PLFA 测定操作规程(修改)

PLFA 测定操作规程(修改) PLFA测定操作规程 仪器设备: 名 称 规 格 数 量 用 途 ** 1 烘箱 测定土壤含水量 1 冷柜 4? 暂存土壤样品 用于土壤样品的长期保存 1 冷柜 -20? 及2-3天内待检测样品的保存 1 冷柜 -80? 保存3天以上的待检测样品 1 通风橱 中 试验各步骤均需在通风橱中进行 1/10000 1 分析天平 称样及测定含水量 1 振荡器 可调速 提取 最高转速〉1 超速离心机 提取 5000r/min DC-12 1 氮吹仪 浓缩提取液 12孔SUPELCO 1 萃取收集器 纯化(获取PLFA) TM VISIPREPDL 10-30Pa 1 真空泵 加速淋洗速度 25L/min 1 水浴锅 恒温 甲醇分解 200ul 1 微量加样枪 移液 500ul 1 微量加样枪 移液 1000ul 1 微量加样枪 移液 5000ul 1 微量加样枪 移液 6ml 1 移液瓶 移液 12ml 2 移液瓶 移液 23ml 1 移液瓶 移液 实验耗材: 名 称 规 格 数 量 用 途 24 铝盒 中号 测定含水量 50ml 24 离心管 提取 250ml 24 分液漏斗 萃取样品溶液的酯类物质 35ml 24 大试管A 盛装分液漏斗分离的总酯提取液 10ml 24 大试管B 盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液 5ml 24 大试管C 盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液 3ml 24 萃取小柱 纯化PLFA or 6ml 5ml 10 枪头 移液 1ml 5 枪头 移液 500ul 30 枪头 移液 200ul 60 枪头 移液 2 丙腈橡胶手套 中号 实验操作时须戴 2 橡胶手套 厚 清洗容器时须戴 1 纱布 卷 罩容器试剂瓶时用 注:数量以24个样品计。 实验试剂(以24个样品计): 名 称 规 格 最 低 用 量 正己烷 分析纯 120ml 三氯甲烷 分析纯 840ml 甲醇 优级纯 720ml 丙酮 优级纯 240ml 甲苯 优级纯 12ml 氢氧化钾 优级纯 24ml 0.2M KOH 醋酸 优级纯 7.2ml 1M CH3COOH 磷酸 优级纯 530ml 超纯水 48ml 注:未计清洗用量和配试剂用量。 试 剂: -11、磷酸缓冲液[c(KHPO) = 0.05 mol?L]:38.84 g KHPO加入12ml 2424CHCL再加入超纯水稀释到4000; 3 2、提取液[v(甲醇):v(三氯甲烷):v(磷酸缓冲液)= 2:1:0.8]:526 ml CHOH加入263 ml CHCL再加入210 ml 磷酸缓冲液; 33 3、甲醇甲苯混合液[v(甲醇):v(甲苯):=1:1]:取100 ml 甲醇和100 ml 甲苯混合; -14、甲基化醋酸[c(CHCOOH) =1 mol?L]:4.60 ml CHCOOH加入80 ml 33超纯水; -15、甲基化氢氧化钾[c(KOH) =0.2 mol?L]:28.05 g KOH溶解于1000 ml 超纯水 中为0.5M KOH溶液，再取40 ml 0.5 M KOH溶液加入60 ml CHOH为0.2M KOH溶液。 3 PLFA提取操作 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 : 实验前准备工作 1、土壤过2 mm 筛，用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块; 2、20克左右土壤样品置于铝盒中，称盒+鲜土重 105烘干，称盒+ 干土重 计算土壤含水量; 3、配制试剂，准备实验用品。 注意:所有玻璃器皿(试管、小瓶及瓶盖等)在实验前均须用正己烷清洗，晾干。 实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。 实验第一天 1称取相当于8g干重的土壤，置于35ml 离心管中 ? 2向离心管中加入5ml 磷酸缓冲液(用5ml 移液枪，将含水量计入)， ? 再加入6ml 三氯甲烷，12ml 甲醇(用移液瓶) 3振荡2小时 ? 6上层离心液倒入分液漏?4加12ml 三氯甲烷，12ml?525?，3500 rpm, 离心10分钟 ?斗 磷酸缓冲液于分液漏斗中 7加入23ml 提取液于离心管中的剩余土壤中，手工摇动 ? 8振荡30分钟 ? 10 上层离心液倒 ?925?，3500 rpm, 离心10分钟 ?12 摇动2分钟，静置过夜 ?入分液漏斗 11下层加水，摇动，丢弃多余? 土壤，用清洗剂洗刷离心管 13将分液漏斗中下层溶液放入大试管A中 ? 实验第二天 15加3ml 三氯甲烷调节萃取小柱(5ml 移液枪) 1430-32?水浴，N浓缩 2?? 16 5份200微升三氯甲烷转移浓 缩磷脂到萃 ? 取小柱(用250或500微升移液枪，第1-2次 转移时直接从试管底部吸取，第3-5次转移时 则在转移前用移液枪冲洗试管内壁。 17向萃取小柱加入5ml 三氯甲烷 ? 弃去 18加2次5ml 丙酮 ? 19甲醇清洗萃取小柱底部 ? 20 加5ml 甲醇，大试管B 收集淋洗液 ? 2132?水浴，N浓缩 2? 22 加1ml 1:1 甲醇:甲苯，1ml 0.2M 氢氧化钾溶液，摇? 匀 23 37?水浴加热15分钟 ? 24加0.3ml 1M 醋酸溶液，2ml 己烷，2ml 超纯水 ? 25低速振荡10分钟 ? 27 下层加2ml 己烷，再振荡10分钟 26上层己烷溶液移入小?? 瓶 28上层己烷移入小瓶 ? 29N脱水干燥，不用水浴(如果3-4天内不上色谱检测则到此为止) 2? 30用移液枪加2次100微升己烷于干燥样品中，摇动 ? 31转入色谱仪专用的内衬管，2-3天内检测 322-3天-20?保存，超过3天-80?保存 ?? 注意事项 1 ,(所有实验用品应为玻璃或氟塑料(PTFE,聚四氟乙烯)，并且无脂。实验器材? 要用热水和无磷洗洁剂清洗。 用流动水冲洗掉泡沫后再冲洗,次，再用去离子水冲洗10次，风干。使用前用化学纯(reagent grade)氯仿冲洗;或在上述冲洗风干后在450?下烘干4~5小时。严格地说实验器材应避免使用橡胶、软木塞以及除了聚四氟乙烯之外的塑料制品。如果受经费限制，使用的普通塑料制品应为一次性的，并且与有机溶剂的接触时间要尽可能的短。 1 b(所用溶剂应为优级纯或者更高的等级。 ? 1)大部分实验者把将要使用的溶剂浓缩10~100倍后注入气相色谱仪，以观察溶剂是否有脂类污染。2)应谨慎的检查去离子水是否含有脂类;用有机溶剂(如正己烷，二氯甲烷)萃取50ml去离子水，浓缩萃取液，并注入色谱仪。3)重要的是，每批提取时应当作空白对照。这些空白样本除了不加入土样外所有操作都与其他样本相同。在以上三种情况下，气相色谱图没有波峰出现则说明没有脂类污染。 实验所用的有机溶剂及其配制的溶液易受光热影响，应保存于棕色试剂瓶中。 2 ,(这一步所加的缓冲液的量每个样本都不同，缓冲液和土样中的水分相加后要? 使得最终提取液中各组分达到v(甲醇):v(氯仿):v(水)= 2:1:0.8的理想体积比。(即水分总体积为5ml) 这一体积比适用于总脂含量15mg及以下的土样。含有更多脂类的更大的样本，需要更多体积的提取液和不同的提取液配方。 2 ,(有时，提取液在加入样品后会分为2相，这说明样品中含水量较大，可加入? 少量甲醇(<1ml)，震荡后静置。 2 ;(光、热、氧气都会引起脂类降解，因此应尽量减少样品暴露于上述三个条件? 中的机会。 7-11 对大体积或低生物量的样品要进行二次提取。 ?? 14 第14步结束后，如果无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N保护2? 下贮存于-20?或-70?下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或己烷，以进一步抑制氧化。 15 使用前一定要用氯仿清洗硅胶柱。不同的成品硅胶柱的清洗和活化方式可能会有? 差异，具体方法参见产品说明书。 再次强调，固相色谱柱一旦弄湿就决不能让它干掉。在分离过程中当停止液体流动时，最好保持柱子顶部有~100μl的溶剂。 16 试管底部可加热至37?以促进脂类融化。建议用手指托住试管底部体温加热，? 比较快捷可行。 17 这一步可洗除柱中的中性脂。 ? 18 这一步洗除柱中的糖脂。有文献认为大量洗除需要40ml丙酮的用量。最好让丙? 酮全部流出来，掺几滴随后流出的甲醇也无妨。 21 第21步结束后，如果无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N保护2? 或-70?下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或己烷，以进一步抑制氧化。 下贮存于-20? 23 每日制备新的甲基化氢氧化钾溶液。加入氢氧化钾这一反应产生FAME。 ? 24 在加入醋酸与加入己烷和水的过程中不能延迟。FAME很容易在水或者酸/碱基? 的存在下降解。加入己烷可以形成一个脂相，从而保护FAME不被水解。 26、28 宁可少收集一滴己烷也不能多流入一滴水相。总共有4ml己烷从反应试管?? 中移入小瓶。 29 碳链长度小于14的FAME无法用这种方法定量检测出来。 ? 如果要检测C或碳链更短的脂肪酸的含量，溶剂应当吹干至“一滴”而不是全部吹干。这一步完成后如果13 无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N保护下贮存于-20?或-70?下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或2己烷，以进一步抑制氧化。