反硝化型甲烷厌氧氧化微生物富集培养研究（可编辑）

反硝化型甲烷厌氧氧化微生物富集培养研究（可编辑） 单位代码: 密级: 洳?:~嗜 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ? 中文论文题目:? 英文论文题目:?? 论文作者签名: 垒握 指导教师签名: 塑鱼兰 论文评阅人:闺航数援浙江太堂生金型堂堂院 评阅人:董武塾援级直工逝江省壅些生态皇篚沤壶公室 评阅人:搂麴注副数援逝迢太堂丕境皇盗速堂瞳 答辩委员会主席: 委员: 委员: 委员: 委员: 答辩日期:, :?丕垄丝 ‘ ? 细锄 : :里鱼墨墨巡旦堑 ?. .. ?墨墨殳煎曼鱼璺墨 堕塾 : : ?墨墨殳塾曼鱼墨墨至丛』世堑: 丛墼业墨,兰浙江大学研究生学位论文独创性 声明 无利益冲突声明中华医学会杂志社职业健康检查不够规范教育部留学服务中心亲友住房声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得逝’江盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:乐鹑存签字日期:加,弓年芗月,弓日 学位论文版权使用授权书 有权保留并向国家有关部门或机 本学位论文作者完全了解澎’江盘堂 构送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名:悯每誓 豢琢 日 签字日期:钿’;年弓月日 签字日期:加乃年弓月一浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 就像所有有结局的 故事 滥竽充数故事班主任管理故事5分钟二年级语文看图讲故事传统美德小故事50字120个国学经典故事ppt 一样,在我书写的浙大往事中,也该写到结束这一页 了。此刻我是理性的,仅为自己在这里走过的两年半历程划上一个休止符。 这本硕士毕业论文记录了我初入科研大门历经的种种,从孕育到诞生,过程 虽然艰辛,结果却让人释然。它的完成得到了许多人的帮助。 走入室,感谢我的导师胡宝兰副教授。您是我科研起步阶段的领路人, 从课题设计、实验开展、结果分析、论文写作等各个方面,都得到了您的悉心指 导,在此道一声感谢。您对学生成绩的认可,错误的纠正,迷途的引导以及失败 的宽容,都体现了身为人师的责任与担当。与导师两年多的相处,让我从一个被 动求学的学生变成一个有所悟的科研参与者,这细微的成长将会成为我求学路上 的宝贵财富。 走入室,感谢环境生物技术实验室的郑平教授,您是一位谦和与敬业的 学者与老师。您在学习室、实验室、办公室、食堂甚至路边与学生交流、攀谈的 场景,让人看到了您的随和,而您长明的办公室灯光、深夜的电子邮件以及恒温 室汗流浃背的身影,又让人看到了您孜孜不倦的敬业心。耳濡日染,言传身教, 您的言行给了我积极的影响。 来到室,环境生物技术实验室的兄弟姐妹,今天来跟你们道别。陈 婷婷、 季军远、楼菊青、沈李东、张吉强、丁爽、张萌、陆慧峰、刘帅、谢作甫、邢雅 娟、王兰、张红陶、何崭飞、厉巍、陈慧、王茹、耿莎、,不管相处的时 间长短,感谢大家一路的相伴,有你们,一路走来并不孤单。感谢已毕业的蔡靖、 陈小光、唐崇俭、陈建伟、胡安辉等师兄师姐,你们让我看到了选择不同的道路 也可以有同样的精彩。 最后是我踏出校门的时刻了,感谢父母的无微不至,兄、嫂的体贴入微以及 女友的支持鼓励,成长虽然会带点疲惫与遗憾,你们的包容却让我倍感安宁。 合上书本,我告诉自己要脚踏实地,理想弥足珍贵,要让自己去搏一回;离 别浙大,轻轻地对所有的相识道一声,珍重再见 蔡琛 初春于紫金港启真湖畔 序言 序言 本论文的完成得到了 国家自然科学基金. 浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划 . 资助 谨此致谢 摘要 浙江大学硕士学位论文 摘要反硝化型甲烷厌氧氧化 ,是 一种新发现的微生物反应,催化该过程的微生物一一门细菌,能够耦联甲 烷的厌氧氧化和/’的还原。过程连接了碳素循环和氮素循环,丰 富了生物地球化学循环途径;门细菌形态特殊,并且具有独特的代谢途径, 扩充了微生物学内容;作用能同时去除甲烷与/。两种污染物,是 环境工程领域新型除碳脱氮工艺开发的理想选择。然而,门细菌生长极其 缓慢,要获得富集培养物十分困难。接种物、培养基和反应器构型是微 生物富集培养的三个关键因素,本论文分别从这三个方面入手,对微生 物的富集培养进行了优化研究,主要结论如下: 比较了不同接种物富集培养微生物的差异,明确了微生物 富集培养的最优接种物。 ?测试了厌氧产甲烷颗粒污泥、农田水稻土壤和淡水河道沉积物作为接种物 的可行性,比较了富集培养过程中门细菌数量的变化和活性的差 异,其中富集结束时门细菌的数量分别较接种物增加了倍、倍和 倍,获得的富集培养物的活性分别为..、.~,表明了三种接种物经富集均可获得和. 富集培养物,均适宜作为微生物富集培养的接种物,扩大了 接种物的来源,为富集培养物的获得提供了新的选择。 ?首次利用农田水稻土壤作为接种物成功获得了富集培养物,活性 实验及分子生物学分析结果均表明农田水稻土壤是三者中最优接种物。 比较了天然培养基与人工培养基在微生物富集培养效果上的差异, 得出了微生物富集培养的最优培养基。 ?比较了天然培养基与人工培养基富集培养微生物的差异,获得的 富集培养物的活性分别为. ?~?.和. ???,人 工培养基是天然培养基的.倍;门细菌的数量分别为.× 和.×, 后者是前者的两倍,从而表明了以农田 水稻土壤作为接种物,人工培养基较天然培养基的富集培养效果更好。 浙江大学硕士学位论文 摘要 ?采用农田水稻土壤作为接种物,以人工培养基培养成功富集到了以 的 的细菌为主导的富集培养物,首次证明了归属于 细菌同样具有活性。 比较了不同构型反应器富集培养微生物的能力,得出了微 生物富集培养的最优反应器构型。 ?比较了三种不同构型的反应器,即磁搅气升式反应器 、生物膜反应器 和序批式反应器 富集培养微生物的差异。经过近一个月的 富集培养,三者的容积氮去除速率分别提高了.%、.%和.%, 活性分别为.,.和.??.,表明了三种构型装置均具有提高活性的功能,均能够作为 微生物的富集培养装置。 ?具有最高的容积氮去除速率和最大的活性,因此是三者 中最优的富集培养微生物的反应装置。 ?从甲烷传质和微生物持留能力两种因素考虑,前者是微生物富 集 培养过程中更为关键的限制因素。 关键词:反硝化型甲烷厌氧氧化;富集培养;接种物;培养基;反应 器 构型 . .,., .,/. . ,, ,. , : .? , , , ,, .. . . ?~?... ?~? ?,. , . ?. , . ? 浙江大学硕士学位论文 ? . . . ???,.. × . ?。 . . ?. . 、析 . . ? . ; ; .%,.% .% ,.. ?~?.. ?~?‘ .... 、椭 . ? , . ?.: ;; ;; 浙江大学硕士毕业论文 目录 目录 《?谢....??..??....?..?.?...?.??........?.... 摘要...?.?..??...............?...?...??. ...??。? 第一章文献综述? 弓言??. . 研究进展.. .. 过程的研究历史.. 发生机理..参与过程的微生物.. ..目前存在的问题. 研究进展. .. 过程的研究历史?.. .. 发生机理.. 参与微生物 .. 富集培养物 .本课题研究的意义与内容..研究意义??. ..研究内容?.. ..技术路线第二章不同接种物富集培养微生物的比较研究?. 弓言?.. .材料与方法..接种物??.. 。.培养基??.. ..富集培养?.. ..活性测试??浙江大学硕士毕业论文 目录 .. 抽提与扩增?.. ..克隆与测序。 .. 基因与基因系统发育分析..实时荧光定量。 ..荧光原位杂交??.. ..分析方法? .结果??.. .. 门细菌的富集 ..富集培养物活性测试? .. 基因与基因系统发育分析..定量分析?.. .. ?.?..??.??.??..?.??.??..讨论??:. .结论??. 第三章不同培养基对微生物富集培养的比较研究引言.. .材料与方法..接种物??.. ..培养基??.. ..富集培养?.. ..活性测试?.. .. 抽提与扩增?一 ..克隆与测序.. .. 基因与基因系统发育分析:;.. .........................................?............. .................?............................... :;.. ......................?.................?......... ...?..?...........................?.............. ..分析方法? .结果??。 ..富集培养?..浙江大学硕士毕业论文 目录 ..活性测试?.. .. 基因和基因系统发育分析..... :;..?. .讨沧??.. .结论??。 第四章不同构型反应器富集培养微生物的比较研究??. 引言? .材料与方法..接种物??一 ..实验装置?.. ..培养基??.. .. 活性测试? .. 抽提与扩增?.. ..克隆与测序.. .. 门细菌数量分析.. 基因和基因系统发育分析...?..?.??.?.?.?.?.??.??.??.?. ..分析方法? .结果??一 ..反应器容积氮去除情况?.. .. 活性.. 门细菌数量? .. 基因与基因系统发育分析..;?.?.?.?.?; .讨论??.. .结仓??一 第五章结论与展望?..::??.目录 浙江大学硕士毕业论文 .主要结论 .创新点??‖? .建议和展望参考文献??. 个人简历.. 硕士阶段取得的科研成果??..浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 引言 甲烷是无色无味最简单的碳氢化合物,它是人类生活中不可或缺的燃料天 然气中甲烷的含量占%。但同时,甲烷还是一种强效的温室气体,它所造成 的温室效应在最近多年内达到了二氧化碳的倍 .,,其 产生的辐射效应占地球人为辐射效应总量的%,。工业社会发展以 来,地球大气中的甲烷含量逐渐增加,从最初的 增加到目前的 ,,以致甲烷对于地球温室效应的贡献日益明显。因此,了解 地球上甲烷的源与汇,完善甲烷循环的途径,对于理解甲烷在地球上的形成与转 化,提出控制甲烷排放的对策,缓解日趋严重的温室效应具有十分重要的意义。 微生物在地球甲烷循环中扮演着重要的角色。据统计,全球每年甲烷产生总 量的%及消耗总量的%来自于微生物的参与,。产甲烷作用由 产甲烷古菌完成,而甲烷氧化根据是否有氧气的参与而分为甲烷好氧氧化作用与 甲烷厌氧氧化作用 ,,前者由甲烷好氧氧化 细菌完成,后者由微生物包括古菌与细菌完成。 作用是缓解甲烷排放的重要一环。理论上来说,作用可以耦联 多种电子受体图.。已报道微生物可以利用作用产生的电子还原如小 .,、‘ .,、”和 .,等多种电子受体。目前对于微生物作用的研究多集中于‘型. ,。据悉, .,; 海洋中每年产生的甲烷超过%通过作用消耗 ,,可见对控制甲烷排放的重要性。反硝化型 ,是耦联/。还原的 作用,目前对于该过程的研究尚处于初级阶段。 下面就作用和作用的研究历史,作用机理及参与微生物等内 容做一综述。渐江大学硬士学位论文 第一章文献综述. “。 嬲 ; 竹??叮?一? 图 微生物参与的生物地球化学循耳 绿色代表目前己知的微生物主导的元素循环过程,灰色代表冒前 未知但热力学上可行的过 程,红色代表过程。有修政..,岫. 研究进展 .. 过程的研究历史 上世纪年代,人们通过对海洋环境的地球化学研究发现,海洋深 层沉积 物中的甲烷在厌氧条件下扩散至。丰富的区域印消失& &,;,,拉开了研究的序幕。随后, 和通过实验室研究提出了一种“合作理论”,印一种微生物催化 了 甲烷的氧化,而产生的电子则通过另一种微生物消纳&,。 和利用放射性同位素示踪实验观察到了甲烷氧化与‘还原同 时发生的现象&,。至世纪年代中期,等通 过野外考察与实验室培养提出了过程可能由甲烷厌氧氧化古 ,; ,一,一和‘还原细菌 共同完成 ,。之后的研究发现,第一章文献综述 浙江大学硕士学位论文 在一些海洋环境以及一些实验室获得的富集培养物中,均存在与共.,; 存的现象,进一步验证了该假设 .,; .,。 然而,另一些研究人员对在过程中的作用提出了质疑。首先, 过程产生的能量非常少等式.,原位作用释放的吉布斯自由能?仅为.至 ~ .,。因此,许多微生物学家认为如此 低的能量供给难以维持和共同生存 .,。其次,有研 究发现在一些特殊海洋环境中,可以不依赖单独存在 ., ; .,; .,; .,。截至目前,与 相关的微生物还未能分离,与之相关的争论仍在继续。 . 厶。‘ ? 除海洋环境外,其他生态系统中过程的研究寥寥无几,目前已发现 现象的其他生境仅包括水稻 .,,垃圾填埋场 .,,富营养化湖: .,和泥炭地湿地 .,。 .. 发生机理 虽然对的研究已有几十年,但该过程发生的机理仍不清楚。在几十 年的研究过程中,人们相继提出了几个假设,即反向产甲烷理论、 产乙酸理论和 甲基化理论。 反向产甲烷理论 反向产甲烷理论是目前人们研究最多的发生机理。所谓反向产甲烷, 即氧化甲烷的起始步骤是产甲烷最后一步的逆反应, ; .,,通过氧化甲烷,将电子通过某种中间产物传递 给,最终实现的还原。支持该假设的研究者认为,作用与产甲 烷作用存在着紧密的联系,即作用往往伴随着产甲烷作用的发生而发生 .,。 ,; 和通过放射性同位素示踪实验证实了产甲烷古菌与作 用的关系。他们对九株产甲烷古菌研究发现,在厌氧环境中,这些微生物均能在 产甲烷的同时氧化小部分的甲烷。同位素标记实验表明观察到的作用 可能涉及了产甲烷作用特有的中间产物,如甲醇、醋酸等,表明产甲烷古菌参与 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 了甲烷的氧化过程,。等通过对美国加利福尼亚北 部 海湾缺氧沉积物中甲烷氧化速率及还原速率进行季节性调 查后发现,尽管不同季节甲烷氧化的速率存在一定的差异,但甲烷氧化作用均发 生于含‘的缺氧沉积物 .,。通过对沉积物中产甲烷古菌的 专性抑制实验发现,产甲烷古菌功能被抑制的同时甲烷氧化作用也被部分抑制, 该实验也证明了产甲烷古菌很可能参与了甲烷的氧化。同时,通过向沉积物中添 加。发现甲烷氧化作用进一步加强,意味着同样参与了甲烷的氧化过程。 据此,等提出了以下假设:产甲烷古菌将甲烷氧化,同时以水作为电子 受体产生中间产物,利用将。还原 .,。在墨西哥 湾 .,及黑海 .,缺氧沉积物中同样发现了产甲 烷作用与作用共存的现象,证明了这些微生物可能同时参与了这两种生物 过程。 反向产甲烷作用的第一步是甲烷的活化碳氢键的断裂。中含有甲基 ,的同系物,而是产甲烷 辅酶还原酶. 作用的关键酶,因此,这种同系物可能是催化甲烷氧化的关建酶 .,;&。等首次对含的沉积物中的 基因编码 【亚基的基因进行了检测,发现了新的基因型 ., 。等从黑海沉积物中纯化了含镍化合物的蛋白,这种镍化合物与 的镍辅因子具有相同的吸收光谱,但是前者的分子量要大于后 者 .,。这种含镍蛋白与具有相似的序列结构且含 量很高,可能对的进行发挥了重要作用。随后,这种修饰的结构得 到 确认,称为.甲硫基. .,。等分离出了并首次 通过实验证明了具有将甲烷转化为甲基辅酶的能力,有力地支持 了反 ., 。 向产甲烷理论 等利用环境基因组技术分析了深海沉积物中的,发现几乎所 有与产甲烷作用相关的基因均存在于中,但唯独缺失亚甲基.四 氢甲烷蝶 呤还原酶,的编码基 因,而执行了产甲烷作用的其中一步 .,。据此, 等提出了基于反向产甲烷理论的机理模型图第一章又献综述 淅江大学硕士学位论 ,。他们预测反向产甲烷步骤?是由或者是与 之功能相似的酶催化的。反向产甲烷过程中产生的电子步骤?? ?通过某种 未知中间产物传递给,从而实现的还原 ,。 ?;?茂: , , “ ?’。~’? ’ 一 、一‘ ~??’ ’ ? “???一 一? 。; ? ““?。?。。 叫 ? ? ?? “, 。口 ’, : ’ 图.基于反向产甲烷理论的模型 :反向产甲烷过程;:还原;微生物生长 , : ;: ;: 产乙酸理论 针对之前研究中存在的与反向产甲烷理论矛盾的或者不能解释的现象,有学 者提出了不同的见解,他们认为可能利用甲烷和产生了乙酸,随后 乙酸被利用,即乙酸是过程中的中间产物,起到了电子传递的作用 &,; ,。随后,和又提出 了一种新理论&,。该理论假设利用两分子甲 烷产生乙酸和,而这两种中问产物又被利用。采用该理论计算出的 释放的自由能是反向产甲烷的两倍,从而使和能在反应过程中获取 更多的能量;其次,该理论涉及了与之间的碳传递,从而解释了部,; .,; 分脂质存在”亏损的现象 ,。 甲基化理论 等根据之前的研究成果以及自己的实验结果提出了一种全新的理论, 称为甲基化理论 ,。该理论认为甲基硫是作用的中间产 物,这种物质由通过甲烷的氧化和的还原产生,并最终被所利浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 掌札 熙驴。 ,。 ”‰。。?。,~?渐江大学硕士学位论文 第一章文献综述 。和硫化物 ,。这一发现对于的研究具有很大的贡献, 首先,作用是由单独完成的生物过程,而不是此前认为的由 与协同作用完成的,意味着在作用中是非必须的:其次,被 认为是还原的,发现其具有歧化二硫化物生成。的能力,因此它与 还是存在十分密切的关系。 图 以零价硫为中间产物的作用谬正模型 ,该机制的发现为领域提出了更多需要深入研究的问题岛。首 先,中缺少‘还原所需要的特异性酶,因此,找到这种特异性的酶或 其编码基因是对该机制的有力证明。对此,等提出了甲酰.甲烷呋喃脱氢 酶很有可能是催化‘还原所需要的特异性酶,因为它的氧化还原 电位极低 ,因此的还原能力在某种程度上要强于 , 其次,催化这种新的作用的微生物是中的一簇.,因此, 其他.和一是否具有单独催化作用的能力还有待 进一步研究。此外,由细菌催化的二硫化物歧化作用存在的广泛 性还有待更多的 调查研究。 ..参与过程的微生物 如前所述,无论是自然生境还是实验室培养,大多数情况下与 共同存在,两者关系密切。 淅江大学硕士学位论支 第一章支献综述 迄今,对于种群多样性的鉴定主要基于基因层面 和 基因和脂质层面,。 目前在许多不同的海洋环境中均发现了具有功能的,然而它们 在进化上的亲缘关系却很远。通过 基因系统发育分析,可将 分为三簇,即一、.和一,其中与 和存在一定的亲缘关系 .,; , .,;,,属于 ;,,而一则与的和 存在亲缘关?. ,;,。这三簇 之间的系统发育关系很远,序列相似度仅为.%,甚至.还可分为三 个亚簇,印.、和.图 。这些归属干不同目或科 的具有极为相似的生理特性,暗示了它们可能广泛分布于自然界 中。 许多研究将基因作为的特异性功能基因标记物,用于 的鉴定。从功能基因角度进行系统发育分析亦可发现,.的亲缘关 系十 分疏远图 。囵圈 . 圈四 ‘‘量。。。 ,“芒 、 ’~”‘矾”葛?;?妻 、。. \ 。 , 图.基于 基因和基因的系统发育树&, .如,& 髑衄船 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 种类丰富,常常与共存。比如归属于的 ., /通常与?和共存 .,; ., ; ., ; .,; ; .,,并且形成细胞团聚体。通常与. 共存。但与的共存模式也呈多样化,如在某些生境发现有与 .共存的现象,在 的沉积物中发现了与 .,。 .以及与.共存的现象 ..目前存在的问题 虽然从研究之初至今已有几十年,但人们对该过程的了解仍然有 限。 主要存在的问题包括以下几点:作用机理仍不完全明晰;甲烷氧 化速率的影 响因素尚不明确;相关微生物无法分离。分离获得催 化过程的微生物并探明作用机理,将是今后研究的主要方向。 . 研究进展 .. 过程的研究历史 是以/作为电子受体的反应式.和.。上世纪 年代,就有学者试图分离或者富集具有耦联反硝化功能的微生物, 但均以失败告终 .,; .,。此后很长一段时闻内,人们一直 未找到耦联反硝化作用的充足证据。直至年,等利用原位自然 梯度示踪实验发现了一受污染地下水环境中存在耦联反硝化的现象 ..。 一 ‘ . 心‘一 . 。 . 一 年,.等在实验室条件下利用甲烷与对反硝化污泥进行富 集培养,观察到了甲烷和同时消耗的现象,当停止添加‘时,甲烷的消 耗也立即停止. .,。然而,该研究缺乏对富集培养物中微生物浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 相的分析,因而无法确认催化该过程的微生物种类,并不能有力证明现 象的发生沈李东等,。年,荷兰研究人员等采用受农田 氮素污染的淡水河道沉积物作为接种物,经过个月的培养,获得了具有 基因检测发现该富集培 功能的富集培养物 .,。 养物存在细菌和古菌,其中占主导的细菌是一种归属于门的细菌,古菌则 仅包含一种归属于的古菌。对该富集培养物进一步富集发现, 这种归属于门的细菌以下简称门细菌主导了过程,而古茵 对于作用是非必须的州 .,。 另一组来自澳大利亚的研究人员等利用淡水湖泊沉积物、厌氧消化污泥 和回流污泥的混合物作为接种物进行培养,在不同温度条件下,分别获得了两种 不同的富集培养物。在低温条件下?,富集培养物仅由门细 菌组成,而在高温条件下?,富集培养物由门细菌和古菌共同组成 .,。不同的电子受体同样对富集培养物的微生物组成有影响, 以。作为电子受体,富集培养物仅由门细菌组成,而以作为电子 受体的条件下富集培养物由门细菌和古茵共同组成 .,。 .. 发生机理 门细菌的催化机理 等对门细菌催化的机理进行了研究,他们以两种高纯 度的富集培养物作为样品,完成了其中门细菌的全基因组测序, 并将该菌命名为 ., ”似 。 通过对 细菌全基因组序列分析发现, 细菌并不具备催 化完整反硝化过程所需的所有基因,缺少编码还原酶的基因。但 细菌能够完成反硝化过程并生成,那么 细菌必然存在一种未知酶 能够催化某种中间产物生成。此外,作为一种厌氧微生物, 细菌却 拥有完整的编码好氧甲烷氧化酶的所有基因。通过同位素标记实 验,等发 现 细菌能够自己产生氧气,并将一部分氧气用于甲烷的氧化 .,。根据以上实验结果,等提出了 细菌催化过第一章文献综述 浙江大学硕士学位论文 程的理论模型图.。他们认为必细菌的细胞内存在某种未知的歧 化酶,这种酶能够将歧化生成氧气,从而完成甲烷的好氧氧化。该 理论较为 圆满地解释了 .,。 细菌催化过程的机理. 。 图. ., 细菌催化机制模型 . . 等发现 羽细菌中存在四组终端呼吸氧化酶基因并都进行了转录, 。, 。因此, 进一步研究发现其中一组基因的氧化酶进行了翻译 等认为 细菌产生的氧气除了用于甲烷的氧化之外,还参与了细胞的呼 吸过程 .,。此后,等通过免疫金标记实验,发现催化甲烷氧化 和反硝化过程的两种关建酶甲烷单加氧酶和。还原酶共同存在 于 细菌的细胞内,进一步证明了过程是由 细菌单 独完成的、? .,。 有古菌参与的催化机理 目前对于古菌是否参与了过程仍有存疑,但从不多的研究结果显 示 古菌很有可能参与了过程。 一种观点认为古菌可能与门细菌协同完成过程。目前,共有 三篇论文报道了富集培养物中细菌与古茵共存的情况., 基因序 列相 .,; .,; ,并且三者古菌的 似度很高.%,意味着参与过程的很可能是这种归属于 的古菌。这三种古菌与细菌共存的富集培养物都有一个共同的 特点,即都具有消耗的能力。如前所述,等的实验表明不同的电子 受体 和对富集培养物的微生物茵群具有选择性,因此他们推测古 茵对于的竞争能力要强于细菌,而细菌对的竞争能力要强于古菌, 即 古菌的作用可能是将转化为‘ .,。另一种观点认为这种古 菌可能是一种新的产甲烷古菌,它利用细菌的代谢中间产物或其 他有机物 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 进行生存 .,,但目前并没有研究证实此观点。 .. 参与微生物 已报道的研究结果显示,富集培养物中通常以门细菌占主导, 仅在少数富集培养物中,存在归属于的古茵。 基因系统发 等将已知的归属于门的基因序列进行了 育分析,将所有序列分为四组,即 、 、 和 .,。采用目前的引物表.获得的门细菌序列均归属于 和 ,其。中所有富集培养物中的门细菌均归属于 .,; .,; ., .,;.,; ; .,,而接种物和环境样品中的门 .,;,; 细菌则归属于 和 ., .,。 ; .,; .,; 的门细菌具有催化过程的能力, 因此,可以认为归属于 的门细菌是否具有该能力还不得而知。 而归属于 门细菌具有特殊的甲烷好氧氧化途径。作为催化甲烷好氧氧化 的关建酶,编码其【亚基的基因具有高度的保守性, ,并作为功能标记物广泛用于环境中的甲烷氧化微生物的检测 .,。等设计并提出了用于检测门细菌基因的引物对 ., 。等采用该引物对农田水稻土壤检测发现,只有归属 的门细菌则 于 的门细菌能够被检测到,而归属于 无法检测到抽 .,。和采用自主设计的引物 对一寡营养湖泊沉积物检测发现了同样的现象。这些现象进一步 验证了归属于 的门细菌具有催化的能.,。但 是目前获得的门细菌序列较少,依此设计的引物不能覆盖所有具有 功能的门细菌 .,,有待进一步优化。 最近,等通过对多种富集培养物中微生物的脂质成分分析,发 现了两种门细菌所特有的脂质成分:和?,并将之作为 门细菌特有的生物标记物 .,。等利用和脂质分析浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 技术对泥炭地门细菌的研究发现,门细菌的数量与其特异性脂质的 数量呈正相关,表明这两种脂质成分可以作为门细菌的生物标记物 .,。 表. 微生物扩增采用引物 ... 富集培养物 目前对于过程的研究尚处于起步阶段,获得的富集培养物 不多表.。目前用于微生物富集培养的接种物多局限于淡水沉积物和 活性污泥,来源比较有限,采用的培养基多为人工配制的培养基,采用的培养方 式多为序批式培养。 表.不同富集培养物的比较 . 反应速率 接种物 富集方式 微生物组成 参考文献 培养基 鬻人工培糕序批式莩鬣??蛔。豇 连续式 连续式 细菌% 细菌% . 。 人工培养基 人工培养基 竺。.?.. 集培养物 .., 鬻肛培糙连续式帅。%浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 :/表示文献中未提及 .本课题研究的意义与内容 ..研究意义 工业社会的发展导致的全球气候变暖已成为全世界面临的重大 环境问题,而 甲烷作为第二号温室气体,它对该问题的影响举足轻重。另一方 面,目前我国的 水体污染已从有机物污染为主转变为氮磷污染为主,并已导致严 重的水体富营养 化,含氮废水的高效处理刻不容缓。过程的发现为甲烷的减排与氮素污 染的处理提供了新的思路和选择。而获得富集培养物则能够使 过程及相关微生物的研究顺利开展。 首先,富集培养物的获得使人们认识到一种具有耦联与反硝 化的微生物确实存在。门细菌参与的过程连接了碳素与氮素循环 图.,因此,它的发现在微生物学与生物地球化学循环领域均具有重要意义。 浙江太学硬士学位论又 第一章文献综述 图 门细菌参的生物碳氪循环红色标注的为过程 , 其次,基于富集培养物而进行的门细菌的细胞生物学和生物 化学特性 ,; ,; ,; ,、基 , 因组和代谢途径 ,、富集培养特性 ,;; ,; ,等方面的系统研究,不仅充实了微生物学内 容,同时对这种独特的微生物的研究很可能开辟出一个全新的微生物研究领域。 第三,从环境工程的角度考虑,过程及其微生物的研究为新型废水 处理工艺的开发和应用打下基础。作用可实现甲烷与/两种污染 物的同时去除,因此其在环境工程领域中具有重要的应用价值。 等首先采用污水处理厂的活性污泥成功获得了富集培养物, ,。 从而表明了原位大量获得工程化应用所需富集物的可能性 等提出了将应用于低温厌氧消化出水的处理图 ,。该工艺可在低温条件下实现厌氧消化工艺出水中溶解态甲烷与氨氮 的同时去除,一方面可以缓解甲烷扩散造成的温室效应,另一方面摆脱了传统的 脱氮工艺需要添加额外电子供体的限制,降低了运营成本。此外,还有学者提出 了将过程与厌氧氨氧化 ,过程相结合进行废水处理的设想 ,; ,。他们在实验室 条件下成功获得了门细菌和细苗共存的富集培养物,为这种新 工艺的开发打下了基础。 如上所述,无论是对门细菌生理生化特性的研究还是与相关 的废水处理工艺的开发,均需要以富集培养物为基础。然而研究表明,淅江大学硕士学位论文 第一章文献综述 门细菌生长缓慢倍增时间大约周,对培养环境要求严格,导致 富集培养物难以获得。因此,本研究针对微生物富集培养的接种物来源, 培养基组成.反应器构型等个关键因素进行了实验优化,以期快速、高效获得 微生物的富集培养物。 史羔 一 图.新型废水处理工 . ...研究内容 本课题的研究内容主要包括:考察不同接种物富集微生物的可行 性,通过比较筛选出最优接种物。考察不同培养基富集微生物的 可行 性,通过比较选出优质培养基。考察不同构型反应器富集微生物 的效 果,选出较优的反应器。州黼辎州料摇 秘非煞? 弹弦睁袋 宴群 崃皋球姐 盏:膏 雌埋巡爵霉翠璀 尊雄 二单 眯弁瓣扭雄饵巡癸霉匿忤 状奉样羞窖尊刊每、一盘 占?雌 善蓝 盏簧睾 宝?州埠 盏萋塞 媾晕碳扭 摊媾卑草辫 蚌裂 数鼍 媾鲁瓣缸蛾媾晕匾悻 四蝌鹰鼎鲁群碟剐醛碍口一爵 强奉铎羞雹霉一掣一一自 晕‖ 蚌袋 靛枣媾晕球粗鲁搴划掣一奢口 蘸豢至鹾觏《熏~震一鼗籍臻一嚣霉蔼?礁 秘档 弹弦 煞 蚌袋 媾皋球粗 霉簧糍晕瑙 “穰 聃袋 椿晕蝌;毒害;砰匿 弑隶群羞宅尊划摹囊盘 ‰。 缚裂 。情莲西一匝最骄谢《鼎隧埒 叫窜掣廿书簪批《餐 嚼籍蜊竹..【浙江大学硕士学位论文 第二章不同接种物富集培养微生物的比较研究 第二章不同接种物富集培养微生物的比较研究 引言 之前有研究表明,门细菌生长十分缓慢,因而要获得富集培 养物十分困难。目前,获得的富集培养物十分有限表.。然而,要探 明反应的机理及参与的微生物类群,需要大量的富集培养物。而接种物 的来源对于快速获得不同的富集培养物是非常关键的,并且对工艺的推 广应用也具有重要的意义。目前,接种物主要来自于淡水沉积物,污水 处理厂活性污泥,淡水沉积物、厌氧活性污泥和回流污泥三者的混合物以及泥炭 .,; .,; 地深层土壤 .,; .,; .,; .,,接种物来源有限。 过程发生的基本要素是厌氧环境中甲烷和/共存。废水厌氧 生物处理过程会产生大量甲烷,且处理后的出水中往往会含有一定量的硝态氮, 因此厌氧生物处理工艺中的产甲烷颗粒污泥可能是的适宜接种物。农田 水稻土壤是公认的大气甲烷的主要排放源,另外由于氮肥的大量施用,往往造成 土壤中氮素过剩,有部分会以硝态氮的形式存在,因而水稻土也是发生 的有利生境。淡水河道沉积物具有厌氧/缺氧/有氧交界面,许多河道由于受氮素 污染,底泥中含有一定量的和。,同时底泥中有机质的厌氧分解过程会 释放出大量的甲烷气体,因此淡水河道底泥也是发生的良好生境。 本实验分别采用厌氧产甲烷颗粒污泥、农田水稻土壤和淡水河道沉积物作为 接种物进行功能微生物的富集,以获得不同的富集培养物,同 时利用分子生物学技术监测富集过程中的菌群变化,以考察三种接种物富集 功能微生物的可行性,筛选出合适的接种物,以扩大接种物的来 源。 .材料与方法 ..接种物 厌氧产甲烷颗粒污泥取自实验室高效产甲烷颗粒污泥装置、农田水稻土壤 浙江大学硕士学位论文 第二章不同接种物富集培养微生物的比较研究 取自某长期施肥水稻田,取样深度为表层以下. 和淡水河道沉积物取自 某淡水河道,取样深度为沉积物以下. 。三种接种物的基本理化指标如表 .所示。三种接种物中均存在一定量的,而厌氧产甲烷颗粒污泥和淡水 河道底泥中的浓度要比农田水稻土壤高一个数量级。 表.三种接种物的基本理化性质 . ..培养基 ...,浓度为. 采用天然地表水 ?一,氨和’浓度均低 于检测限添加适量的作为培养基进行微生物的富集培养。在 天的富集过程中,进水的浓度从 ?。提升至 ?~,值维持 在...,气相中甲烷的体积浓度维持在气相浓度的%左右。 ..富集培养 , 采用相同的进行三种接种物的富集培养图.。每个装置总容积为. 接种量为. ,添加培养液至. ,气相体积为. 。三个富集装置在 恒温运行。以 为一个运行周期,包括. 进水期, 反应期, 沉淀期,. 排水期。在进水期,加入培养基,同时持续向中通入氩气, 以保持装置内部的厌氧环境,维持体系的稳定。进水结束后,停止通气,用 的甲烷纯度为.%置换富集装置中相同体积的氩气。在排水期,每个 中排出 上清液,此时,气相连接气袋,防止空气进入。进水期补充等量 新鲜培养基。富集培养分为三个阶段,富集阶段初期.天,进水浓度 控制在 ?~,初始的天还添加了 ?的。,以去除接种物中 的有机质,天后停止添加;富集阶段中期天,进水浓度 提升至 ?。;富集阶段后期.天,进水浓度提升至 ?一。浙江大学硕士学位论又 第章不周接种物富集培养微生物的比较研究 基质置按 取样 耍亩夔徽生物的装置 ..活性测试 采用分批实验测定三种富集培养物.,的活性。取三种富 集培养物并用不含’的培养基冲洗次,随后备取富集培养物转移至 】至。每个血清瓶 血清瓶。添加培养基’浓度.~, 中分别通氢气 ,以维持血清瓶内的厌氧环境。再向血清瓶中加入纯度为 %的甲烷,使气相甲烷浓度控制在 %左右。每个样品设置三个平行和一个 对照组,对照组血清瓶中不添加’。血清瓶置于恒温摇床中培养,培养温度 控制在,振荡速度为 。在培养过程中,每隔 ,培养时间为 取样测定气相甲烷浓度与液相‘浓度,确定反应的活性并推算其化学 计量关系。 ..抽提与扩增 定期取培养物离心后在?冻存。分别称取三种富集培养物各 , 采用浙江大学硬士学位论文 第二章不同接种物富集培养微生物的比 较研究,,,进行抽提。 采用巢式分别对三种富集培养物中门细菌的 基因和 基因进行扩增。本实验所使用的引物表.及反应条件参考等文 .,; .,。所有产物用%的琼脂糖凝 献 胶电泳进行检测。 表. 实验所用引物 . ..克隆与测序 产物的克隆操作按试剂盒说明进行,将产物连接到.载 体上, .,,将导入载体的大肠杆菌在体系中振荡 培养 ,随后将菌液涂布于含氨苄青霉素,、.溴.氯..吲哚. ?半乳糖苷一 ,.与/异丙 基一?硫代吡喃半乳糖苷 ..,的 培养 。通过蓝白斑筛选挑取白色菌落,并用菌液 平板培养基中培养 法验证插入片段 .,。每个样品挑选约个克隆送华大基因公司测 序。 .. 基因与基因系统发育分析 采用.软件 .,对所获得的序列进行系统发育分析。 序列采用 算法进行对齐,最后采用邻接?血法构建系统 发育树,采用计算,并对构建的树进行分析个样本。浙江大学硕士 学位论文 第二章不同接种物富集培养微生物的比较研究 基因 采用软件对门细菌的 和基因进行分类操作 ;元 ,分析,将相似 度大于%的 基因序列和相似度大于%的基因序列归为一个 ,,此外,利用公式【.】×%进行克隆库覆 盖率的计算。其中。为一条序列独占一个的序列数量,为一个克 隆库中 总的序列数。 ..实时荧光定量 本实验选取门细菌 基因特异性引物/作为定量测 试的引物。采用 实时定量仪,进行实验, .,。扩增反应的特异性分析与标准曲 反应条件见文献 线的建立如前所述 .,。样品的基因拷贝数通过样品 值计算获得。 ..荧光原位杂交 定期对、、进行取样、固定和杂交。 固定:从每个反应器中现取培养物 ,离心弃上清液并用磷酸缓冲 液 样品加入多聚甲醛固定液中,置 ,溶解。取. 于冰上 。离心并再次用冲洗,最后用与乙醇的混合液:溶解,并 置于.?条件下保存。 杂交:取固定好的样品的悬浊液?滴加至载玻片上,并在条件下 晾干。同时,配制%甲酰胺浓度的杂交液,并保存于室温下等待使 用。将干燥 后的载玻片依次置于,和%的酒精溶液中脱水,每个浓度脱水分 钟。 脱水结束后风干片刻。同时配制浓度为 ??。的探针混合液,采用探针为 ? .,, 一一,杂交门细菌 混合探针,杂交细菌 .,。每个样品滴加 杂交液和?探 针混合液,并用枪头小心将探针混合液与杂交液适度混匀。准备杂交离心管 ,在每个管中添加一张折叠好的滤纸,分别将剩余的杂交液均匀倾倒至滤纸 上。将载玻片迅速放入离心管后,将杂交管水平置于已在下稳定运行的杂