放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡

放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡 第 6 卷 第 4 期 14 . 6 解 剖 科 学 进 展 V o lN o 2000 年 2000 PRO GR E SS O F A N A TOM ICA L SC IEN C E S 放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡 1 2 2 霍 霞 徐锡金朴英杰黄行许12( )汕头大学医学院中心实验室, 组胚教教研室, 汕头 515031, 第一军医大学中心实验室, 广州 510515 摘要 本实验利用放线菌酮建造细胞凋亡动物模型, 用原位末端标记和电镜 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 观察了大鼠肠系膜淋 巴结淋巴细胞凋亡的形态学变化。结果显示放线菌酮处理 4 后, 肠系膜淋巴结部分淋巴细胞处于凋亡状态,h 主要 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为细胞核凝聚, 染色质边集, 可见线粒体、内质网增殖, 自噬体和凋亡小体形成。结果表明放线菌酮 主要诱发肠系膜淋巴结生发中心的 淋巴细胞凋亡, 线粒体、内质网的增殖是细胞凋亡的一种主动行为。B 关键词 放线菌酮; 淋巴细胞; 细胞凋亡; 原位末端标记; 电镜 细胞调亡是机体为调控生长发育、维持自身稳 2 结果 定, 通过启动细胞自身的调节机制而发生的一种细 1 2. 1 原位末端标记凋亡细胞 胞死亡形式, 与细胞分化、胚胎发育、组织更新、系 经原位末端标记处理的标本实验组淋巴结组织 统成熟等生理过程以及肿瘤发生、老年痴呆、免疫缺 ()中有许多明显的凋亡细胞 图 1。 而对照组未见明 陷、病毒感染等病理过程密切相关。细胞凋亡在药物 显的凋亡细胞。 凋亡细胞核经 显色后为深棕 DA B 筛选、肿瘤治疗、预后判断, 疾病发生发展机制研究 色, 细胞多呈固缩状态, 主要分布在淋巴小结生发中 等方面有着广泛的应用前景。 本实验用放线菌酮作 心的明区。 未凋亡的细胞核不被 着色而呈正 DA B 用于大鼠, 用原位末端标记和电镜方法观察了肠系 常苏木精的蓝色。 细胞计数结果显示实验组凋亡率 膜淋巴结细胞凋亡的形态学变化, 进一步探讨凋亡 为 40. 2% , 对照组为 2. 6% , 两者间的差异经 检验 t 淋巴细胞线粒体、内质网的增殖现象, 自噬体在凋亡 有统计学意义。 淋巴细胞中的作用, 以及放线菌酮与淋巴细胞凋亡 2. 2 电镜观察 凋亡的淋巴细胞形态不规则、染色变的关系。 深。出现典 () 型的核凝聚 图 2, 多为整个细胞核凝聚, 形成圆形 材料和方法1 ( ) 或椭圆形电子密度高的均质块 图 2; 也有的是部 淋巴细胞凋 亡 模 型: 体 重 180, 200 g 的 雌 性 分核凝聚, 致密染色质块呈半月状或环状聚集于核 SD 大 鼠, 按 3 m gƒk g 体 重 腹 腔 注 射 放 线 菌 酮( ) 膜下 图 3, 4, 其 余 部 分 的 胞 核 电 子 密 度 低、染 色 ( ) , 对照组用 代替放线菌酮, 4 后处死 Se rva PB S h 浅、可见核仁。 凋亡淋巴细胞核在凋亡小体形成时, 动物, 取出肠系膜淋巴结。 核膜在核孔处断裂, 胞核崩解, 染色质块裂解为大小 原位末端标记: 肠系膜淋巴结组织 4?固定于( 不 等的核碎块, 被内质网或核膜包裹成自噬体 图 4% 多聚甲醛中, 石蜡包埋, 切成 5 组织切片, 按Λm )5。 凋亡淋巴细胞的胞质亦浓缩, 染色变深, 可见到 2 谭小华的方法进行原位末端标记。 光镜下用 16D ( )线粒体、内质网、糖元颗粒、溶酶体等细胞器 图 6。 目镜测微器做凋亡细胞计数, 共计数 500 个细胞, 求 ( ) 有的细胞器发生形态改变, 如线粒体增多 图 7, 这 出每组凋亡细胞的百分率。些线粒体常聚集于胞质一侧, 细胞核多被挤到另一 3 电镜标本制备: 将肠系膜淋巴结切成约 1 mm 侧, 线粒体结构异常, 表现为肿胀、嵴紊乱、结构不 大小组织块, 放入 2. 5% 戊二醛中固定 6 , 充 h PB S ()清、密度低、或空泡状, 甚至崩解 图 8。也可见内质 分漂洗后, 经 1% 锇酸后固定, 丙酮逐级脱水, ′ Sp u r r ( 网增多、多围绕于核周、胞膜下或密布于胞质内 图树脂浸透、包埋, 型切片机做超薄切片, 醋酸 s L KB 铀和柠檬酸铅双染色, 12002型透射电镜观 J EM EX )6, 9。部分凋亡淋巴细胞的胞质内亦可见由膜性结 察、摄片。 构分割、包裹的小体, 小体内除含上述的致密染色质 ( ) 块以外, 还可见空化的线粒体、脂滴、溶酶体等 图 5, 图 1 原位末端标记的凋亡淋巴细胞 × 400 图 2 凋亡淋巴细胞, 胞核致密、圆形或椭圆形 × 9000 图 3 凋亡淋巴细胞核部分凝聚, 致密染色质块呈半月形聚集于核膜下, 其余部分的胞核电子密度低、染色浅, 可见核仁 × 45000 图 4 凋亡细胞核致密染色质块呈环状聚集于核膜下 × 70000 凋亡淋巴 图 5 细胞内形成的自噬性凋亡小体 × 20000 凋亡淋巴细胞胞质内的细 ( ) ( ) 图 6 胞器, 如粗面内质网 ?, 线粒体 ?凋亡淋巴细胞内增多的线粒 图 7 体, 粗面内质网围绕于核周 × 17 000 图 8 ( ) 凋亡淋巴细胞内结构异常的线粒体, 核周、胞膜下有较多的粗面内质网 ?× 12000 图 9 ( ) 凋亡淋巴细胞内增多的内质网, 成团分布的线粒体 ?11 000 这些膜包小体也就是自噬性凋亡小体。 集成团, 推测增殖的线粒体可能是由原线粒体分裂 或芽生而来。 增殖的线粒体多出现肿胀、嵴紊乱、结 3 讨论 构不清、空化等畸形改变, 可能是增殖线粒体中的辅 () 有报道认为用蛋白质合成抑制剂 放线菌酮和 酶 催化生成大量活性氧, 大量堆积的活性氧又促 Q ( ) 合成抑制剂 放线菌素 可抑制细胞凋亡 m RN A D 进了细胞的凋亡。 3 的发生, 其机制是放线菌酮抑制了死亡蛋白的合 增殖的内质网可能和细胞膜、核膜等一起参与 成。但近年来的研究表明, 放线菌酮并不能抑制各类 4 分割和包裹各种细胞成分形成自噬体。 增殖的内质 细胞发生凋亡。2等报道用 L eddaCo lum b ano RN A 5 或蛋白质合成抑制剂可诱发大鼠肝细胞凋亡, Ijir i网还参与溶酶体的形成, 以利于自噬体的自噬过程, 8 报道可诱发小鼠肠腺细胞凋亡, 我们的研究结果显 我们将这种现象称为细胞的自噬性凋亡。 凋亡淋 示放线菌酮可诱发大鼠淋巴结淋巴细胞凋亡。 放线 巴细胞的膜性结构进一部分割包裹各种细胞成分并 菌酮诱发细胞凋亡的机制可能是放线菌酮阻制了死 脱落形成凋亡小体, 我们认为自噬体是凋亡小体的 亡蛋白抑制物的合成, 使得其对已经表达的死亡蛋 前体、是细胞凋亡早期的形态特征之一, 自噬体的形 白的抑制解除, 从而诱发细胞的自主死亡, 也可能是 抑制细胞功能蛋白的表达而诱导细胞凋亡。显然, 放 成是凋亡细胞自我消亡过程中的一个重要过程。 线菌酮具有抑制和诱导细胞凋亡的双向作用, 细胞 是否凋亡可能取决于细胞自身所处的发育阶段。 参 考 文 献 不同发育时期的细胞或不同种类的细胞对诱导 1 W ir le itne r B , B a ie r2B it te r lich G, Bo ck G. 7, 82D ih yd ro neop te r in 2 细胞凋亡的因素有不同的反应。 淋巴细胞对各种诱 induced apop to sis in J u rk a t T lym p ho cy te s: a com p a r iso n w ith an t i2F a s2and h yd ro gen p e ro x ide2m ed ia ted ce ll dea th. B io ch em 导细胞凋亡的因素如射线照射、病毒感染、化学药物 6 ( ) , 1998, 56 9: 1181P h a rm aco l 等最为敏感, 不足以引起其它细胞凋亡的小量射 谭小华, 张亚历, 姜泊, 等. 常规组织切片凋亡细胞原位末端标记 2 线、药物却可以引起淋巴细胞凋亡, 这主要归于淋巴 ( ) 方法. 细胞生物学杂志, 1997, 19 1: 48 细胞能够较快地激活其自我消亡机制, 以此来降低 . . Schw a r tz LM T h e ro le o f ce ll dea th gene s du r ing deve lopm en t3 , 1991, 13: 389B io E ssay s 基因突变的风险, 这是淋巴细胞的一种自我保护机 L edda2Co lum bano GM , Co n i P , F aa G, e t a l. R ap id induc t io n o f 4 制。 本实验观察到凋亡的细胞主要分布在淋巴小结 . , 1992, 140:apop to sis in ra t live r by cyc lo h ex im ideA m J P a tho l 生发中心的明区, 生发中心的淋巴细胞 95% 是中等545 大的 淋巴细胞, 提示放线菌酮主要诱导淋巴结中 B , . Ijir i K Po t ten SF u r th e r stud ie s o n th e re spo n se o f in te st ina l 5 的 淋巴细胞凋亡。B c ryp t ce lls o f d iffe ren t h ie ra rch ica l sta tu s to e igh teen d iffe ren t cy2 . , 1987, 55: 113to to x ic d rug sB r J C ance r 凋亡淋巴细胞除表现典型的核浓缩、染色质边 , . Co h en JJ D uk e RCA pop to sis and p ro g ramm ed ce ll dea th in 6 集、形成凋亡小体外, 我们还观察到凋亡淋巴细胞的 . , 1992, 10: 267imm un ityA nnu R ev Imm uno l 细胞器发生改变, 如线粒体增殖, 正常淋巴细胞内线 朴英杰, 董武, 霍霞, 等. Χ射线照射大鼠脾脏淋巴细胞凋亡及其 7 粒体较少, 故我们认为这可能是正在凋亡的淋巴细 ( ) 和巨噬细胞的关系. 电子显微学报, 1996, 15 2: 335 7 , , , . 2P iao YJ L iu L P H uo X e t a lR ad ia t io ninduced au top h ag ic 胞的一种代偿性反应。 考虑到增殖的线粒体多聚 8 . ,apop to sis o f ra t sp len ic lym p ho cy te sA c ta H isto ch em C y to ch em ( ) 1997, 30 526: 629 - Cyc lohex im idein duced A pop to s is of L ym phocy te in M e sen ter ic L ym ph Node s 1 , , , H u o X ia X u X ij in P ia o Y in g j ieH u a n g X in x u 1()C en t ra l L ab , D ep t. o f H ist2Em b ryo lo gy, Sh an to u U n ive r sity M ed ica l Co llege, Sh an to u , 515031 A bstrac t U sing th e SD ra t s a s an exp e r im en ta l m o de l o f apop to sis in lym p ho cy te s o f th e m e sen te r ic lym p h no de s w ith , . cyc lo h ex im ideth e st ruc tu re o f lym p ho cy te w e re o b se rved w ith in situ end labe ling and e lec t ro n m ic ro scop e tech n iqueT h e 4 re su lt s show ed th a t m any o f th e lym p ho cy te s d isp layed th e m o rp ho lo gy o f apop to sis af te r ho u r s t rea tm en t w ith cyc lo h ex2 , , im ide w ith sh r ink age o f nuc lea r p yk no siso r ch rom a t in co nden sa t io n and m a rg ina t io nm ito cho nd r ia and endop la st ic re t icu la , . p ro life ra t io nau top h ago som e s and apop to t ic bo d ie s fo rm a t io nO u r p re sen t study dem o n st ra ted th a t cyc lo h ex im ide m a in ly in2 . duced apop to sis o f B lym p ho cy te in ge rm ina l cen te r o f m e sen te r ic lym p h no de sT h e p h enom eno n o f m ito cho nd r ia and endo 2 .p la st ic re t icu la p ro life ra t io n w a s an ac t ive p ro ce ss o f apop to sis ; ; ; ; Key W ords cyc lo h ex im idelym p ho cy teapop to sisin situ end labe linge lec t ro n m ic ro scop e