牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间充质干细胞异位移植的实验研究

牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间充质干细胞异位移植的实验研究 河北医科大学 硕士学位论文牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间充质干细胞异位移植的实验研 究 姓名:王惠敏 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:刘 ?20090301 中文摘要 牙本质基质蛋白,基因转染骨髓间充质干细胞异位 移植的实验研究 摘 要 目的:牙齿是口腔颌面部的重要组织结构，牙齿的缺失不仅影响面部的美观，还对咀嚼和发音等造成不良影响。目前对于缺失牙多以义齿或种植牙修复。近年来组织 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学的发展为组织器官的修复开辟了一条新的途径，牙齿的组织工程学研究也不断的深入。作为包括牙齿在内的多种组织工程的种子细胞，骨髓间充质干细胞(,,,, ,,,,,,(,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,,,, ;,,,,，,,(,,,,)是近年来的一个研究热点。本文将牙齿发育相关蛋白牙本质基质蛋白,(,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,，,,,，)基因转染小型猪的,,,,,,,后，观察其形态的变化并将转染细胞以悬液的形式异位植入自体和异体宿主的股部肌肉内，,个月后取材组织学及免疫学观察其分泌基质及矿化的能力，为其今后作为种子细胞构建组织工程化牙齿提供实验依据。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :,猪,,(,,,,体外分离与培养 中国农业大学实验动物研究所购买,,月龄中国实验小型猪两只，分别编号为,(，、,(，，。,,戊巴比妥钠耳后肌肉麻醉，用,,号穿刺针于股骨大转子处穿刺，抽取骨髓,,,，置于肝素化的,,,,无菌培养液中，,,,,,,,,,离心,,,,,，弃上清，在含，,,,,,的,,,,，,,?,,,,,饱和湿度条件下培养。,天后全量换液，以后每周,次换液。两只实验 中文摘要动物的骨髓间充质干细胞分别命名为，(,,(,,,,、，，(,,(,,,,。, ,,(,,,,的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型鉴定 通过流式细胞仪检测细胞,,,,、,,,,、,,,,、,,,(,,、,,,,、,,,,、,,,,,表面抗原表达(委托河北医科大学第四医院肿瘤研究所)。, ,,,,基因转染及筛选 第三代细胞用于基因转染。转染前用含, ,,,,,的,,,,调整细胞浓度至,×,,,接种于,孔板中，,,,孵箱培养至,,,融合。采用脂质体介导方法将,,,,基因转染至,,(,,,,。,,小时后，按,:,,稀传至大培养瓶中，加入,,,, ,,, ,, ,,,,进行筛选，同时以未转染细胞作为对照。每 ,天换液,次。, ,天后未转染的细胞死亡，转染的细胞克隆生长，扩大培养备用。转染后的细胞分别命名为，(,,(,,,,(,,, ,、，，(,,(,,,,(,,, ,。,转染细胞的免疫组织化学检测 将筛选后的细胞，(,,(,,,,(,,,,、，，(,,—,,,,(,,,,培养于,孔板的玻片上，免疫组织化学,,法染色检测,,,,、牙本质涎蛋白(,,,,,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,)的表达，抗体滴度为,:,,,。同时以未转染的细胞作为对照。,转染细胞肌肉内异位植入 。植入前分别收集，(,,(,,,,(,,,,、，，(,,(,,,,(,,,,，并制备成细胞的,,,混悬液，调整浓度至,×,, ,,,,,。采用注射植入的方法，每一肢体注射四个位点，每点注射,,,,,,。具体情况如下:编号为,(，的小型猪的左、右下肢股部近心端内侧肌肉内分别植入，(,,(,,,,(,,,,(自体 中文摘要组)、，，(,,(,,,,(,,,，(异体组);编号为,(，，的小型猪的左、右下肢股部近心端内侧肌肉内分别植入，(,,(,,,,(,,,,(异体组)、，，(,,(,,,,(,,,,(自体组)。,标本取材及组织学和免疫组织化学观察 ,个月后处死实验动物，并切取细胞植入部位的肌组织， 立即置于福尔马林中固定。之后进行组织学染色观察植入细胞的情况，是否有牙本质样钙化形成。并用免疫组织化学,,法染色检测,,,的表达。 结果:,成功分离并培养出,,(,,,,，流式细胞检测显示为间充质干细胞来源。,通过脂质体方法成功将,,,,基因转染至,,(,,,,，免疫组织化学染色结果显示转染后的细胞,,,,、,,,呈阳性表达。,自体植入组组织学显示植入细胞在体内分泌基质并矿化，有类牙本质样结构形成。免疫组织化学显示埋入矿化组织内的细胞部分,,,呈阳性表达。,异体植入组组织学显示植入部位出现明显的炎症反应，中央区域组织坏死，周围被结缔组织包绕，其内可见散在分布的植入细胞，这些细胞免疫组织化学染色,,,呈阳性表达。但细胞并未表现出基质分泌活性。 结论:, ,,(,,,,易于获得并体外培养，并可通过脂质体基因转染方法获得,,,,基因转染的骨髓间充质干细胞,,(,,,,(,,,,。,体内实验结果表明自体,,(,,,,(,,,,可作为牙齿组织 中文摘要工程的种子细胞，而异体,,(,,,,(,,,,因为有明显炎症反应而需要进一步研究。 关键词: 文摘要,, ,牙本质;牙本质基质蛋白,;骨髓间充质干细胞;组织工程;牙齿 英,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,;,,,,,—,,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,,,;,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, , ,,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,，,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,:,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,—,,;,,, ,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,;, ,,,,,,’, ,,,,,, ,,,,;,,,，,,, ,,,, ,,, ,,,;,,,, ,, ;,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,(,,,，;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,(,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,;,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,, 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研究论文牙本质基质蛋白,基因转染骨髓间充质干细胞异位 移植的实验研究 (?‘(～?’ 刖 吾 牙齿缺失是口腔科常见的的问题，常对患者的身心造成不良影响。牙齿的组织工程学的研究向人们展示了一种全新的缺失牙修复方法，它的发展与成功必将给人类带来全新的体验。 种子细胞的的选择是牙齿组织工程面临的一个重要问题。,,(,,,,作为一种成体干细胞，具有多分化潜能，且来源广泛，易于体外分离培养和外源基因的导入，并且免疫原性低，因此自体及异体来源的, ,(,,,,被作为多种组织工程的种子细胞进行了大量研究【,,,。在牙齿组织工程方面，,,,,,,,等【,】将,,(,,,,与胚胎口腔上皮重组，培养一段时间后植入鼠的肾囊下，发现重组物可进一步发育形成一定量的牙体硬组织，提示其可作为牙齿组织工程的种子细胞。 牙齿发育是胚胎口腔上皮与间充质相互作用的结果，但是对能诱导间充质细胞发育成牙齿结构的胚胎上皮细胞不易获得，而且还涉及到伦理方面的问题。考虑到,,(,,,,较易于转染和表达外源的基因，且已有关于其它组织工程方面对基因转染后的,,—,,,,进行应用的报道【,】。因此我们将与牙齿发育密切相关的,,,,基因转染,,(,,,,，促其定向诱导分化，能过体内异位植入观察其牙向分化的潜能，为其进一步应用提供理论依据。 研究论文 材料与方法,材料,(,仪器设备,,,,,,一,,,,型生物安全柜 美国,,,,公司,,(,,,,,二氧化碳培养箱 美国,,,,,,半自动切片机 德国,,，,,公司,,(,,多功能显微镜 日本,,,,,,公司,,一,,,型倒置显微镜 日本,,?,,,公司,,一, ,,光学显微 ?,,,公司,,,,,离心机 镜 日本,,,,,,,公司倒置显微镜 日本,, 德国,,,,,,,,,公司,,,一,,,,超低温冰箱 日本,砧,,公司,一,,,,离心机 美国,,,,,(,,,,,,制冰机 美国,(,药品及试剂猪,,,,基因真核表达,,,,, 上海捷瑞生物工程有限公司(,,,,质粒 构建,,,,,,;,,,,,, ,,,,阳离子脂质体转染试剂盒 美国，,,,,,,,,,公司,,,,培养基 ,,,,,,,公司优等胎牛血清 ,,,,,,,公司胰蛋白酶 ,,,,,,,公司乙二胺四乙酸二钠(,,,,) 上海生工磷酸缓冲液 美国,，,,,公司羊抗鼠,,,,、,,,多克隆抗 美国,,,,, ,,,, 研究论文体免疫组化,,试剂盒 美国,,;,,,公司,实验方法,(,细胞培养前的准备,(,(,细胞培养所用玻璃器皿的处理 (,)自来水仔细冲净刷洗后，,,,,,中浸泡过夜，以中和 其碱性物质。 (,)洗洁净洗涤，去除器皿内外表面的杂质，自来水冲洗， 烤干。 (,)酸性清洁液中浸泡过夜。 (,)自来水冲洗,,次，双蒸水冲洗,(,次，最后用三蒸水 冲洗,次。 (,)电热干燥箱中烘干备用。 (,)用前高压蒸气,,磅，,,分钟消毒灭菌。 (,)取出后放入生物安全柜中备用。,(,(,细胞培养所用胶塞的处理 (,)洗洁净洗涤，自来水冲洗干净。 (,),,碳酸氢钠煮沸,,(,,分钟，自来水冲洗干净。 (,),,稀,,,浸泡,,分钟，冲洗，双蒸水漂洗,(,次， 最后三蒸水漂洗,次。 (,)晾干备用。 (,)用前高压蒸气,,磅，,,分钟消毒灭菌。 (,)放入生物安全柜中备用。,(,(,培养用液的准备 (,)青霉素和链霉素储存液(,,,,, ,,,,青霉素及,,,,,,,,,链霉素) 研究论文 青霉素 , ,,万单位 链霉素 ,, 溶于无菌三蒸水,,, ,,，每毫升含青霉素,,,,, ,，链霉素,,,,,,,，分装小瓶，(,,。,保存，使用时,,,,培养液中加入青链霉素混合液,,,，终浓度为青霉素, ,, ,,,,、链霉素,,,,,,,,。 (,)细胞用,×,,,( ,,,,,,(,,,, ,(,, ,,,,,,,(, ,,,, ,(,,, ,,,， ,, ,,， ,(,, 双蒸水加至,,,,,,，高压灭菌。,。,保存。 (,)细胞消化液 ,(,,,,,,,,,,配制 ,,,,,,, ,(,,, ,×,,,加至, ,, ,, 均匀溶解后无菌抽滤，(,,?保存，用时恢复室温。 (,),(,,,,,,, 配制 ,,,, ,(,,, ,,,,, ,,, 高压灭菌，,?保存。 用时恢复,,。,室温，用量与胰酶,:, (,),(,, ,配制 ,一,,, ,,,, ,,,,,蒸馏水，分装到,,,,小,,管内 无菌配置，(,,。,保存。 研究论文,(,猪,,(,,,,的分离培养、表型鉴定,(,(, ,,，,,,,的分离培养 中国农业大学实验动物研究所购买,,月龄中国实验小型猪两只，分别编号,(，、,(，，。粼戊巴比妥钠耳后肌肉注射麻醉后，用,,号穿刺针于股骨大转子处穿刺，分别抽取骨髓,,,，置于肝素化的,,,,无菌培养液中(,,,,的血清 中加入,(,,,肝素)，,,,,,,,,,离心,,,,,，弃上清，并在含,,,,,,的,,,,，,,?,,,,,饱和湿度条件下培养。,天后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每周,次换液。倒置显微镜下观察细胞达到,,,(,,,汇合时用,:,的,(,,的胰 蛋白酶和,(,,,的,,,,混合消化液消化传代。将所获得的 细胞分别命名为，(,,(,,,,(,,,,、，，(,,(,,,,(,,,,。,(,(, ,,—,,,,的表型检测 取第,代生长良好的细胞，先用,,,洗涤,次，消化液 消化成单细胞，,,,,,,,,,离心,,分钟，去上清液后再用,,, 洗涤,次。分别取含,×, ,,个细胞的悬液,,,,,，加入荧光 标记的抗体,,,,,，室温孵育,,,,,。,,,洗去未标记抗体， 用流式细胞仪检测细胞,,,,、,,,,、,,,,、,,,(,,、 ,,,,、,,,,、,,,,,表面抗原表达(委托河北省第四医院 肿瘤研究所、)。 ,(,基因转染 ,(,(, ,,,(,基因转染第,代,,(,,,, 转染前用含,,,,,,的,,,,调整细胞浓度至,×,,, 接种于,孔板中，,,,孵箱培养至,,,汇合。 转染步骤: 研究论文在含无血清、无抗生素,,,,,,,,,,玻璃试管中加入,,“,,,,,,,;,,,,,, ,,,,阳离子脂质体 ，在另,试管中加入无血清、无抗生素,,,,,,,,(,,，再加入 ,,,,,—,,,, ,“,。 ,混合脂质体与,,,稀释液，室温放置,,,,,，以形成脂质体 ,,,,复合物。 ,用无血清无抗生素的,,,,洗涤待转染细胞,次。 ,于脂质体,,,,复合物中加入,(,,,无血清无抗生素的 ,,,,，使总体积为,,,。 ,将,,,脂质体,,,,复合物覆盖在细胞上，轻轻摇动。 ‘,,,,,后，加,,,含,,,,,,的,,,,，继续培养,,,，然 后换成新鲜培养液培养,,,。,(,(,阳性克隆筛选 按,:,,稀传到大培养瓶中，加入,,, , ,,,“,,,,进行筛选，每四天换液一次，以未转染细胞作为对照。于荧光显微镜下观察细胞内荧光表达情况。,周后转染细胞呈克隆生长，胰酶消化后扩大培养，选第,(,,代的细胞进行实验。筛选后的细胞分别命名为，(,,(,,,,(,,,,、，，(,,(,,,,(,,,,。,(,(,免疫细胞化学检测,,,,、,,,表达: 研究论文 取筛选备用的细胞，培养于,孔板的玻片上，免疫细胞化学,,法检测,,,,、,,,的表达，抗体滴度为,:,,,。以未转染细胞作为阴性对照。具体步骤如下: (,)细胞爬片，,,,乙醇固定,,,,分钟 (,)清洗,分钟 (,),,, , , ,室温孵育,,分钟 (,)蒸馏水冲洗，,,,浸泡,分钟 (,),,,,,,,,,(,,,浸泡,分钟 (,),,正常羊血清，室温孵育,,分钟 (,)倾去血清，滴加,,,稀释的一抗，,,?、,, (,),,,冲洗,分钟×,次 (,)滴加生物素标记的二抗，,,。,、,,分钟 (,,),,,冲洗,分钟× ,次 (,,)滴加卵白素一生物素过氧化物酶复合物，,,?孵育 ,, (,,),,,冲洗,分钟×,次 (, ,),,,显色,,分钟 (,,)蒸馏水冲洗 (,,)苏木精复染、常规脱水、二甲苯透明、树胶封片,(,动物实验分组及细胞的肌肉内植入,(,(,实验动物分组 中国农业大学实验动物研究所购买,,月龄中国实验小型猪两只，编号为,(，、,(，，，互为异体移植对象。方法如下:在,(，的左、右后肢的股部内侧肌肉的近心端分别植入，(,,(,,,,(,,,,(自体组)、，，(,,(,,,,(,,,,(异体组);在,(，，的左、右后肢的股部内侧肌肉的近心端分别 研究论文植入，(,,(,,,,(,,, ，(异体组)、，，(,,(,,,,(,,,, (自体组)。,(,(,植入方法 以混悬液的方式植入:植入跋 ?胄牟?占 桑 拢停 停樱茫螅 模停校臁?桑桑 拢汀 停樱茫螅 模停校欤 校拢永胄南吹恿酱危 票赋上赴 模校拢踊煨 海 ?髡 ǘ戎粒薄粒保埃罚 恚臁?实验动物经,,戊巴比妥钠耳后肌肉麻醉。动物取仰卧位置于实验台上。先去除实验动物植入侧部位周围的毛发再进行皮肤消毒，然后在此区域用无菌缝线在间距,;,的两点分别穿过皮肤打结定点，在此间距内等距离四点用,,,注射器肌肉内注入相应细胞的混悬液各,,,,(,,，注射深度约,(,;,。,(,,,标本取材及处理 ,个月后处死实验动物，并切取细胞植入部位的肌组织，立即置于福尔马林中固定，制作石蜡切片，进行组织学观察，察看细胞在肌肉内的改变，是否分泌基质并有牙本质样结构形成，以及宿主的免疫反应情况。同时免疫组织化学染色检测,,,在细胞内的表达情况。 ,,免疫组织化学染色法检测,,,表达，其步骤如下: (,)组织切片常规脱蜡至水 (,)蒸馏水冲洗，,,,浸泡,分钟 (,)将切片浸于柠檬酸缓冲液中，微波炉内进行抗原修复 (,)室温冷却后，,,, ,, ,室温孵育,,,,分钟 (,)正常山羊血清室温孵育,,,,,分钟，倾去，勿洗 (,)滴加,,,稀释的一抗(,:,,)，,。,过夜 (,)倾去血清，滴加,,,稀释的一抗，,,?、,, 研究论文 (,),,,冲洗,分钟×,次 (,)滴加生物素标记的二抗，,,。,、,,,, ,分钟 (, ,),,,冲洗,分钟×,次 (, ,)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，,,。,、,,,, , 分钟 (, ,),,,冲洗,分钟×,次 (, ,),,,显色,,分钟 (,,)蒸馏水冲洗 (,,)苏木精复染、常规脱水、二甲苯透明、树胶封片 结 果,猪,,(,,,,的体外培养 从猪骨髓中获取的细胞培养接种于玻璃培养瓶中，于倒置相差显微镜下观察:,,,后可见圆形或卵圆形细胞贴壁生长;,,后贴壁细胞伸展成多角形或梭形(,,, ,)，未贴壁细胞可通过换液逐渐去除;约,周后细胞达到,,,(,,,融合，此时可进行传代培养。传代后细胞生长较原代快，多于接种后,,,天即可铺满瓶底(,,, ,)。, ,,(,,,,的表型检测 取第,代生长良好的细胞，流式细胞仪检测显示,,,,、,,,,、,,,,,表达阳性;,,,,、,,,,、,,,,、,,,(,,表达阴性( 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 细胞来源为间充质干细胞。, ,,,(,基因转染,,(,,,, ,,,(,基因转染,,(,,,, ,,后可见细胞由多角形或梭形改变为成纤维细胞样，有的细胞可呈柱状，并有极化表.