链霉菌原生质体的制备

链霉菌原生质体的制备链霉菌原生质体的制备透压极为敏感的球质体, 最外层是裸露的细胞物及细胞器缺损少, 修复能力高, 再生效果好。质膜, 失去了细胞壁的原生质体, 染色体但由于菌种不同仍然存在差异。如吸水链霉菌DN A 在诱变剂作用下, 更易引起死亡突变, 敏感性提菌株及庆丰链霉菌的菌井冈变种的4 201 V A S高。菌种的敏感性越高, 诱发突变的机会越大。株, 以对数中期为好, 再生率为静止期的 40, 因此, 用原生质体代替孢子、菌丝细胞作为诱变 50 倍。而菌株则以对数后期为好, 再生率 2 V A 育种的材...

链霉菌原生质体的制备透压极为敏感的球质体, 最外层是裸露的细胞物及细胞器缺损少, 修复能力高, 再生效果好。质膜, 失去了细胞壁的原生质体, 染色体但由于菌种不同仍然存在差异。如吸水链霉菌DN A 在诱变剂作用下, 更易引起死亡突变, 敏感性提菌株及庆丰链霉菌的菌井冈变种的4 201 V A S高。菌种的敏感性越高, 诱发突变的机会越大。株, 以对数中期为好, 再生率为静止期的 40, 因此, 用原生质体代替孢子、菌丝细胞作为诱变 50 倍。而菌株则以对数后期为好, 再生率 2 V A 育种的材料 , 能显著提高诱发突变的频率, 由于是静止期的 24 倍。 ( ) 2菌丝的预处理链霉菌的破壁一般都去除了细胞壁, 原生质体膜易于融合, 即使没有接合、转化和转导等遗传系统也能发生基因组采用溶菌酶。有些链霉菌种对溶菌酶敏感 , 如的融合重组。庆丰链霉菌, 菌丝培养时不需经过预处理, 即可直接制备出原生质体。但很多菌种对溶菌酶不用原生质体融合及诱变进行育种, 具有用孢子、菌丝的细胞融合、诱变育种不可替代的优敏感, 菌丝必须经过预处理。方法有:越性。 ? 在培养基中加入 0. 5%, 4% 的甘氨酸。原生质体制备和再生的一般程序: 菌丝培具体浓度随菌种而异。甘氨酸可以代替2丙氨 D 养?菌丝悬液?离心得到菌丝沉淀?用蔗糖液酸掺入细胞壁, 破坏细胞壁肽聚糖短肽间的交洗涤两次?加酶液酶解一定时间得到原生质体联, 引起细胞壁结构的不完整以便于酶解脱壁。悬液?原生质体的分离和离心收集?用高 ? 甘氨酸在增加菌丝对酶的敏感性的同时, 也P 渗液重新悬浮原生质体?原生质体再生抑制菌丝的生长, 使菌丝量锐减。因此为了减少 1 原生质体的制备甘氨酸对菌丝生长的抑制作用, 培养基内加甘 (1. 1 菌丝氨酸的量可酌情减少, 并同时增加过量蔗糖可 ( ) ) 能干扰细胞的正常代谢, 也得到相同效果。 ? 1菌丝的培养时间处于不同生长时期分两次培养菌丝, 使得菌丝在新鲜培养基中能的菌体, 经过处理后都可以形成原生质体, 但其活性差异很大。处于稳定期和衰老期的菌体, 由继续生长, 避免菌丝断裂及长出孢子。即在增加于菌体老化生理活性低, 此时期制备的原生质菌丝量的同时, 使得菌丝继续处于对数生长期, 体大小差异很大, 异质性明显, 再生能力差。而提高了溶菌效率。 () 对数期包括对数前、中、后期的菌丝各部分生 () 由北京教育科学研究院基础教育教学研究中心供稿生物学通报 1998 年第 33 卷第 1 期 — 40 — 1. 2 酶, 有关酶的最佳一些菌种原生质体制备中 ( ) 1酶类对于链霉菌, 用 2乙酰胞壁酸条件列表如下:N 酶来制备原生质体, 效果比用溶菌酶好。据报道菌种酶酶浓度酶解温度酶解时间用溶菌酶和消色肽酶混合处理吸水链霉菌细胞弗氏链霉菌溶菌酶1, 1. 5? ƒ3260m in m gm l 能明显刺激原生质体的形成。对于不同菌株, 可红霉素链霉菌 90 同上2m gƒm l 37?m in 变铅青链霉菌有不同的选择。同上 160ƒm gm l 30?m in 庆丰链霉菌同上 490ƒ () m gm l m in 2酶浓度一般来说, 在一定范围内, 随 37? 溶菌酶+酶量增加, 原生质体化加速, 但最终形成的原生龟裂链霉菌2m gƒm l 30?70m in 消色肽酶质体量变化不大。可能是过大的酶量易使菌体凝集, 反倒难于原生质体化了。因为溶菌酶往往 1. 3 菌体洗液和原生质体制备液( 含有一些对原生质体有害酶类过氧化物酶、核 () 1菌体洗液链霉菌菌体洗液一般都用) 糖核酸酶等, 随酶量增加, 杂酶相应增多, 影响 10. 3% 的蔗糖。通过洗涤可分散菌体并洗净菌原生质体的活性。而且酶量过大必然导致脱壁体表面附着的培养基成分, 以增加酶实际作用太彻底, 原生质体失去了合成细胞壁的引物, 造表面积。酶解前对菌体洗涤两次, 可促进菌体发成原生质体再生率的降低。过低的酶量也会影生质壁分离, 以利于原生质体的释放。响亲株的原生质体化。因此有人建议以使原生 () 2原生质体制备液链霉菌属的原生质质体形成率和再生率之积达最大时的浓度为最体制备液, 多采用含有稳定原生质体的蔗糖、佳酶浓度。 2+ 2+ 、。作为渗透压稳定剂的蔗糖一般采 C aM g() 3酶解温度温度对酶解作用有双重影用 0. 3, 0. 5, 可以使球形的原生质体不至于 M 响, 一方面随温度升高, 酶解反应速度加快, 另膨胀而破裂。也可用 0. 8 的琥珀酸钠来代替M一方面, 随温度增加, 酶易钝化。另外, 人们还发 2+ 2+ 蔗糖。、的作用机理, 主要通过维系膜 C aM g现温度过高, 虽可提高原生质体制备率, 但可能的完整, 来实现原生质体的稳定性与活性。原生会影响原生质体本身的或酶系统的活 DN A 质体制备液与再生培养基必须是相似的, 才能性。温度过低, 势必要延长酶解时间来获得大量维持原生质体的稳定, 有利于再生。的原生质体, 从而增加了酶对早先形成的原生除上述因素外, 菌体生长的培养基成分、培质体的的毒害作用。两者都会影响原生质体的养方式, 酶解时的、离子强度等对原生质体 pH再生率。因此在选择最佳酶解温度时, 除了要考的释放均有影响。虑酶的最适温度外, 还要以原生质体再生率校 2 原生质体的收集正。一般地说, 酶解温度应控制在 28, 37?。原生质体的收集可用如下方法: 差速离心、() 4酶解时间随着酶解时间的延长, 菌体棉花过滤、孔径 5的滤膜过滤、0 号滤纸过 Λm 去壁程度愈完全, 当酶解到一定时间后, 绝大多滤、砂芯漏斗过滤。若过滤一次效果不好, 可 2 G 数的菌体细胞均已形成原生质体, 此时若继续重复多次以得到较纯的原生质体。所有这些方进行酶解, 酶便会对原生质体发生作用而使细 ( ) 法都注意到: 1原生质体与菌体的有效分离;胞质膜受到损伤, 造成大量的原生质体的破坏, () 2保持原生质体的完整。分离得到的原生质体从而使原生质体失活, 因此, 须选择合适的酶解离心沉淀后重悬于高渗液中。时间, 且酶解后必须立即离心除去酶液以消除酶对原生质体的进一步作用。生物学通报1998 年第 33 卷第 1 期 — 41 —

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