慢病毒载体构建步骤

慢病毒载体构建步骤 一、简介 慢病毒(Lentivirus)载体是以 HIV-1(人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。 区别一般的逆转录病毒载体， 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快， 研究的也非常深入。 该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的， 因而使其应用受到较大的限制。 采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体 然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达 shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA， 实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默， 为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能， 以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为 siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶?启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶?有明确的起始和终止序列， 而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。 RNA 聚 当合酶?遇 5 个 T 时， 它指导的转录就会停止， 在转录产物 3’端形成 14 个 到连续 4 个或 U。U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶?依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游， 适合于表达,21ntRNA 和,50ntRNA 茎环结构 (stem loop) 在 siRNA 。表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成 siRNA; 也可由载体直接表达小发卡状 RNAsmall hairpin RNA shRNA 载体包含位于 RNA 聚合酶?启动子和 4,5T 转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 14 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构， 在细胞内进一步加工成 siRNA。 构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选) 二、实验 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 (大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、 。转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的 病毒颗粒，需要利用表达载体自己构建和包装质粒(购入)同时共转染细胞，在 293T 细胞购入中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中， 离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程: 1. 根据目的基因相关信息(序列，序列号等) ，构建含有外源基因或siRNA 的重组载体; (即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存) 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒; 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒(购入)共转染 293T 细胞1，进行病毒包装和生产，收集病毒液; 4. 浓缩、纯化病毒液; 5. 用高质量的病毒液感染细胞293T 细胞; 6. 通过定量 PCR 精确测定病毒滴度 (高精确滴定方法)和 Western 分析实验结果; 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞;检测基因功能或者 siRNA 的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选， 通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA 寡核苷酸序列的设计和合成将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR 扩增 2.回收 A( 酶切产物的胶回收:一般做 50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为 30ul。 B( PCR 扩增产物的胶回收 原理:首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳 DNA 片段， 分离目的条带 DNA， 然后紫外光下切割含目的 DNA 条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化 DNA 片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 在一定的高盐缓冲系统下高效、 专一地吸附 DNA、 RNA 的原理， 配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。 实验仪器:1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机 4、单面刀片 5、恒温水浴锅 试剂 :1、DNA回收试剂盒2 2、50×TAE3(电泳缓冲液 Tris-乙酸)3、ddH 2 O 4、琼脂糖凝胶4 步骤:1)使用 TAE 缓冲液制作琼脂糖凝胶， 然后对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳 (分离 DNA 作用)5。 2)在紫外灯下切分含 DNA 的琼脂糖 1.5ml离心管中。 3)按每 100mg 琼脂糖加块，尽可能除去多余的琼脂糖。放入 入 300—600μl 溶胶液6的比例加入溶胶液(本实验加 500ul)，置 55?水浴 10 分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每 2 分钟颠例混匀一次促溶。4)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心 1 分钟，倒掉收集管中的液体。再将吸附柱放入同一个收集管中。 5)在吸附柱中加入 500uI 漂洗液，室温静置 1 分钟后，12000rpm 室温离心 30 秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6)再在吸附柱中加入 500uI 漂洗液， 12000rpm 室温离心 15 秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 7) 12000rpm 室温空离心 1 分钟。 8)将吸附柱放入一个干净的 1.5ml 的离心管中， 在吸附膜中央加入 30ul 洗脱缓冲液， 室温静置 2 分钟后， 12000rpm室温离心 1 分钟 (为提高回收效率可再洗脱一次) 将 1.5ml 离心管DNA贮存于-20?。 9) ，琼脂糖凝胶电泳(鉴定作用)检测回收产物。 注意事项: 1)切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛; 2)溴化乙锭染色后的 DNA 易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 3)胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA 的回收率。 4) 把洗脱液加热， 使用时有利于提高洗脱液效率 3( 连接 器材:旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试剂:T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌 dd Water 。操作步骤 :PCR 产物(已纯化回收)与 T 载体直接连接: (1) 事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在 1416?C。 (2) 取 4 个灭菌的 200ul 微量离心管，加入: (需要调整) 4ml 目的基因 ; 1ml T 载体 ; 0.5ml T4 DNA 连接酶(TAKARA 350U/ul) 1ml 连 ;接酶缓冲液 10 x buffer ; 3.5 ml dd Water ，总量 10ml 体系。 (3)上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 14?C 干式恒温仪(或 14?C 水中)中保温过夜(12-16h) (4) 。连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置 4?C 冰箱备用。 4. 转化 原理:目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的 CaCl2 处理细菌的方法制备，即用低渗 CaCl 2 溶液在低温(0?) 时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。 此时细菌膨胀成球形， 外源 DNA 分子在此条件下易形成抗 DNA 酶的羟基,钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对 DNA 的吸收。在一定条件下，经过连接 后的,,,片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的,,,分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养， 即可筛选出转化体，即带有异源 DNA 分子的受体细胞。 目的:连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒。 器材:恒温摇床电热恒温培养箱台式高速离心机无菌工作台低温冰箱 恒温水浴锅 制冰机 分光光度计微量移液枪。 试剂:1.LB 固体和液体培养基7 2.含特定抗生素的 LB 固体培养基 3.100mM CaCl2 溶液。 4.待转化质粒 大肠杆菌感受态细胞制备步骤: 1) 从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于 3mlLB 液体培养基 ，37?振荡培养过夜(12h 左右) ，直至对数生长期。 2)取 0.4ml 菌液转接到40mlLB 液体培养基中，37?振荡培养 23h，至 OD600 值达到 0.5-0.6 之间。 3)菌液转移到 50ml 离心管中，冰上放置 10min。 4)4?离心 10min(4000r/min) 5)倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽 6) 用冰浴的 0.1mol/L 氯化钙 10ml 悬浮细胞， 立即冰浴 30min7)4?离心 10min )倒出上清液，用冰浴的 0.1mol/L 氯化钙 2ml 悬浮细胞(冰上放(4000r/min) 8 置) 9)分装细胞，200ul 一份，4?保存。 暂且不用的贮存于-70?可保存半年。取其中一份进行转化。 质粒 DNA 的转化 1)取 200ul 新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul 混匀，冰浴 30min 2)离心管放到 42?水浴锅中保温 90s(90s 一定要精确，不要摇动试管) 3) 将试管迅速转移到冰浴， 冷却 1-2min 4) 每管 ?培养 1h 5)取适当体积(100ul)的复苏细胞，涂加 800u l LB 液体培养基， 37 布在含有适当抗生素的 LB 固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置 30min 6)倒置平皿 37?，1216h，出现菌落 为了提高转化效率 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度:用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNAcccDNA。 一般情况下DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5,。 3. 试剂的质量: 所用的试剂如 CaCl2 等均需是最高纯度的GR.或 AR.并用超纯水配制最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行。 5(抽提质粒(碱裂解法提取质粒 DNA 原理: 本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 1)用 SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂， 释放出质粒 DNA 和染色体 DNA。 两种 DNA 在强碱环境都会变性。 2)当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 将迅速复性，而染色体 DNA分子巨大，难以复性。 3)通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA 及蛋白质沉淀(SDS 的作用下)除去，而质粒 DNA 留在上清中。 4)再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA。 纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离 子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒 DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室 中常用。 试剂: 1. 溶液?: 50mMmmol/L葡 萄糖，25mMTris-HClpH 8.0，10mM EDTApH 8.0) 1M Tris-HClpH 8.0) 。 12.5ml， 0.5M EDTA (pH 8.0)10ml，葡萄糖 4.730g， ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高压灭菌 15min ，贮存于 4?。 2. 加溶液?:0.2N NaOH，1 SDS。2N NaOH 1ml，10SDS 1ml，加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置(NaOH 作用是使细胞裂解) 。 3. 溶液?:醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5MKAc 300ml， 冰醋酸 57.5ml， ddH2O 至 500ml。 加 4?保存备用。 4. TE: 10mM Tris-HClpH8.0， 1M 1mM EDTApH 8.0。 Tris-HCl pH 8.0) ( 1ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 0.2ml， ddH2O 加至 100ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌 20min，4?保存备用。 5.苯酚/氯仿 /异戊醇(25:24:1) 6.乙醇(无水乙醇、70乙醇) 7. 5×TBE:Tris 碱 54g，硼酸 27.5g，EDTA-Na22H2O4.65g，加 ddH2O 至 1000ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌 20min，4?保存备用。 8(溴化乙锭(EB) :10mg/ml 9.RNase A(RNA 酶 A) :不含 DNA 酶DNase-free RNase A 的 10mg/ml，TE 配制， 沸水加热 15min， 分装后贮存于-20?。 10. 6×loading buffer(上样缓冲液) 0.25 :溴酚蓝，0.25二甲苯青 FF，40(W/V)蔗糖水溶液。 11. 1 琼脂糖凝胶:称取 1g 琼脂糖于三角烧瓶中， 100ml 微波炉加热至完全溶化， 冷却至 60?左右， EB 母 加液(10mg/ml)0.5×TBE， 加 至终浓度 0.5μg/ml(注意:EB 为强诱变剂，操作时带手 套) ，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡? 仓美淙?30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液 0.5×TBE) ，即可上 样。 仪器:1塑料离心管架(30 孔) ;2 10、100、1000L 微量加样器;3 1.5mL 塑料离心管(又称 EPPendorf 离 4低温高速离心机(20 000 r,min)一台;5无菌工作台 6高压锅，7常用心管) ; 玻璃仪器及滴管等。 质粒提取步骤: 1. 挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中， 37?、250g 振荡培养过夜(约 12-14hr) 2.取 1.5ml 培养物入微量离心 。管中，室温离心 8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于 100μl 预冷的溶液? (50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HClpH 8.0， 10mM EDTApH 8.0) )中，剧烈振荡，使菌体分散混匀， (且不至于沉淀) 4. 加 200μl 新鲜配制的溶液?，颠 。倒数次混匀(不要剧烈振荡) ，并将离心管放置于冰上 2-3min，使细胞膜裂解(溶液?为裂解液，故离心管中菌液逐渐变 清) 5.加入 150μl 预冷的溶液?(醋酸甲 AcK) 。 ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置 3-5min。溶液?为中和溶液，此时质粒DNA 复 性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时 K使 SDS-蛋白复合物沉淀。 6.加入 450μl 的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4? 离心 12000g × 10min。没有用PDS 沉淀干净的蛋白质置于下层 7.小心移出上清于一新微量离心管中， 加入 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，4?离 心 12000g×15min。 8.1ml 预冷的 70乙醇洗涤沉淀 1-2 次， 4?离心 8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。 9. 沉淀溶于 20μlTE(含 RNase A 20μg/ml) ，37?水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20?保存备用。 6(重组质粒克隆的鉴定 1)通过 PCR 方法鉴定:以重组质粒为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，PCR 产物的特异性引物或载体的通用引物进行 PCR 扩增后电泳鉴定。 2)酶切鉴定:双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了 7. 质粒 DNA 的含量及纯度鉴定 实验材料:质粒 DNA仪器:1稳压稳流电泳仪 2 可调微量移液器3水平电泳槽 (4)紫外分光光度计 5紫外透射仪等 试剂: (1)电泳缓冲液:Tris-硼酸(1×TBE)pH8.0。 (2)加样缓冲液(6×) :0.25 溴酚蓝，40蔗糖(3 溴化乙锭 (EB)溶液:10mg/ml 含量测定:紫外吸收法 溴化乙锭荧光强度法 纯度鉴定:紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳 测定 DNA 浓度的方法有两种: 紫外光吸收法:核酸在 260nm 处具有强吸收峰，所以通过测定 260nm 的吸收峰即可对 DNA 进行定量。但有时也会因为所处溶液的 pH 值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性 pH 值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。 溴化乙锭荧光强度法: DNA 含量很低以及样品中杂质含量高时， 当 会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入 DNA 中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与 DNA 总质量数成正比。 测定质粒 DNA 纯度的方法 琼脂糖凝胶电泳 四、慢病毒包装流程 4.1 实验材料 4.1.1、细胞株:293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM8含 10 FBS。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 4.2.2、菌株:大肠杆菌菌株 DH5α 。 用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 4.2.3、病毒载体系统组成 a pGC-LV 重组载体(已制备好的) pHelper 1.0;c pHelper 2.0 DNA ;b溶液的制备(见上面具 TE 中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，体步骤) :质粒 DNA 溶于除菌的 保证所提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1.8,2.0 之间。 4.2.4、试剂 台盼兰、 胎牛血清 FBS、DMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000 4.2.5、仪器 荧光显微镜、CO2 培养箱、生物安全柜、Plus-20 离心超滤装置 4.2 病毒包装细胞 293T 的培养 4.2.1、活细胞计数(台盼蓝染色) 用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200,2000 个 0.1ml 的细胞悬液中加入 0.1 ml 的 0.4的台盼兰溶/ml 一般稀释倍数为100 倍，在 液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 4.2.2、细胞株的冻存 1( 取培养 2,3 天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成 2×10 6 ,2×10 7/ml。 2( 在 1 ml 细胞冻存管中加入 0.5 ml 细胞悬液，0.4 ml 小牛血清和 0.1 ml 二甲基亚砜 9或甘油，混匀后密封。置 4?1 小时，-20?2 小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。 4.2.3、细胞复苏 1( 从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。 2( 迅速放入盛有 37?水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。 3( 用 70酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加 3 ml 含 10 FBS(胎牛血清)的 DMEM 培养基，置温箱培养。 4( 次日更换一次培养液后再继续培养。 4.2.4、细胞传代 1( 弃去旧培养液，加入 5 ml 灭菌 PBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去 PBS 溶液。 2( 加入 2 ml 胰酶消化液，消化 1- 2 min 直到细胞完全消化下来。3( 加入含 10胎牛血清和 100 U/ml 双抗的 DMEM 培养基 5 ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。 4( 混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。 4.3 慢病毒包装 细胞转染 1 转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T 细胞，以含 10血清的培养基调整细胞密度为 1.2 x 10 7 细胞/20 ml，重新接种于 15 cm 细胞培养皿，37 ?、5 CO2 培养箱内 培养。24 h 待细胞密度达 70,80时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。 2 转染前 2 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。 3 向一灭菌离心管中加入所制备的各 DNA 溶液pGC-LV 载体 20 μ g ，pHelper 1.0 载体 15μ g，pHelper 2.0 载体 10 μ g，与相应体积的 Opti-MEM10混合均匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育 5 分钟。 4 将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀，取 100μ l Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与 2.4 ml Opti-MEM 混 合，在室温下温育 5 分钟。 5 把稀释后的 DNA 与稀释后的 Lipofectamine 2000 进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在 5 分钟之内混合。 6 混合后，在室温下温育 20 分钟，以便形成 DNA 与 Lipofectamine 2000 稀释液的转染复合物。7 将 DNA 与 Lipofectamine 2000 混合液转移至 293T 细胞的培养液中，混匀，于 37 ? 5 CO2 细胞培养箱中培养。 8 培养8 h 后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入 20 ml 的 PBS 液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。 9 每瓶细胞中加入含 10 血清的细胞培养基 25 ml，于 37 ? 、5 CO2 培养箱内继续培养 48 小时。 4.4 病毒的收获及浓缩 1( 收集转染后 48 小时 (转染即可为 0 小时计起) 293T 细胞上清液。 2( 于 4 ?， 的 4000 g 离心 10 min，除去细胞碎片。 3( 以 0.45 μ m 滤器过滤上清液于 40 ml 超速离心管中。 4( 把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多 19 ml) ，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。5( 组合好后，做好平衡，放在转头上。 6( 在 4000 × g 离心，至需要.