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PLFA 测定操作规程(修改).doc

PLFA 测定操作规程(修改)

画个问号给明天lol
2017-10-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《PLFA 测定操作规程(修改)doc》,可适用于综合领域

PLFA测定操作规程(修改)PLFA测定操作规程仪器设备:名称规格数量用途**烘箱测定土壤含水量冷柜暂存土壤样品用于土壤样品的长期保存冷柜及天内待检测样品的保存冷柜保存天以上的待检测样品通风橱中试验各步骤均需在通风橱中进行分析天平称样及测定含水量振荡器可调速提取最高转速〉超速离心机提取rminDC氮吹仪浓缩提取液孔SUPELCO萃取收集器纯化(获取PLFA)TMVISIPREPDLPa真空泵加速淋洗速度Lmin水浴锅恒温甲醇分解ul微量加样枪移液ul微量加样枪移液ul微量加样枪移液ul微量加样枪移液ml移液瓶移液ml移液瓶移液ml移液瓶移液实验耗材:名称规格数量用途铝盒中号测定含水量ml离心管提取ml分液漏斗萃取样品溶液的酯类物质ml大试管A盛装分液漏斗分离的总酯提取液ml大试管B盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液ml大试管C盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液ml萃取小柱纯化PLFAormlml枪头移液ml枪头移液ul枪头移液ul枪头移液丙腈橡胶手套中号实验操作时须戴橡胶手套厚清洗容器时须戴纱布卷罩容器试剂瓶时用注:数量以个样品计。实验试剂(以个样品计):名称规格最低用量正己烷分析纯ml三氯甲烷分析纯ml甲醇优级纯ml丙酮优级纯ml甲苯优级纯ml氢氧化钾优级纯mlMKOH醋酸优级纯mlMCHCOOH磷酸优级纯ml超纯水ml注:未计清洗用量和配试剂用量。试剂:、磷酸缓冲液c(KHPO)=molL:gKHPO加入mlCHCL再加入超纯水稀释到、提取液v(甲醇):v(三氯甲烷):v(磷酸缓冲液)=:::mlCHOH加入mlCHCL再加入ml磷酸缓冲液、甲醇甲苯混合液v(甲醇):v(甲苯):=::取ml甲醇和ml甲苯混合、甲基化醋酸c(CHCOOH)=molL:mlCHCOOH加入ml超纯水、甲基化氢氧化钾c(KOH)=molL:gKOH溶解于ml超纯水中为MKOH溶液再取mlMKOH溶液加入mlCHOH为MKOH溶液。PLFA提取操作流程:实验前准备工作、土壤过mm筛用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块、克左右土壤样品置于铝盒中称盒鲜土重烘干称盒干土重计算土壤含水量、配制试剂准备实验用品。注意:所有玻璃器皿(试管、小瓶及瓶盖等)在实验前均须用正己烷清洗晾干。实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。实验第一天称取相当于g干重的土壤置于ml离心管中向离心管中加入ml磷酸缓冲液(用ml移液枪将含水量计入)再加入ml三氯甲烷ml甲醇(用移液瓶)振荡小时上层离心液倒入分液漏加ml三氯甲烷mlrpm,离心分钟斗磷酸缓冲液于分液漏斗中加入ml提取液于离心管中的剩余土壤中手工摇动振荡分钟上层离心液倒rpm,离心分钟摇动分钟静置过夜入分液漏斗下层加水摇动丢弃多余土壤用清洗剂洗刷离心管将分液漏斗中下层溶液放入大试管A中实验第二天加ml三氯甲烷调节萃取小柱(ml移液枪)水浴N浓缩份微升三氯甲烷转移浓缩磷脂到萃取小柱(用或微升移液枪第次转移时直接从试管底部吸取第次转移时则在转移前用移液枪冲洗试管内壁。向萃取小柱加入ml三氯甲烷弃去加次ml丙酮甲醇清洗萃取小柱底部加ml甲醇大试管B收集淋洗液水浴N浓缩加ml:甲醇:甲苯mlM氢氧化钾溶液摇匀水浴加热分钟加mlM醋酸溶液ml己烷ml超纯水低速振荡分钟下层加ml己烷再振荡分钟上层己烷溶液移入小瓶上层己烷移入小瓶N脱水干燥不用水浴(如果天内不上色谱检测则到此为止)用移液枪加次微升己烷于干燥样品中摇动转入色谱仪专用的内衬管天内检测天保存超过天保存注意事项,(所有实验用品应为玻璃或氟塑料(PTFE,聚四氟乙烯)并且无脂。实验器材要用热水和无磷洗洁剂清洗。用流动水冲洗掉泡沫后再冲洗,次再用去离子水冲洗次风干。使用前用化学纯(reagentgrade)氯仿冲洗或在上述冲洗风干后在下烘干~小时。严格地说实验器材应避免使用橡胶、软木塞以及除了聚四氟乙烯之外的塑料制品。如果受经费限制使用的普通塑料制品应为一次性的并且与有机溶剂的接触时间要尽可能的短。b(所用溶剂应为优级纯或者更高的等级。)大部分实验者把将要使用的溶剂浓缩~倍后注入气相色谱仪以观察溶剂是否有脂类污染。)应谨慎的检查去离子水是否含有脂类用有机溶剂(如正己烷二氯甲烷)萃取ml去离子水浓缩萃取液并注入色谱仪。)重要的是每批提取时应当作空白对照。这些空白样本除了不加入土样外所有操作都与其他样本相同。在以上三种情况下气相色谱图没有波峰出现则说明没有脂类污染。实验所用的有机溶剂及其配制的溶液易受光热影响应保存于棕色试剂瓶中。,(这一步所加的缓冲液的量每个样本都不同缓冲液和土样中的水分相加后要使得最终提取液中各组分达到v(甲醇):v(氯仿):v(水)=::的理想体积比。(即水分总体积为ml)这一体积比适用于总脂含量mg及以下的土样。含有更多脂类的更大的样本需要更多体积的提取液和不同的提取液配方。,(有时提取液在加入样品后会分为相这说明样品中含水量较大可加入少量甲醇(<ml)震荡后静置。(光、热、氧气都会引起脂类降解因此应尽量减少样品暴露于上述三个条件中的机会。对大体积或低生物量的样品要进行二次提取。第步结束后如果无法立即进行接下来的步骤获取的脂类样品可在N保护下贮存于或下加入ml新鲜的二氯甲烷或己烷以进一步抑制氧化。使用前一定要用氯仿清洗硅胶柱。不同的成品硅胶柱的清洗和活化方式可能会有差异具体方法参见产品说明书。再次强调固相色谱柱一旦弄湿就决不能让它干掉。在分离过程中当停止液体流动时最好保持柱子顶部有~μl的溶剂。试管底部可加热至以促进脂类融化。建议用手指托住试管底部体温加热比较快捷可行。这一步可洗除柱中的中性脂。这一步洗除柱中的糖脂。有文献认为大量洗除需要ml丙酮的用量。最好让丙酮全部流出来掺几滴随后流出的甲醇也无妨。第步结束后如果无法立即进行接下来的步骤获取的脂类样品可在N保护或下加入ml新鲜的二氯甲烷或己烷以进一步抑制氧化。下贮存于每日制备新的甲基化氢氧化钾溶液。加入氢氧化钾这一反应产生FAME。在加入醋酸与加入己烷和水的过程中不能延迟。FAME很容易在水或者酸碱基的存在下降解。加入己烷可以形成一个脂相从而保护FAME不被水解。、宁可少收集一滴己烷也不能多流入一滴水相。总共有ml己烷从反应试管中移入小瓶。碳链长度小于的FAME无法用这种方法定量检测出来。如果要检测C或碳链更短的脂肪酸的含量溶剂应当吹干至“一滴”而不是全部吹干。这一步完成后如果无法立即进行接下来的步骤获取的脂类样品可在N保护下贮存于或下加入ml新鲜的二氯甲烷或己烷以进一步抑制氧化。

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