食品微生物

学科专题课程论文     题 目: 食品中微生物快速检测方法研究进展           专 业: 食品科学与工程     班 级: 食工102班     学 号: 18110216     姓 名: 何聪     批阅教师:     成 绩:   2011年 月 日                   食品中微生物快速检测方法研究进展 何聪 摘要：本文介绍了食品中微生物检测的生物学方法、免疫检测技术、快速测试片法、免        疫磁球法和基因芯片技术。 关键词：微生物；快速；检测 随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质, 或导致食源性感染和食物中毒。利用传统的检测方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高；但涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重,而且要有大量人员参与。近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，有效的提高了检测效率和检验速度。现行一些快速检测方法用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面，大大缩短检测时间，提高了微生物检出率。食品中微生物快速检测方法包括微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等方面及其它们的结合应用。本文主要介绍分子生物学方法、免疫检测技术、快速测试片法、免疫磁球法和基因芯片技术。 1 分子生物学方法 1.1 核酸探针法[1] 细胞核酸DNA 和RNA 是唯一一类可以传递遗传信息的大分子，利用其可作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性的核酸序列，它可以通过补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要附加适当的标记，如放射性同位素、酶或者发光的标识物。以前研究使用的探针技术由于要使用放射性同位素，只能用于专门的实验室应用，所以现在比较热门的是以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计。这种方法依赖于核糖体R N A（t R N A）发育过程中储存的核酸成分进行检测。这种天然富含rRNA 标靶序列的使用使得无辐射检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或者更高的灵敏度。总的来说，核酸探针技术是一种理想的快速检测技术，但是也存在一定问题，就是每检测一种菌就需要制备一种探针，而且目前尚未建立所以菌种的探针，所以该技术还有待进一步发展。 1.2 聚合酶链反应法（PCR 方法） 聚合酶链式反应PCR (Polymerase Chain-Reaction1)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应．数小时后能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。即可将皮克(Pg)水平的DNA特异地扩增到能够检测的微克( g)水平，无须通过繁琐费时的基因克隆程序。便可以获得足够数量的精确的DNA 拷贝。目前PCR 技术已应用于微生物 检测有三种方法： （1）使用一套特异性的引物或一套由一个特异引物和一个普通引物所组成的引物，此种PCR 技术仅产生一种产物。 （2）用任意引物，得到一群长短不一的DNA 片段混合物，即RAPD — PCR(随机扩增多态DNA 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 多聚酶链反应技术)，此方法可以鉴别出腐败菌的种及其亚种。 （3）嵌套多聚酶链反应技术，由于某些微生物会对PCR 产生干扰，研究者对PCR 技术做了进一步的开发，这就是嵌套多聚酶链反应技术的应用。该技术区别于以上两种方法的机理在于操作中需要两套引物，第一套用于产生扩增的D N A 片段，此片段中含有第二轮PCR 引物的结合位点，第一轮反应产物被等分转入第二轮P C R 引物，扩增靶D N A 。 2 免疫检测技术 2.1 免疫检测技术的基本原理[2] 免疫学是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础。抗原是指能够刺激动物体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内或体外与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。作为抗原物质应具备的特点是异物性、高分子量和分子结构的复杂性。食品或食物中的许多大分子(包括蛋白质、酶、多糖、核酸及感染微生物等)都是良好的抗原，而一些小分子物质( 如激素、真菌毒素或农药残留物)可以通过与大分子载体(一般为蛋白质) 相结合制备成人工抗原。因此，从理论上看，食品科学中遇到的几乎一切物质都可直接或间接地作为抗原。抗体则是抗原引起的免疫应答的产物之一，可与引发的抗原发生特异性结合反应，据此可进行精确的定性定量的分析测定。 2.2 在食品检验中应用的主要免疫检测技术 （1）酶联免疫分析法(ELISA)[3] ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，其基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。国内在这个方面的研究工作开展得相对较晚，但也取得了一些进展。 （2）单克隆抗体检测技术 利用细胞培养和细胞融合技术制备出具有抗原特异性单一的抗体(单克隆抗体)，性能稳定，可辨认抗原物质结构的微细差异，并和抗原发生特异性结合，避免其它分子的干扰，能精确地测定抗原物质的含量。免疫学方法中的特异性抗体多采用多克隆抗体而单克隆抗体的报道不多，用于食品检测的更少。但单克隆抗体重复性好，特异性强，不容易发生交叉反应，其特异性已经引起各国学者的重视。 （3）其他免疫检测方法 早期的放射免疫分析法(RIA)，由于使用放射性标记物和缺少改进空间，现在已经使用得很少。近年来，用其他免疫方法对食品进行检测也有一些成功的报道，如免疫磁珠富集技术；利用单克隆抗体胶体金法(MOP)检测也有成功的例子，该方法采用高度特异性的抗原、抗体反应及免疫色谱分析技术，不需要对样品进行前处理。 3 快速测试片法 快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法[5]。这是一种集化学、高分子学和微生物学于一体的检测方法。采用快速测试片检测具有显著的优点 ：第一,快速测试片可测定少量检品,不需要配制试剂,不需要大量的玻璃器皿,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价格低廉,加之除纸片外无其他任何废液废物,大大减少或消除对环境的污染,以及试验后的清洗工作,减少了工作量。另外,避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷,故适用于实验室、生产现场和野外环境工作使用。第二,快速测试片可以在取样时同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,防止延长接种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多。第三, 常规法一般需要时间较长,而且要特定的温度,这样导致许多基层单位和食品企业不能实施,也不能达到及时检测的目的。而测试片无需进行使用前的准备工作,大大缩短了时间。 4 免疫磁球法(IMS) 免疫磁珠分离法可将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面。与样品中被检微生物发生特异性结合。载有致病微生物的磁性微球在外加磁场的作用下向磁极方向聚集。因此可特异性地将目的微生物从样品中快速分离出来。该方法与一般细菌培养分离法相比，极大地提高了食品中病原性副溶血性弧菌的检出率；与常规检验方法相比，免疫磁性分离技术具有显著的优点。可以快速地从含有大量杂菌的悬液中有选择地分离出目的微生物。若与直接镜检技术、酶联免疫技术、PCR 等快速检测方法相结合，免疫磁性分离技术可大大提高致病微生物的检测效率[7]。 5 基因芯片法 基因芯片技术是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA 经PCR 扩增后制备荧光标记探针，再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。基因芯片技术可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测。它在理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原．可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标；同时具有灵敏、特异和快速便捷等优点．因而在致病微生物检测中有很好的发展前景。Borucki等[8 ]如1 构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物：Vol0kh ov[9 ]通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别6 种李斯特菌：Call等[10]通过分析E．coli0157：H 7的Sh ig a 样毒素I、Sh ig a 样毒素Ⅱ及溶血素A，发现基因芯片可准确检测各种E．coli 0157：H 7分离物。目前虽然在样品采集、处理以及基因芯片技术等方面取得了很大的进展。然而要更广泛地应用基因芯片技术检测食品微生物，还需解决诸如建立 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化程序、降低检测费用、简化样品制备和标记操作、进一步提高检测的特异性等一系列问题。 6 结束语 新世纪世界性科技革命正在形成，各国都在加速技术创新和科技进步。从定性和定量检测技术两方面出发，准确、可靠、方便、快速、经济、安全检测方法是食品中微生物检测的发展方向，尽可能使快速检测技术的灵敏度及准确度要能达到标准限量 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ，至少要与标准方法检测结果相当，能在较短的时间内检测大量的样本，还必须具有实际应用价值。食品中微生物的快速检测技术正在迅猛发展，虽然很多技术依然存在一定的问题，但其应用价值日显突出。 参考文献 [1] 杨向荣，江志毅等.快速方法在食品微生物检测中的应用[J].学术论坛.2006.5 [2] 李军生，叶云等.免疫检测技术在食品检验中的应用[J].广西工学院学报. 2003,16（1）:23- 26.