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包涵体蛋白纯化方法的探讨.doc

包涵体蛋白纯化方法的探讨

身着华丽装的小丑
2017-10-14 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《包涵体蛋白纯化方法的探讨doc》,可适用于职业岗位领域

包涵体蛋白纯化方法的探讨按临床分期分组,,T期NFKB阳性表达明显岛于Tis,T期,这与NFKB在鼻咽癌组织中的表达情况类似提示,NFKB的高阳性表达率对膀胱肿瘤细胞向深层组织浸润有一定的促进作用,而不大影响肿瘤细胞的组织分化因此,栋床在手术之前,即可通过膀胱镜取组织活检,通过检测NFKB在膀胱移行细胞癌组织中的表达情况,判断膀胱肿瘤细胞向深层组织浸润的大致情况,为下”步制定治疗方案提供依据同时,临床若能采取某种干预措施干预NFKB在膀胱移行细胞癌组织中的表达,有可能改变膀胱移行细胞癌术后易复发的现状,从而改变今后膀胱肿瘤治疗的方向参考文献张薇,项永兵,刘振伟,等,年上海市区老年人恶性肿瘤发病趋势分析J中华老年医学杂志,,():魏矿荣,陈振雄,粱智恒,等中山市,年膀胱癌发病趋势分析J中国肿瘤,,():OrnsteinDL,ZacharskiLRIronstimulatesurokinaseplasminogenactivatorexpressionandactivatesNFkappaBinhumanprostateeallcer论着cellsllNutrCatlcer,,():ZhangJ,PengBInvitroangiogenesisandexpressionofnuclearfactorkappaBandVEGFinhighandlowmetastasiscelllinesofsalivarygndadenoidcysticcarcinomaJBMCCancer,,():KarlnM,IAnANFKBatthecrossroadsoflifeanddeathJNatIranmnol,,():Mayoj,】,BaldwinASThetranscriptionfactorNFkappaB:ControlofoneogenesisandcancertherapyresistanceJBiochimBiophysActa,,():LimJW,KimH,KimKHNuclearfactorkappaBregulatescyclooxygenaseexpressionandcellprolffemfioninhumangastriccancercellsJLabInvest,,():黄方,康瑞,吴春林VEGFC,NFKBp及Survivin在鼻咽癌中的表达及临床意义J山东大学(医学版),,():RamdassB,MaliekalTr,IakshmiS,etaCoexpressionofNotehlandNFkappaBsi~dingpathwaycomponentsinhumancervicalealleerprogressionJGynecolOncol,OO,i():(一O收稿)包涵体蛋白纯化方法的探讨陈颖,沈敏刘宝林摘要目的:探讨包涵体蛋白的表达条件及纯化方法方法:将PQE一Cysmfin转化大肠杆菌M,通过IPrc诱导蛋白表达为了能够获得可溶的且有活性的Cys~finC(CysC),本文摸索了CysC包涵体的复性条件及蛋白表达条件结果:改变缓冲体系pH值及离子强度等多种方法均不能减少蛋白在复性过程中的沉淀同时,改变蛋白表达的OD,培养基pH值,表达时间等均未得到可溶性的表达蛋白而改变诱导蛋白表达所用的IPTG浓度后发现在低浓度(raM)的IPTG诱导条件下,该蛋白有少量的表达,但是表达量明显低于mMIPTG的诱导条件结论:对于包涵体蛋白进行方法摸索的过程中,既要对包涵体蛋白本身进行研究,更要对蛋白表达条件进行进一步的优化,以表达可溶的蛋白关键词半胱氨酸蛋白酶抑制剂C包涵体可溶性表达StudyonMethodofPurificationofInclusionBodyProteinChenYing,ShenMin,LiuBaolinShanghaiLigongUniversitySchoolofMedicalEquimentandFood,Shanghai(),ChinaDepartmentofClinicalLaboratory,AutuHospital,Shanghai(ooo),ChinaAbstractObjectiveTo~tudytheoptimalconditionsforexpressionofinclusionbodyproteinandmethodofpurificationoftheproteinMethodsPQE一CysmtinCwastransformedintoEColiMandproteinexpreasionWasinducedwitllPTCOpfionforbetterrenaturafionoftheobtainedinclusionbodyproteinwerestudiedResultsWeedvariouswaysincludingchangesofbuffersystempHandionicstrength,aswellasODOOforproteinexpression,e~turemediapH,expressiontime……bailedtoobtainsolubleexpressionproteinHowever,weloweredtheconcentrationofIPTGsolutionfrommmolLtommolLandfinallyohtalnedaslightanaountofexpressedsolublefusionCystatinCproteinConclusionPresently,theamountofsolubleproteinobtainedwitlllowconcentrationofIPTGistoolittleforpracticaltLseandfurtherstudyisneededKeyWordsCysmfinC(CysC),inclusionbody,solubleexpression上海理工大学医疗器械与食品学院上海杨浦区安图医院检验科(ooo)年Anastasi等首次从鸡蛋清中分离纯化出高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,尔后命名为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystatinC,Cysc)J它由个氨基酸残基组成,等电点为,是一种碱性非糖化的低分子蛋白质,相对分子质量为JCysC又名一痕迹蛋白或球蛋白,是半肌氨酸蛋白酶抑制剂(cPs)家族中的一员,由所有的有核细胞以恒定的速率产生,在人体内可自由通过肾小球滤过,在近曲小管上皮细胞被分解代谢,不被肾小管重吸收和分泌,可用大肠杆菌(Ecu)进行表达J目前,对于包涵体蛋白的纯化方法主要有:将表达获得的包涵体进行变性,获得再折叠的可溶性蛋白,并采用亲和柱(如:M柱)对其进行纯化,将纯化得到的目的蛋白再复性使其重新折叠蛋白在重新折叠过程中容易受一些复性条件的影响而发生沉淀,那么对于这些蛋白可以对其表达条件进行摸索,找到其可溶表达的条件,然后再进行直接纯化目前对CysC的表达方式还是以融合表达为主,我们成功地构建了CysC原核表达质粒,并在大肠杆菌M中稳定表达现对其蛋白的表达及纯化方法进行以下探索材料和方法材料重组质粒与菌种:含CysC基因片段的重组质粒PQECysC为本实验室制备,大肠杆菌M为本实验室保存其它试剂:丙稀酰胺,甲叉双丙烯酰胺,CBBR购自Biorad公司PTG,SDS,AP,TEMED等购自华美公司溶菌酶:Promaga公司DNaseI:Sigma公司透析袋,超滤膜,超滤管等购自美国Milhpore公司蛋白纯化试剂盒及NiNTAAgaros柱料:QIAGEN公司JY一型超声波细胞粉碎仪来自宁波新芝生物科技公司PCA一型电泳仪来自BioRad公司o方法方法一:重组蛋白的表达:质粒PQEKOX转入大肠杆菌M感受态细胞中挑取单菌落进行培养(LB,含氨苄青霉素ml,卡那霉素m),摇动(rrain)培养,细菌生长在对数中期(OD值,)时加入异丙基BD硫代半乳糖苷(FrG,终浓度mmolL)诱导,每隔h取适量菌液进行电泳分析(SDSPAGE),诱导表达h表达产物的纯化和复性:诱导表达的菌液于rmin,离心min,沉淀加入LysisBuffer后,按照QIAGEN公司的NiNTAagarose使用说明书进行目的蛋白纯化将纯化后的样品装入透trr’~中,在PBS(含mmolDTF)中透析次用SDSPAGE鉴定分子量及纯度方法二:重组蛋白的表达:方法同上,诱导时加入IPTG的终浓度为mmolL振摇rmln,培养h,菌液于’E,rmin离心min,弃上清,收集沉淀洗涤:CysC表达菌在LB培养基中培养并诱导表达后,离心收集菌体,超声破菌冰浴条件下超声粉碎细菌条件:工作s或s间歇,全程时间min,功率W超声后的裂解液rrain,离心min,取上清纯化蛋白的鉴定:采用SDSPAGE电泳分析鉴定,用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度一结果经研究发现,方法一CysC蛋白在IPTG浓度为mmolL时,CysC蛋白表达量最高,但是CysC蛋白在透析复性的过程中发生沉淀,这可能主要因为透析过程中CysC蛋白所处的离子环境的变化而发生再折叠,从而发生沉淀而方法二,表明在IPTG浓度为mmolL时,获得了少量可溶表达的融合CysC蛋白说明IPTG浓度的改变能明显影响融合CysC蛋白的可溶性表达讨论大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的一种基因表达系统,它具有很多优点,如遗传背景清楚,基因操作方便,表达水平高,试验成本低等本文在成功构建CysC基因原核表达载体的基础上,利用大肠杆菌表达系统对CysC进行原核表达与纯化研究,以便为将来进一步探讨CysC的活性以大肠杆菌菌株为代表的原核表达系统,在短时问内能以低成本获得大量表达蛋白,表达载体带有强的启动子,在IFrG诱导下可高效表达,快速的蛋白合成使产物大量堆积,以至于没有足够的时间进行正确的折叠和二硫键的配对,形成包涵体沉淀J包涵体的提取方法已较为成熟,但是它却引入了一个变性复性过程影响复性的因素很多,首先是蛋白分子自身的理化特性,其次是目的蛋白质的浓度及复性体系的离子强度,pH值,温度,另外从变性体系到复性体系的转换速度也是重要的影响因素J很多蛋白质的复性过程很难控制,往往会形成蛋白沉淀,一些蛋白质甚至通过稀释或透析方法完全转换为复性体系后,由于环境的改变,而再次出现沉淀本文在进行Cysc融合蛋白的变性一复性过程中就出现过这种情况,在本文的透析复性阶段发现透析袋内出现一些蛋白沉淀,严重影响下一步工作在实验中,我们尝试改变缓冲体系pH值及离子强度等多种方法来减少蛋白在复性过程中的条件变化,但是仍然无法解决问题为了解决这个问题,我们把问题的关键放在蛋白的可溶性表达中,试探性地摸索了蛋白表达的OD,培养基pH值,表达时间等均未得到可溶性的融合蛋白,最后对诱导蛋白表达所用的IPTG进行进一步的摸索,结果发现在低浓度(mmolL)的IFrG诱导条件下,该蛋白有少量的融合表达,但是表达量明显低于mmolLWrG的诱导条件但是表达产生的少量的融合表达给以后的实验打下了基础参考文献周剑波,张廷,胡宏Cysmfinc在评价慢性肾病患者肾小球滤过功能中的作用J江苏大学(医学版),,():D覃文周血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测对诊断早期肾功能损害的价值J广西医科大学,,():陆焰,武建,宋朝辉半胱氨酸蛋白酶抑制剂c在早期肾功能损害诊断中的应用价值J中国卫生检验杂志,,():李进春,侯振半胱氨酸蛋白酶抑制剂C及其在肾脏疾病中的研究进展J现代预防医学,,():王蕾,陈凌燕,高锋半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在肿瘤研究中的进展J,():XiaL,BingXG,AnXT,eta】SerumCp~tincayfortledetecfinnfearlyrenalimpmrmentindiabeticpafien~JJcinLabAhal,,():He~etRosenthalS,FetdkampT,Vo~mchtL,etaMessurermentofurinalCystafinCbyparticleenhancednephelometrlcirrmmnoassay:precision,interferencer,stabilityandreferencerangeJArmClinBiochem,O,():卜黄琦,谢芝勋,庞耀珊,等猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基论着因在大肠杆菌中的融合表达与纯化J微生物学通报,,():孙强明,刘红岩,戴长柏,等huGMCSF(),IL()融合蛋白的复性及纯化研究J生物工程,,():(收稿,惨回)HN患者心肌标志物及常规生化检测的临床意义上海市公共卫生临床中心医学检验科()韩蓉周毅杨吉康王宏萍摘要目的:探讨心肌标志物及部分生化项目检测对于HN甲型流行性感冒患者(简称”甲流”)的临床意义方法:对例HN甲流患者(包括例重症甲流死亡患者)和例正常对照者用电发光免疫分析,全自动临床化学分析检测HlN甲流患者心肌标志物及常规生化项目结果:与正常对照组相比,甲型HN感染者在治疗前血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶同工酶Mb(CKMb),肌红蛋白(Mb),B型钠尿肽(proBNP),丙氨酸氨基转移酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP),谷氨酰转肽酶(GGT),门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平偏高(P),总蛋白(TP),白蛋白(Alb)偏低(P)HN甲流患者治疗前,后相比,CK,LDH,CKMb及Mb,AST治疗前水平偏高(P),TP水平偏低(P)死亡病例的心肌标志物指标:CK,LDH,CKMb,心肌肌钙蛋白(cTnT),Mb,proBNP及AST,TP,Alb,CREA均严重异常于其他比较组结论:HN甲流患者的心肌标志物及常规生化指标检测结果及其变化对于其诊疗及预后状况具有临床意义关键词新型甲型流行性感冒HN心肌标志物ClinicalSignificanceofSerumCardiacMarkersDetectionandRoutineBiochemistryTestsinPatientswithInfluenzaTypeAHNVirusInfectionHarIRong,ZhouYi’,YangJikang,etaDepartmentofClinicallaboratory,ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,Shanghai(),ChinaAbstractbiectiveTostudytheclinicalsignificanceofcardiacmfll’kel’fldetectionandroutinebiochemistrytestsinpailentsthinfluenzatypeAHNVirusinfectionMethodsSerumcardiacmarkerdetection(wi血ECLIA)androutinebiochemistrytestswereperformedinpatientsthHNinfluenzafincludingdeaths)andcontrolsResultsIepretherapylevelsofserunlCK,IJ)H,CKMb,Mb,proBNP,ALT,ALP,GGTandAsTinHNinfluenzapatientsweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrols(P),andP,ALBlevelsweresignificantlylower(P),nleprethempylevelsofeDllnCK,LDH,CKMb,MbandASTinHNinfluenzapatientsweresignificantlyhigherthanthelevelsaftertreatment(P)butTPlevelsweresii矗eanflydecreased(P)Thelevelsofallcardiacmal’ker$(CK,LDH,CKMb,cTnT,MbandproBNP)andAsT,P,Alb,CREAintlledeathswereverysignificantlydifferentfromthoseinothergroupsConclusionChangesofenllncardiacmarkersIcyelsandroutinebiechemistrytestswerefdiagnosticandprognosticsignificanceKeyWordsnewtypeinfluenzaAHNcardiacmfll’ker年在全球范围出现了一种新型甲型流行性感冒病毒HN(简称”甲流”),人体感染后主要表现为流感样症状,包括发热,流涕,咽痛,头痛和腹泻等流感病毒亦是导致患者心肌损害常见因素之一,而重症甲流患者则会出现多脏器功能不全或衰竭甚至死亡为了配合临床常规诊疗及预防,实验室对甲型HN感染者治疗前后的心肌标志物指标,肝,肾功能等常规生化项目做了检测和比较,从而为甲型HN患者的实验室检测诊断提供参考‘通讯作者材料和方法对象病例组:上海市公共卫生临床中心年月,月住院隔离的例(男,女)HN甲流患者(例为重症死亡者)诊断主要依据:有流行病学史,有发热,流涕,咽痛等流感样症状,咽拭子标本反转录聚合酶链反应(’cversctranscfiptasepolymerasechainreaction,RTPeR)结果阳性年龄()岁,平均o岁,均服用抗病毒药物奥司他韦,rag一日两次,疗程d正常对照组:例体检健康者,年龄(I)岁,平

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