单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研究进展

单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研究进展 单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研 究进展 第42卷第9期 2011年9月 东北农业大学 JournalofNortheastAgriculturalUniversity 42(9):7,11 Sep.2011 单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研究进展 齐永华,董永军,宁红梅,赵坤 (河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003) 摘要:单链抗体(Singlechainvariablefragment,seFv)是目前最受关注的基因重组抗 体分子,是由重链可变 区和轻链可变区以一个柔性肽段连接而成的最小抗体片段,它较好的保持着原代 抗体的亲和特性,故而在农兽药 残留检测方面具有潜在的巨大应用价值.文章综述了单链抗体技术,噬茵体展示和 核糖体展示技术以及目前单链 抗体在农兽药残留免疫分析方面应用的一些新进展. 关键词:单链抗体;噬茵体展示;核糖体展示;农药和兽药 9369(20l1)09—0007—05 中图分类号:Q789文献标志码:A文章编号:1005— DevelopmentofsinglechainFvtechnologyfordeterminationofpesti- cidesandveterinarydrugs/QIYonghua.DONG~ongjun,NINGHongmei,ZHAOKun(De- partmentofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,XinxiangHenan45 3003. China) Abstract:0Beofthemostremarkablemoleculesofrecombinantantibodiesissinglechain variablefragment(scFv).scFv,madebytheassociationofthevariableheavyandlightchainre gion, keepthebindingpropertiesofclassicalantibody.scFvtechnologyhasbeenappliedtothedeter mination ofpesticidesandveterinarydrugsinenvironmentandfoodsamples.Thepapersummarizesth e principleanddevelopmentofscFv,phagedisplayandribosomedisplaytechnologyandtheira pplication inthescreeningdeterminationofpesticidesandveterinarydrugs. Keywords:scFv;phagedisplay;ribosomedisplay;pesticidesandveterinarydrugs 自1975年Kohler和Milstein创立杂交瘤单克隆 抗体技术以来nI,大量可结合蛋白质,碳水化合 物,核酸和半抗原的单克隆抗体在免疫检测领域 中就显示出其独特的优势并发挥着巨大作用.基 于抗原抗体特异性识别原理的免疫分析技术因其 操作简便,快捷,灵敏度高,越来越多的应用于 农兽药残留的快速监测.但是随着应用农兽药种 类和数目的不断增加,造成了目前农兽药残留现 状的复杂性和不确定性,给监测工作带来了前所 未有的挑战.基于单克隆抗体的传统免疫分析技 术一次仅检测单个农兽药的方式已经不能满足Et 益增多的大量样本快速,及时,高效检测的要 求.提高免疫分析检测的工作效率,缩短检测时间 和简化操作步骤是其未来发展的主要趋势,因此发 展兽药的快速多残留检测,建立一次分析可以检测 多种同类或不同类农兽药的免疫分析 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 是当前研 究的热点和重点.而农兽药广谱性抗体是建立多残 留免疫分析的关键试剂,其性质决定着免疫分析的 灵敏度和特异性,是目前制约多残留免疫技术进一 步发展的主要瓶颈.20世纪80年代初出现的基因 重组抗体技术为广谱性抗体制备提供了一条崭新的 途径.在基因重组抗体中,目前应用最为广泛的当 属单链抗体(Singlechainvariablefragment,scFv). 本文对单链抗体的研究进展及其在农兽药残留分析 收稿日期:2010—10—10 基金项目:国家自然科学基金重点项目(30830082);河南科技学院高层次人才科研启动项目(2010011) 作者简介:齐永华(1977一),男,副教授,博士,研究方向为兽医药理与毒理学及食品 安全 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 研究.E-mail:qiyonghua2008@126.com +通讯作者:赵坤,教授,博士生导师,研究方向为预防兽医学.E— mail:zhaokuu@163.com 东北农业大学第42卷 方面的应用情况进行简单综述. 1单链抗体技术 scFv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小 功能片段的一种新型重组蛋白,由重链可变区 (V)和轻链可变区(V)通过一段约15—25个氨基酸 残基构成的弹性短肽(Linker)以非共价键相连而 成,分子质量约为完整抗体分子的1/6,具有单一抗 原结合位点,分子质量小,组织穿透力强,体内清 除快,免疫原性低,易于在大肠杆菌中表达和进行 基因进化等特点伫,l.单链抗体技术基本原理:从B 淋巴细胞中提取总RNA,经RT—PCR分别扩增出 抗体的V和V编码基因,再用Linker将两者连接 成scFv基因,然后通过表达系统进行表达. 1.1单链抗体的构建 scFv基因主要来源于人或动物的外周血淋巴细 胞,骨髓,脾细胞和杂交瘤细胞等.即从中抽提总 RNA,用纯化的mRNA或细胞总RNA逆转录成 eDNA,再以此为模板扩增出和基因.抗体的 可变区由超变区和骨架区两部分组成,每个V和 V的可变区包含3个超变区(CDR),它们共同构成 抗原的结合位点,也决定了每种抗体的特异性,其 余结构比较保守的可变区,呈B片层排列,起到 连接超变区的骨架作用,称骨架区(FR).在获取 可变区基因时,引物的设计可根据FR和FR的碱 基组成和顺序分别合成扩增和基因的引物. 在基因设计中应尽可能保持亲本抗体可变区序列的 完整性和真实性.此外,scFv基因也可通过基因合 成获得,或者由生物来源及人工合成基因共同构 建. scFv中的V和V是由柔性肽段Linker连在一 起的,其取向有两种方式:V一Linker-V或 VL-Linker—V,两种构建方式对scFv的特异性和亲 和力无明显影响,但大肠杆菌分泌表达情况不同. 此外,Linker对scFv的亲和力有重要影响,它承担 着与CL和CH稳定作用相同的功能,使V和V自 由折叠,从而维持V和V间的构象.Linker长度 及性质应不干扰V和V.的立体折叠,并且不对抗原 结合部位造成妨碍.Linker长度必须以不干扰正常 功能区结构或功能区间的接触为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .一般Linker 不应过短,至少含有10个氨基酸,过短可能干扰 V和V的相互作用;接头亦不应过长,以免影响 抗原抗体结合.目前应用最为广泛的Linker是重复 三次排列组合的4个甘氨酸和1个丝氨酸 ((Gly,Ser),)的15肽序列州. 在已知亲本抗体可变区DNA基因的基础上, scFv的构建目前多可采用基因拼接方法,此法有两 种实现形式,即一种是将Linker设计在表达载体 上,两端各引入限制性内切酶位点供V和V的插 入;另一种是重叠延伸拼接法(Splicingbyoverlap extension,SOE—PCR)[51,即将Linker直接设计在扩 增V,V的引物中,并使连接两者的引物有l5个 碱基以上的互补序列,将V和V扩增产物混合, 经变性,复性及DNA聚合酶催化的延伸反应,V 和v通过所设计的互补序列,互为引物及模板合 成scFv,再以Vv两端引物进行PCR扩增,即 可得到完整的单链抗体,此法简单易行,不需要在 接头两端设计内切酶位点而引人不必要的氨基酸残 基. 1.2单链抗体的表达 目前单链抗体主要在原核表达系统E.coli中进 行表达.大肠杆菌生长快速,易于操作,转化和转 导效率高,可在短时间内大规模地生产抗体蛋白, 便于纯化,分析和应用,而且携带外源DNA的大 肠杆菌的转移仅需最少量的DNA,应用大肠杆菌 的抗体工程相对便宜.然而,大肠杆菌不能对 重组抗体进行翻译后的糖基化修饰,具有一定的局 限性,但目前尚没有证据表明糖基化与抗原结合能 力有直接关系.大肠杆菌表达seFv主要有两种形 式:一种是表达为包涵体或非包涵体的不可溶蛋 白,表达产量高,可达菌体蛋白的5%,30%,但产 生的蛋白常常没有活性,需经体外溶解,复性,重 新折叠,色谱纯化等许多步骤,方可获得有活性的 单链抗体嘲;另一种是分泌性表达,即在信号肽序 列的指导下,scFv分泌到周质腔或培养液中,并完 成二硫键的形成和肽链折叠,成为有活性的可溶性 表达产物.后者可直接表达出有活性的seFv,但产 量低,每升仅含数毫克19叫. 另外,scFv亦可在真核表达系统中进行表达. 由真核细胞表达而形成的抗体分子与天然蛋白质一 样能形成链间和链内二硫键,维持正确的蛋白构象 以及翻译后糖基化加工,并分泌到细胞外,成为功 能性抗体分子.目前,用于表达单链抗体的真核细 胞主要有酵母细胞,COS细胞,CHO细胞,植物 第9期齐永华等:单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研究进展?9? 细胞等""】o 2单链抗体库技术 单链抗体库技术是继杂交瘤技术之后,在抗 体研究领域中出现的又一重大进展.该技术的产 生基于三项技术的发展:反转录PCR扩增全套免 疫球蛋白可变区基因,大肠杆菌表达分泌功能性 免疫球蛋白分子片段的成功,以及噬菌体表面表 达技术的建立.其主要步骤如下:?从免疫或未 免疫的生物细胞中分离抗体可变区基因;?PCR 扩增抗体基因片段,随机克隆人相应载体,从而 形成组合文库;?转化细菌,表达产物通过多轮抗 原亲和吸附,最终筛选出特异性抗体片段.该项 技术的根本优势在于有效的实现了基因型和表型 的连接,从而使单链抗体基因的人工体外进化和 亲和成熟得以实现,在生物体外即可获得具有良 好生物学活性的表达产物.目前,单链抗体库技 术的发展非常迅速,在抗体表达和展示手段上, 除了较为成熟的噬菌体展示技术和核糖体展示技 术外,还有细菌展示,酵母展示,质粒展示和 mRNA表面展示等多种新型技术".本文主要阐述 目前较为成熟的噬菌体展示和核糖体展示技术. 2.1噬菌体展示抗体库技术 Smith等于1985年将人工合成的多肽基因插人 噬菌体外周蛋白的基因中,并成功地将合成的多 肽以多肽一外周蛋白融合的形式表达到噬菌体的 表面,这就是噬菌体表面展示技术(Phagedisplay) 的开始n1.该技术的基础是把外源多肽或蛋白和噬 菌体的某种外壳蛋白融合表达于噬菌体表面,一 方面,外源多肽或蛋白被展示于噬菌体表面,具有 空间上的可接近性;另一方面,噬菌体壳内具有 外源多肽或蛋白的编码序列,由此建立了表型和 基因型的联系,便于进行大规模的有效筛选和体 外进化. 噬菌体展示技术是一个极为有效的筛选体 系,它将序列不相同的一组多样化的蛋白或肽链 表达到噬菌体表面即可得到一个基因文库,如通过 随机合成制备的短肽库,利用其表型与基因型的统 一 以及其易于扩增的特性,可很容易地从基因文 库筛选出与某种靶分子具有特异结合能力的克 隆.将文库与固相化的靶分子一起温育,表达有 靶分子配体的噬菌体颗粒就会结合于固相,洗去 游离的噬菌体颗粒,将结合于固相的噬菌体洗脱 下来,感染宿主菌进行扩增,可使特异性菌体得到 100,1000倍的富集.然后再重复这一过程.这种 "吸附一洗脱一扩增"的富集过程具有显而易见的优 越性:简便易行,省时省力,一轮筛选1—2d即可 完成;筛选能力极强,无容量限制,足以应付目前 技术所能产生的库容;可直接得到特异克隆所含 有的DNA,便于进一步的基因操作.噬菌体展示 技术不但可用来筛选针对任何靶标的亲和性多肽, 而且能够用来分析蛋白质间相互作用n. 随着分子生物学技术的发展,20世纪9O年代 初,噬菌体展示技术应用到抗体基因的克隆和表 达,它将编码抗体分子片段的基因与噬菌体外壳 蛋白基因末端融合,使表达的抗体附着在噬菌体颗 粒表面成熟的衣壳蛋白上,从而形成噬菌体抗体文 库.它将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因 文库,抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的 筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术, 成为一个非常强有力的抗体开发工具.这一技术 的成功彻底改变了抗体制备的传统途径,给抗体 基因的筛选工作带来了革命性的变革,使抗体技 术进入到了基因工程抗体时代. 噬菌体展示抗体库技术采用固相化抗原经"亲 和吸附一洗脱一扩增"数个循环,可方便,高效地筛 选出特异性好,亲和力强的噬菌体抗体,含有特 异性抗体基因的噬菌体可以直接感染表达细胞进 行大量生产,也可对获得的抗体基因进行突变改 造以进一步提高其特异性和亲和性.该技术的优 点是将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕 过杂交瘤技术,不需要复杂的基因工程技术;抗 体基因筛选的范围广;技术稳定,可靠,生产周 期短;可规模化生产;适用范围广,既可用于抗 体制备,也适用于其他蛋白如激素,酶,药物, 随机多肽等的生产"91. 2.2核糖体展示抗体库技术(Ribosomedisplay) 在噬菌体展示技术发展的基础上,近年来, 一 种新的完全不依赖于细胞的新技术一核糖体展示 技术日趋成熟,其文库容量不受细胞转染效率的 影响,文库的多样性和筛选效率得到大大提高,显 示出诱人的应用前景. 核糖体展示技术是20世纪90年代由Pliickthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来 东北农业大学第42卷 的一种完全在体外利用功能性蛋白相互作用进行筛 选的新技术,它将正确折叠的蛋白及其mRNA同时 结合在核糖体上,形成mRNA一核糖体一蛋白质三聚 体,使目的蛋白的基因型和表型联系起来[2ol.核糖 体展示技术基本原理是:通过PCR扩增目的基因 的cDNA文库,同时引入1_7启动子,核糖体结合位 点及茎环结构,将其转录成mRNA,在无细胞翻译 系统(原核的~coli$30无细胞蛋白质合成系统或真 核的兔红细胞网质裂解系统)中进行翻译,使目的 基因的翻译产物展示在核糖体表面,形成"mRNA一 核糖体一蛋白质"三元复合物,构成核糖体展示的 蛋白文库,之后利用相应的抗原从翻译混合物中进 行液相亲和筛选,以乙二胺四乙酸(EDTA)解离结 合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物, 并从中分离mRNA.通过反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)提供下一轮展示的模板,所得DNA进入 下一轮富集,最终筛选出高亲和力的抗体分子口". 核糖体展示抗体库技术利用抗原抗体特异性结 合的特性,便于蛋白富集和抗体文库筛选;因其筛 选抗体的整个过程均在体外进行,不需要经过大肠 杆菌转化的步骤,故而不受宿主细胞及转染效率的 限制,较噬菌体展示技术省时,省力,可以构建更 高容量,更高质量的抗体库,更易于筛选高亲和力 抗体,以及采用体外进化的方法对抗体性质进行改 造.核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程技术 的未来发展趋势,使基因重组抗体技术发展到一个 崭新的阶段. 3单链抗体在农兽药残留分析方面的 应用研究 近年来,随着基因重组抗体技术日益成熟,单 链抗体库技术在农药残留和环境污染检测领域已有 不少报道.Alcocer等以抗乙基毒死蜱单抗的良种 杂交瘤细胞作为抗体基因来源,构建噬菌体抗体 库,并以大肠杆菌为载体表达,制备了高亲和力, 高特异性的抗乙基毒死蜱单链抗体口.2002年, Kramer等同样以单抗杂交瘤细胞和大肠杆菌表达 载体为基础似,构建了噬菌体抗体库,制备了抗阿 特拉津的单链抗体,并通过基因定点诱变技术对该 抗体库进行了进一步优化,改善,使scFv对阿特 拉津的敏感性提高了25倍,相应的ELISA检测限 由5.1g?kg-降至0.2g?kg,,同时其亲和力也由 1.27~10-提高至7.64~10-.Li等用甲胺磷模拟物 对Balb/c小鼠进行免疫,利用免疫脾细胞为基因来 源获取mRNA,构建噬菌体抗体库,最终得到三 株特异性较强的单链抗体.在竞争EUSA检测 中,三株重组抗体的Ic?分别为46.25,35.39和 l7.99g?kg. 此外,单链抗体库技术近年来也开始渗入到 兽药残留检测领域..Koimal【i等利用噬菌体抗体 库技术制备的重组抗体对l3种磺胺类药物的交叉 反应率明显优于传统单克隆抗体.随后又对重组 抗体进行改造,应用获得的重组抗体建立了能对 18种磺胺类药物进行多残留检测的荧光免疫分析 方法口.国内潘科等利用噬菌体展示技术在杂交 瘤细胞基础上制备出抗盐酸克伦特罗重组抗体,其 对克伦特罗的敏感性优于其亲本代单克隆抗体,交 叉反应性与单克隆抗体相似.此外,笔者等利用 核糖体展示技术在杂交瘤细胞基础上制备出了抗磺 胺二甲嘧啶重组抗体.由此可预知,单链抗体技 术在未来农兽药残留分析中将占据重要地位. 综上所述,随着分子生物学,分子免疫学的发 展及各种抗体库技术的日趋成熟,单链抗体现已广 泛渗入到农兽药等小分子化合物的残留分析领域 中,与此同时将在未来发挥重大作用.它借助基因 重组抗体技术,将同类或不同类多种农兽药分子的 单链抗体基因整合到一起,建立抗体库,筛选天然 重组抗体,并运用抗体一兽药分子定量构效关系模 型,氨基酸序列对比和蛋白质同源模拟等技术进一 步改造,有望获得可用于兽药多残留快速免疫分析 的广谱性抗体,从而为发展简便,快速,高效的农 兽药多残留免疫分析技术提供一条崭新途径. 4单链抗体技术的不足与展望 单链抗体技术经过了近30年的发展,从体内 展示发展到体外获得目标分子,取得了许多应用成 果,但是其筛选获得的一些靶标在实际应用时仍然 存在一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,如亲和力较低,稳定性较差,半衰 期短等.例如有些单链抗体亲和力低于其亲本单克 隆抗体,这就成为它在免疫分析等应用中的一个制 约因素,后续我们可以通过亲和力成熟对单链抗体 的亲和力进行改进,或者通过构建多价抗体来增加 抗体的功能亲和性.但是随着分子生物学的快速发 展,各种技术手段及分子进化水平的不断提高,上 第9期齐永华等:单链抗体技术在农兽药残留检测方面的研究进展 述制约因素将会被一一剔除.总之,单链抗体技 术与其他技术相比,其优势是十分明显的,它以 其无可比拟的文库容量和成熟简便的进化手段必 将显现其巨大的潜力,在蛋白质互作,功能蛋白 和多肽的筛选,蛋白分子定向改造,小分子化合 物单链抗体制备和新药研制开发等方面将发挥重 要作用. [2] [3] 【4】 【5】 【6] [7】 【8】 【9】 【10】 【12】 【参考文献】 KohlerG,MilsteinC.Continuousculturesoffusedcellssecreting antibodyofpredefinedspecificity[J].Nature,1975,256(5517): 495-497. BlazekD,CelerV.Theproductionandapplicationofsingle-chain antibodyfragments[J].FoliaMicrobiol(Praha).2003,48(5):687— 698. BirdRE,HardmanKD,JacobsonJW,eta1.Single-chain antigen-bindingproteins[J].Science,1988,242(4877):423-426. KrebberA,BomhauserS,BurmesterJ,eta1.Reliablecloningof functionalantibodyvariabledomainsfromhybridomasandspleen cellrepertoiresemployingareengineeredphagedisplaysystem[J]. JImmunolMethods,1997,201(1):35-55. HortonRM,CaiZL,HoSN,eta1.Genesplicingbyovedap extension:tailor-madegenesusingthepolymerasechainreaction [J】.Biotechniques,1990,8(5):528-535. PepperLR,ChoYK,BoderET,eta1.Adecadeofyeastsurface displaytechnology:Wherearewenow[J].CombChemHigh ThroughputScreen,2008,11(2):127-134. FernandezLA.Prokaryoticexpressionofantibodiesandaffibodies 【J】.CurrOpinBiotechnol,2004,l5(4):364—373. 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KorpimakiT,RosenbergJ,VirtanenP,eta1.Improvingbroad specificityhaptenrecognitionwithproteinengineering【JJ.JAgric FoodChem,2002,50(15):4194-4201. KorpimakiT,BrockmannEC,KuronenO,eta1.Engineeringofa broadspecificityantibodyforsimultaneousdetectionof13sulfo- namidesatthem~imumresiduelevel[J].JACFoodChem, 2004,52(1):40-47. KorpimakiT,HagrenV,BrockmannEC,eta1.Genericlanthani- defluoroimmunoassayforthesimultaneousscreeningof188lll— fonamidesusinganengineeredantibody[J].AnalChem,2004,76 (11):3091—3098. [29】PanK,WangH,ZhangHB,eta1.Productionandcharacterization ofsinglechainFvdirectedagainstbeta2-agnnistclenbuterol[J].J AgricFoodChem,2006,54(18):6654-6659. 【3O】QiY,WuC,ZhangS,eta1.Selectionofanti-sulfadimidine specificscFvsfromahybfidomacellbyeukaryotieribosome display[J].PLosOne,2009,4(7):6427.