【word】 姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究

【word】 姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究 姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作 用的研究 中国实用医药2010年6月第5卷第17期ChinaPracMed,Jun2010.Vo1.5.No.17 姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用 的研究 蓝育青郑海生张弛周怀胜郭慧 【摘要】目的研究姜黄素对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,探索防治青光 眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径.方法用0,8Og/Inl姜黄素作用体外培养的人眼Tenon囊成 纤维细胞,观察24—96h后不同浓度姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的影响.CCK-8法检测细胞生 长活性.结果在0,8Oml浓度作用24,96h范围内,姜黄素可以抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的 增长,且呈剂量和时间依赖性.结论姜黄素可抑制体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖. 【关键词】姜黄素;青光眼;Tenon囊成纤维细胞;CCK一8 InhibitioneffectsofcurcnminonhumanTenoncapsulefibroblastinvitroL4 ?Yu—qing.ZHENGHai— sheng,ZHANGChi,eta1.DepartmentofOphthalmology,theSecondAffiliatedHo~italofSunYat—SenUniversi— ty,Guangzhou510120,China 【Abstract】 0bjectiveToinvestigatetheeffectofcurcuminonproliferationofhumanTenoncapsulefi- broblastinvitro.MethodsTheCCK-8methodwasusedtoassaytheactivityofhumanTenoncapsulefibroblast at24h,48h,72hand96haftertreatedwith10,20,40,8Og/mlcurcumininvitro.ResultsrI’heactivity ofhumanTenoncapsulefibroblastat24h,48h,72hand96haftertreatedwith10,20,40,80g/mlcurcu- minwasinhibitedsignificantlycomparedwiththecontrolanditwasdose.dependentandtime-dependent.Con- clusionTheproliferationofhumanTenoncapsulefibroblastwasinhibitedsignificantlybycurcumin. 【Keywords】 Curcumin;Glaucoma;Tenoncapsulefibroblast;CellcountingKit一8 青光眼已成为世界范围内占第二位的不可逆性致盲眼 病,而滤过手术是治疗青光眼的重要手段之一,其方法是通过 被切除的小粱组织形成一滤过通道,使房水外流从而达到降 低眼压,保存残存视功能的目的.但滤过手术存在10%, 30%的失败率j,其失败的直接原因主要是滤过口处成纤维 细胞的增殖,迁移而导致滤过道的纤维瘢痕化,使滤过通道堵 塞.这也是青光眼临床与研究中所面临的难 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 之一,术中应 用抗增殖药物如丝裂霉素(mitomycin,MMC)经术后的临床观 察可提供手术的成功率,但也存在一定的毒副作用限制其使 用.因此许多眼科工作者为防治滤过手术的失败而寻找安 全,有效抑制成纤维细胞增殖的方法进行着不懈的努力.姜 黄素是一种历史悠久的传统中药,具有多种疗效:抗纤维增殖 作用],抑制血管生成],抗肿瘤作用],抗氧化作用_5J,抗 炎作用等多种药理作用,且无明显毒副作用具有较好的临床 应用前景.目前其在对其他器官和组织的成纤维细胞方面的 研究和应用中取得了一定的成果和进展,但在研究姜黄素对 人眼Tenon囊成纤维细胞中的作用还比较少,为研究姜黄素 对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞的抗增殖的作用效 果,从而探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径, 提高青光眼手术成功率.笔者 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 以下实验. 1材料和方法 1.1材料与主要仪器设备 1.1.1试剂CCK-8(CellCountingKit一8)(Dojindo公司),姜 黄素(购自SIGMA公司),vimentin单克隆抗体(博士德公司) 基金项目:广东省中医药管理局基金(项目编号:2007106) 作者单位:510120广州,中山大学附属第二医院眼科 ? 论着? ,DAB显色试剂(博士德公司). 1.1.2主要仪器设备CO培养箱(德国HeraeusBB16),手 术显微镜(德国Zeiss),光学倒置显微镜(德国LeicaMPS- 30),WellscanMK3酶标仪(美国LabsystemDragon), 1.2方法 1.2.1人眼Tenon囊成纤维细胞的培养,鉴定眼球结膜下 Tenon囊组织标本为中山大学附属第二医院眼科青光眼手术 切除组织,采用组织块培养法原代接,第3,6代细胞用于实 验.按常规方法培养细胞,并活体显微镜,组织学观察与 进行细胞照相.利用盖玻片培养法进行HE染色,并取第3 代细胞按免疫细胞化学试剂盒说明书作Vimentin染色鉴 定细胞. 1.2.2CCK.8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的 增殖的影响实验方法,步骤:?取处于对数生长期的Tenon 囊成纤维细胞以10%胎牛血清的高糖DMEM制备为2500 个/ml细胞悬液,每孔加入100的细胞悬液分别接种于4 块96孔培养板中培养24h,贴壁;?至细胞长至单层后,分别 在细胞中加入终浓度为10,2O,4O,80ml的姜黄素,同时 设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照,每组设4个 复孔;?再将96孔培养板分别培养24,48,72,96h后,向每孔 中加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养基100l及10 ~ICCK.8继续放入培养箱内培养3h;?酶标仪检测450nm 处各孔OD值;每组实验重复3次. 1.2.3细胞增生抑制率的计算根据CCK-.8的吸光度(A) 值计算出细胞增生抑制率并绘制时间,剂量效应曲线.增生 抑制率%=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值 X100% ? 2?中国实用医药2010年6月第5卷第17期ChinaPracMed.Jun2010.V0】.5,N0.17 1.2.4统计学方法所有数据用SPSS11.0软件包处理,实 验结果数据计量资料用(x4-s) 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示,CCK-8对人眼Tenon囊 成纤维细胞抑制率的浓度和时间关系采用多组定量资料的单 因素方差分析进行统计分析. 2结果 2.1人眼Tenon囊成纤维细胞的体外培养及生物特性鉴定 2.1.1体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞的形态特征和生 物特性倒置相差显微镜下观察细胞,可见原代培养的组织 块约一周后细胞开始从组织块周边游离出来(图1A),胞体 狭长,透亮,胞浆丰富,核圆形,椭圆形.胞膜清晰,呈典型的 梭形,繁殖较快,约2—3周细胞增殖基本融合,细胞变长,靠 近,呈放射状或漩涡状走行(图1B). ?一图1人眼Tenon囊成纤维细胞原代与传代培养A.原代培养的 组织块约6,7d后细胞开始从组织块周边游离出来B.成纤维细胞 胞膜清晰,呈典型的梭形,呈放射状或漩涡状走行 2.t.2人眼Tenon囊成纤维细胞组织学观察HE染色及免疫 细胞化学鉴定细胞经HE染色,可见细胞呈两头尖的长梭 型,不规则.胞核较大,色浅蓝,位于细胞中央;细胞胞浆丰 富,色淡红,细胞膜清晰(图2A).细胞经免疫化学Vimentin 染色,可见阳性产物呈棕色,均匀分布于细胞的胞浆中(图 2B).根据组织的取材部位,细胞的形态并结合免疫细胞化 学的鉴定可确定实验中所培养的细胞为人眼Tenon囊成纤维 细胞. l圈图2人眼Tenon囊成纤维细胞HE染色与鉴定AHE染色,呈长 梭型,胞核较大,色浅蓝,位于细胞中央;胞浆丰富,色淡红B经Vim? entin染色,阳性产物呈棕色,均匀分布于细胞的胞浆中 2.2CCK.8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖 的影响CCK.8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增 殖的影响结果见表1,并根据不同浓度姜黄素组在不同时间 里对细胞的抑制率绘制时间,剂量效应曲线(图3). — _.一10ugmh卅:0u~:mh40蟛rahgOu~’mi 图3不同浓度姜黄素组在不同时间里对人眼Tenon囊成纤维细 胞的抑制率变化 表1姜黄素对Tenon囊成纤维细胞增生的影响(4-s) 注:单因素方差分析表明各实验组与对照组相比,P<0.01;与临近浓度组比较,?P<0.01;与临近时间组比较,?P<0.05 即姜黄素浓度?10ml时,能抑制人眼Tenon囊成纤黄素能够通过抑制蛋白激酶c,(PKCe)的表达诱导体外培 维细胞的增殖(P<0.01),并随药物浓度的升高,时间的延养的硬皮病肺成纤维细胞(sclerodermalungfibroblasts,SLF) 长,姜黄素对Tenon囊成纤维细胞的抑制强度逐渐加大(P<发生凋亡.同样高蔚等在研究姜黄素对大鼠肺成纤维细 0.01).72h以上姜黄素对细胞的生长抑制率基本稳定.胞(MLF)增殖和凋亡的影响中发现姜黄索对MLF有抑制作 3讨论用,存在剂量依赖与时间依赖性.本实验所得结果基本上与 青光眼是仅次于白内障的导致视力丧失的主要原因.据上述研究发现一致,这说明姜黄素对不同组织中成纤维细胞 流行病学研究资料表明,全球原发性青光眼的患者约超过增殖都有抑制作用.但姜黄素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞 6680万人,其中约10%失明,因此对青光眼的防治是防盲治的分子机制仍不清楚.目前,国内外在对姜黄素抑制各种肿 盲公共卫生工作的重点之一,具有重大的意义.目前,滤过手瘤细胞或类肿瘤细胞作用机制研究中发现可能与对细胞信号 术是青光眼治疗的重要手段之一,但有些患者术后却因滤过传导及各种细胞生长因子的影响有关.如可能与下调 道的纤维瘢痕化,使滤过通道堵塞而导致手术的失败.通常NF-kappaB,抑制iNOS,COX-2活性有关.而姜黄素对人 滤过通道的瘢痕形成中一个主要的原因是:手术创伤刺激手眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制是否同样存在相似的机 术部位的Tennon囊下间隙使成纤维细胞增殖,移行,释放胶制,这也是下一步需要研究的问题. 原蛋白,引起纤维血管反应和伤1=1的收缩,纤维瘢痕形成,导在本实验中所用的CellCountingKit-8(CCK-8)法评价 致滤过失败.因此本课题为了探索防治青光眼手术区滤姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖影响是用于测定细 过泡纤维瘢痕化的新途径,提高青光眼手术成功率,设计了此胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度,无放射性 实验.本实验直接从人眼Tenon囊组织中培养出成纤维细的比色检测法.其利用了四唑盐一wsT.8(2一(2-甲氧基_4.硝 胞,其生物学特性符合人眼病变的情况.笔者通过姜黄素作苯基)一3一(4一硝苯基)-5.(2,4-二磺基苯)-2H.四唑单钠盐),它 用体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞发现:在0—8Og/rrIl在电子载体1.MethoxyPMS存在的情况下能够被还原成水溶 浓度作用24—96h范围内,姜黄素可以抑制人眼Tenon囊成性的甲躜染料.CCK-8溶液可以直接加人到细胞样品中;不 纤维细胞的增长,且呈剂量和时间依赖性.姜黄是一种姜科需要预配各种成分(比较M,rr法减少了加DMSO的步骤,从 姜黄属的草本植物,具有多种疗效.Elena等研究发现,姜而可进一步减少实验中因操作引起的误差).WST-8被细胞 屯国塞医药2010年6月第5卷第17期ChinaPracMed,Jun2010,Vo1.5.No.17 丹参对原发性高血压患者hs—CRP,sICAM一1 及内皮功能的影响 张淑涛 【摘要】目的探讨丹参对原发性高血压患者炎症因子hs.CRP,sICAM一1及血管内皮功能的影响. 方法82例原发性高血压病患者,随机分为对照组(41例)和丹参组(41例),治疗14d后,采用放免法 测定CGRP,6一Keto-PGF1a,ET一1,TXB2;ELISA法检测血清slCAM.1;激光散射比浊法测定hs.CRP.结果 丹参组治疗后炎症因子hs-CRP,sICAM-1下降明显;血浆ET一1,TXB2下降,CGRP,6-Keto.PGF1ct上升 显着,与对照组比较,差异具有显着性(P<0.01orP<0.05).结论丹参能够明显减轻原发性高血压 患者炎症反应,抑制ET,TXA2和提高血管内皮CGRP,PGI2的作用,其保护血管内皮功能疗效显着. 【关键词】原发性高血压;炎症因子;血管内皮功能;丹参 Theeffectofsalviamiltiorrhizaonthehs-CRP.slCAM-1andthevasculareado thelluminessentialhy- pertensionpatientsZHANGShu—tao.eAffiliatedzhongshanhospitalofDal ianUniversity,Dalian, ll6001.China 【Abstract】 ObjectiveToexploretheeffectofsalviamiltiorrhizaontheinflammatorymediatorshs- CRP.sICAM一 1andthevascularendotheliainessentialhypertensionpatients.Methods82essentialhyperten— sionpatientswererandomlydividedintocontrolgroup(n=41),salviamiltiorrhizagroup(n=41),1helevels ofCGRP,6一Keto—PGF1 仪,ET-1,TXB2weredeterminedbythemethodofradioimmiunity,theserumlevelof sICAM-1weredetectedbyELISAwhilethelevelofhs-CRPweredetectedbythemethodoflasernephelometry aftertwoweekstreatment.ResultsAftertreatment,insalviamiltiorrhizagroup,theinflammatorymediators hs—CRP,sICAM-1weresignificantlydecreased,,I’helevelsofplasmaET-l, TXB2weresignificantlydecreased and山elevelsofplasmaCGRP.6一 Keto.PGF1weresignificantlyincreasedmuchmorethan山oseinthecontrol group(P<0.olorP<0.05).ConclusionSalviamihiorrhizahasinhibitioneffecttheinflammatoryreacton theessentialhypertensionpatients,andcaninhibvitioneffectonET,TXA2betelevatesCGRP,PGI2,iteffect onprotectionofvascularendotheliaofessentialhypertensionpatientsissignificant. 【Keywords】 Essentialhypertension;Inflammatorymediators;Vascularendothelialfunction;Salviamih— iorrhiza 作者单位:116001大连大学附属中山医院循环内科 ? 3? 内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲躜染料能够溶解在组织培 养基中,生成的甲躜量与活细胞数量成正比.与其他研究体 外培养细胞中研究细胞增殖的实验方法相比,CCK一8法检测 细胞增殖实验的灵敏度比其他四唑盐如MTT,XTr,MTS或 WST-1高,误差小,并且CCK-8溶液相当稳定,对细胞没有毒 性,因此可以长时间孵育.因此,CCK一8比色检测法在检测细 胞增殖中正成为一种主流方法. 在本实验初步证实了了姜黄素对体外培养的人眼Tenon 囊成纤维细胞具有抗增殖作用,为下一步进行动物实验提供 了研究基础,同时对姜黄素防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢 痕化,提高青光眼手术成功率提供了理论依据. 参考文献 [1]MelamedS,FiorePM.Mohenoimplantsurgeryinrefractoryglaueo- 448. ma.SurvOphthalmol,1990,34(6):441— [2]解克芳,牛建昭,王继等.姜黄素对人胚肺成纤维细胞的生长 抑制及细胞外基质合成的影响.医学研究生,2008,21 (4):339-342. [3]杨和平,李剑明.姜黄色素活性单体成分抗血管生成的实验研 究.第三军医大学,2005,27(11):1068—1070. [4]ChoudhuriT,PalS,AgwarwalML,eta1.Curcumininduces印一 optosisinhumanbreastcancercellsthroughp53dependentBaxin- duction.FEBSLett,2002,512(123):334-340. [5]BonteF,Noel—HudsonMS,WepierreJ,eta1.Protectiveeffectof curcuminoidsonepidermalskincensunderfreeoxygenradical stress.PlantaMed,1997,63(3):265-266. [6]蓝育青,宋欣,肖剑晖,等.载5一氟尿嘧啶聚乳酸纳米微粒对人 眼球筋膜囊成纤维细胞抑制作用的研究.中华眼科杂志, 2009,45(1):26-31. [7]DesjardinsDC,ParrishRK,FolbergR,eta1.Woundhealingafter filteringsurgeryinowlmonkeys.ArchOphthalmol,1986,104 (12);384—386. [8]ElenaT,PalG,JamesC,eta1.Curcumin—InducedApoptosisin SclerodermaLungFibroblasts:RoleofProteinKinaseCe.AmJ RespirCelIMolBiol,2004,31:28—35. [9]高蔚,张德平,华云峰.姜黄素对大鼠肺成纤维细胞增殖和凋 亡的影响.实用医学杂志,2008,24(14):2393-2396. [10]PalS,ChoudhuriT,ChattopadhyayS,eta1.Mechanismsofcur- cumin-inducedapoptosisofEhrlich’sascitescarcinomacells.Bio— chemBiophysResCommun,2001,288:658-665 [11]SurhYJ,ChunKS,ChaHH,eta1.Molecularmechanismsunder- lyingchemopreventiveactivitiesofanti--inflammatoryphytochemi-? cals:down—regulationofCOX-2andiNOSthroughsuppressionof NF—kappaBactivatiorhMutatRes,2001,480-481(1/2): 243-268.