葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用,Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用,在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有
反相层析效果。虽然价位很高,但由于性能颇佳,可再生利用,所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少,对处理小样品较好,这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配
的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先
被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱,
Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先
被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要
靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后,就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相
两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为常见,先用水,逐渐
增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先
用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇
--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!要是把
Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯
仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件:
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须
要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统,用了很多年,效果较好。
(2) 饱和层析柱:
用洗脱剂将凝胶摇匀,直立柱身,让其自然沉降,此时要防止气泡留在其中。至
少半小时打开开关,流出几个柱体种的洗脱剂,目的是使其膨胀在正确比例的洗
脱剂中。
(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品,常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
(5) 洗脱:控制流速,一般1drop/s以下,可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。 再生以备下次使用。
6 分离的技巧,最后说说我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。 (2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝
惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中
优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。 (4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质 (6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献
参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分
离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。
Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成,属于分子筛凝胶,尤其适
用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如:类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽
等,Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的
制备,既可用于初步纯化步骤,也可用于最终精制步骤,如非对映同分异构体的
分离。
1.装柱
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分
布越窄),越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言,25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言,不能说分布均一,也
就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长
柱(最高至250cm)而言也是同样的。在装柱前,层析柱和储槽都必须进行彻底
的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中,要尽量避免过分
搅拌,否则会破坏球形胶粒,且要避免使用磁力搅拌器。 在室温下,将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时,溶胀后胶体积的大小决定于所
使用的溶剂系统,请参考后页之干胶溶胀
表
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计算特定柱体积所需要干胶的量。使
溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%,上层溶剂占25%,这时,悬浮液从一个容
器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱
要求
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均匀倒入柱内,在
保证胶粒不变形的前提下,应在尽可能高的压力下装柱,反压不要超过1.5ba。 2.平衡
上样前,用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止,如改变溶
剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高调节器的位置,如
使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。
3.洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
4.样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%,同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。
5.洗脱
洗脱流速应根据情况而定,最大线性流速约12cm/min(反压1.5ba),建议流速为1-10cm/h。总体来说,较低的流速,具有较高的分辩率。 6.再生
凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗,如更换洗脱液,则需要重
新平衡。
7.体积流速与线性流速的关系
线性流速=体积流速/横截面积
8.溶胀体积
由于Sephadex LH-20的溶胀体积依赖于溶剂,所以对于不同直径的柱可根据比
例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。 新体积=旧体积×(新柱体积/旧柱体积) 9.胶的性质
Sephadex LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质,且被分离物质的极性在分离过
程中起着重要作用。
10.排阻极限 4-5KD(与所用溶剂有关) 11.上样量
吸附模式 取决于所需分辩率
分子量大小 小于总体积的20%
正相分配 小于总体积的1%
12.其他
胶粒形状 球形,多孔
颗粒大小(干) 18-111um(直径) 颗粒大小中间值(干) 70um(直径) 颗粒大小(甲醇) 27-163 um(直径) 颗粒大小中间值(甲醇) 103 um(直径) 最大线性流速 720cm/min
参考线性流速 60 cm/min
pH的稳定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化学稳定性 在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。在pH2以下或强氧化剂中
不稳定
高压灭菌 121?可忍受20分种
操作温度 4?到40?
保存条件
新填料 4-25?(干燥)
使用后填料 4-8?,pH6-8,切勿冷冻,加入抑菌剂(如20%乙醇,0.04%叠氮钠)
13.干胶溶胀表
溶剂 床体积(mL凝胶/g干胶粉末) Dimethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.4~4.6 Pyridine 嘧啶 4.2~4.4
Water 水 4.0~4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8~4.2 Saline 生理盐水 3.9~4.1
Methanol 甲醇 3.8~4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8~4.1
Chloroform* 氯仿 3.8~4.1
Propanol 丙醇 3.7~4.0
Ethanol** 乙醇 3.6~3.9
Isobutanol 异丁醇 3.6~3.9
Formamide 甲酰胺 3.6~3.9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6~3.9 Butanol 丁醇 3.5~3.8
Isopropanol 异丙醇 3.3~3.6
Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3~3.6
Dioxane 二氧杂环已烷 3.2~3.5
Acetone 丙酮 2.4~2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2~2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8~2.2 Benzene 苯 1.6~2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6~1.8
Toluene 甲苯 1.5~1.6
*包含1%的乙醇
**包含1%的苯
***溶胀胶体积小于2.5mL/g的溶剂没有使用价值
Sephadex LH20使用心得谈:
1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料,使用请千万注意,很贵的哟!(当然,老板有钱就
另当别论拉)
2 先讲Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物
保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱,
Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,
极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后,其实就应该清楚Sephadex LH20 洗
脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为
常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇-
-水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一
定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛
呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯仿--
甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
5 分离的技巧,最后说说我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。
(2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁
可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。
(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质 (6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。 (7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶
剂将甲醇替换出来,待用
问:在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?
解答如下:
1 "在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响." 当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是Sephadex LH20很明显),一般在丙酮,乙酸乙酯 中收缩很厉害,所以一般不用丙酮,乙酸乙
酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积:
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容
液中溶呢?"
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同,但有时(其实是多数情况下),都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是
1 样品一定要溶解(Sephadex LH20很贵,要保护填料,我看植化的同志对好填料看得都很
重,职业问题,哈哈哈;同时,避免样品不溶解造成的脱尾)
2 溶解样品的体积尽可能小(色谱分离理论的基本要求,减小原始谱带宽度) 3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同(若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力
强,则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力;同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别
很大,样品可能以为溶解性的问题而析出。)
以上三点是上样的基本要求,有时很难求全,只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法
是满足1,2点,尽量满足第三点,“如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),
样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解”,请注意我的陈述“尽可能”,
3 "还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?"
如果实验室Sephadex LH20很珍贵,分道较纯再用, 如果实验室Sephadex LH20很普及,只要满足使用的注意事项,较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。日本的师兄都是用Sephadex LH20粗分,人家有钱,所以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵,你一定先用Sephadex LH20粗分,再用硅胶吧。有很多问题根本不是学术本身的问题,人也不可能在
真空中搞科研。哈哈,跑题了。
问:那上样体积与柱体积最小的比是多少?我用100克的填料,如果样品不好溶,那一次最
多能上多少毫升的样呢?
1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情况是很多的.一般解决的途径有两条:
1) 将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一
遍或几遍,这叫反复xxxx柱层,好处是工作量小(对比下面就知道了),在前后较纯的馏分,
如果目标组分量足够,可就乐去吧。
2 ) 将样品分几次分别分离,这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好,
但这样有一个很大的弊病,就是每次柱层的条件不可能保持完全一至,这样几次柱层分离的
馏分间的重现性就存在很大问题,再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中,合的太粗,就
如同 将样品一次全上柱的合并结果,只是工作量增大了。如果心中不甘,你中有我我中有
你的馏分,我也不知怎么合并了。
所以推荐的做法是将样品一次全上柱,再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果, 唉呀,我嘴苯,不知有没有说清。
2 100g填料已不少了, astra兄的样品如果实在太多,就只好分开上柱了.
3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定,在柱床体积的1/10吧。 问:分得效果不是很好,上了有8毫升的样,我用甲醇洗脱,结果用约一个保留体积就洗完
了,东西不仅越分越少,而且仍然和没上柱之前差不多,很让人困惑,郁闷。
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说的是Sephadex LH20不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是Sephadex LH20这种填料的特点:"洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积",
2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分之间分子大小差别不大,所以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了,如果你还用Sephadex LH20分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱. 1 A君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱,但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题.astra君请想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想办法吗!
2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.
1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好! 比国产水泵更好的是进口水
泵,比进口水泵更好的是隔膜泵,系统的密闭性就更重要了,特别是蒸像水,丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高,对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈,国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.
2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液, 效果棒极了
3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了
我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!
3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
Sephadex LH20柱子被弄脏了,大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,
2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染,办法如下 依次用水,NaOH-NaCl水溶液,水,甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染,所以
污染物一定不会完全死吸附在柱上(如果完全死吸附在柱上,污染物一定会只在柱头部分),
所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。
NaOH-NaCl水溶液配法: 8g NaOH ,30g NaCl, 1000ml水
看了上面战友们的讨论,感觉受益菲浅。小弟也来班门弄斧,发言不对之处,请各位兄台指
正:
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用,Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用,在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很
高,但由性能颇佳,可再生利用,所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少,对处理小样品较
好,这也是我们实验室常用的原因之一。
我用Sephadex LH-20的步骤是:
1.选择条件:
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在
尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室
常用正己烷二氯甲烷甲醇系统,用了很多年,效果较好。 2.饱和层析柱:
用洗脱剂将凝胶摇匀,直立柱身,让其自然沉降,此时要防止气泡留在其中。至少半小时打
开开关,流出几个柱体种的洗脱剂,目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
3.样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品,常压过滤。 4.湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
5.洗脱:控制流速,一般1drop/s以下,可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。
6.再生以备下次使用。
问:不知道用反响柱分离合用LH-20那个效果比较好.同时如果用同一根LH-20的话,洗脱剂
可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最
后用甲醇冲柱就可以了吧??
1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理,在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。如要
分离的物质在反相板上分离效果好,那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大,当然是Sephadex LH-20效果好。实际使用中往往上在一起配合使用,逐渐细
分为多个部分直到拿到纯品。
2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱(洗柱的时候当然要换)。如果改变流动相的极性,
会改变凝胶的膨胀率,分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错,反而达不到分离效果。
如果要分离的样品中极性相差较大,可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20 我们实验室用的LH-20柱一般就是甲醇:二氯甲烷(1:1)作流动相,如果冲不干净就换纯甲醇来冲,没碰到过你说的情况!根据LH-20在不同溶剂中的溶涨程度不同,如果你用
的溶剂溶涨系数接近的话,可能影响不大,如果溶剂之间溶涨系数相差较大,我想出现气泡
是可能的。(借用前面同学提供的数据)
以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积: water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
丙酮 0.8ml