔黏膜)来源于不同胚胎，基因型不一样，所以检测结果就 不符合。最后证明Lydia确实是嵌合体的一个关键证据，是从她子宫颈分离出来的组织 样品和她孩子的基因型是一样的。真相到此大白，Lydia再也不用担心会失去自己孩子 的监护权了。由于四配子嵌合体发生的几率小而又小，Lydia Fairchild的案例引起了 媒体的广泛关注，甚至还被拍成了纪录片。 在小鼠胚胎发育的研究中，嵌合体是一个极其强大的研究手段。小鼠课程第三天 早上，来自加拿大hospital for sick children的Janet Rossant作了“chimera analysis”的讲座。上个世纪五十年年代末，小鼠早期胚胎的体外培养技术已经非常成 熟，小鼠胚胎也能通过子宫转移和输卵管转移的方法在代孕雌鼠中发育成胎儿。有了这 些技术手段之后，小鼠胚胎学家们开始尝试用各种方法修饰和改造小鼠胚胎，看这些变 化对小鼠发育有何影响，从而推断出小鼠胚胎发育的原理。构建嵌合体胚胎是其中最重 要的方法之一。第一个小鼠嵌合体胚胎是由一个波兰人Kristof Tarkowski在1961年做 出来的。他把两个桑葚胚期小鼠胚胎的透明带(zona pellucida)弄破，然后取出胚胎 ，使它们相互接触。体外培养之后，这两个胚胎会融合形成一个胚胎，并重新形成透明 带。用这种方法构建的胚胎称为团聚嵌合体(aggregation chimera)。把这个嵌合体 胚胎放入代孕小鼠的子宫，最终能发育外观和生理都正常的幼鼠。这个思路简单的实验 ，有力的证明了哺乳动物早期胚胎的可塑性，为后来培养出胚胎干细胞以及构建基因剔 除老鼠，打下了一个坚实的基础。因为这个重大贡献，Tarkowski和Anne Mclauren一道 获得了2002年的日本科技大奖。 除了可以用Tarkowski的团聚方法构建嵌合体之外，有人发现如果把一个囊胚的 细胞显微注射到另一个囊胚里，也可以形成嵌合体。上个世纪六七十年代的时候，胚胎 发育中细胞世系的研究是个难题，通过囊胚注射构建嵌合体的方法大大方便了这方面的 研究。嵌合体研究中最近的一次突破是人们发现显微注射胚胎干细胞到囊胚中，也可以 产生嵌合体。而且胚胎干细胞可以分化为小鼠胚体(embryo proper )的各个组织器官 。比较重要的是，胚胎干细胞也可以分化为生殖细胞，所以嵌合体的一部分后代会继承 这些胚胎干细胞的DNA，包括这些DNA中的突变。基因剔除小鼠就是用这种方法培育出来 79 的。 80