科研设计书--日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究

科研设计书--日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究 登记序号 项目编号 科研设计书 项目名称: 日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究 承担单位: 单位地址: 邮政编码: 开 户 行: 帐 号: 1103021109000077488 项目负责人: 电 话: 职务职称: 填报日期 2004年7月28日 江苏省地方病协会 二??四年制 一、 立项依据: 血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体(ZW)，雄性为同配子体(ZZ)。尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉眼区别，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。 传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便收集虫卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。然而，单性雌性尾蚴不能发育到完全成熟的成虫，给鉴别带来一定困难。同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育成熟至少需3周。 采用分子生物学的方法，可快速鉴定尾蚴的性别。代表性差异分析(RDA)方法是基于递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基因组间差异性片段。由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体(ZZ)，而雌性为异性配子体(ZW)。RDA方法从宏观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z，从而获得W染色体。Drew A.C.等(1995)采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用Southern blot 方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组DNA特异性杂交。W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列W1设计出一对引物W1a和W1b。直接加入该引物对单个尾蚴作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。结果雌性尾蚴呈现扩增产物PCR-W1条带，雄性尾蚴不呈现扩增条带。此方法能快速、可靠地用来鉴定曼氏血吸虫尾蚴的性别。基于曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定的现有方法，为探索适合日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法提供了理论和方法依据。利用代表性差异分析(RDA)方法，分离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性序列制备成DNA探针，用Southern blot 方法鉴定日本血吸虫尾蚴性别。也可对此特异性序列进行测序，设计一对引物，对单个尾蚴的DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾蚴呈现扩增条带，雄性则不呈现扩增条带，从而用PCR方法可快速鉴定日本血吸虫单个尾蚴的性别。 研究日本血吸虫尾蚴的性别鉴定技术，建立日本血吸虫尾蚴快速鉴定应用技术有助于血吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研究;对血吸虫病疫苗评价方法的标准化、遗传学的研究;及其流行病学、感染诊断和病理学研究结果的正确评价;不同性别尾蚴的易感性和感染比率以及减虫率(减雌率)和减卵率的正确评估等均具有重要的意义。同时为进一步开发适 合我国国情的日本血吸虫尾蚴性别鉴定试剂盒打下基础。 二、 主要研究内容、关键技术、目标: 1、 研究内容 1.1 用代表性差异分析方法获得日本血吸虫雌性基因组DNA特异性序列。 1.2 对特异性序列测序，设计引物，PCR扩增。 1.3 实验室内建立一种简单、快速的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。 2、 关键技术 2.1 日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取 2.2 代表性差异分析方法(RDA)和PCR。 2.3 低熔点凝胶回收雌性特异性片段 2.4 大肠杆菌E.coli TG1感受态细胞的制备技术、DNA的重组和克隆筛选、重组DNA的转化及质粒DNA的提取。 2.5 DNA探针的制备和 Southern blot 验证方法 2.6 雌性特异性序列测序和引物设计。 3、 目标 建立一种简单、快速、灵敏的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。 三、 研究方法及技术路线 1. 用传统方法确定尾蚴的性别，获取单性尾蚴样本 1.1 以逸蚴法筛选出阴性钉螺用于感染，所有用于实验的螺均筛选3次。1.2 以单只毛蚴感染单只钉螺;螺感染后在光照培养箱中养殖90天或在春夏季室温条件下养殖100天。逸蚴法筛选出阳性钉螺，取单性尾蚴感染小鼠，35天后剖杀，取成虫确定尾蚴的性别。并分别收集单性尾蚴分别编号保存于-70?液氮备用。 2. 用代表性差异分析方法分离日本血吸虫雌性特异性序列 2.1 感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾蚴。45天后剖杀家兔，收集成虫，在解剖镜 下将成虫雌雄分开，分别保存于-70?液氮中备用。 2.2 取雌虫、雄虫各200条用基因组DNA提取试剂盒分别提取雌虫和雄虫的基因组DNA。 2.3 用限制性内切酶Hind?对雌虫、雄虫DNA进行酶切。将酶切产物与两条适配子(R Hind24,5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’和R Hind12,5’-AGCTTGCGGTGA-3’)组成的接头用T4连接酶进行连接。 2.4 以连接物为摸板，做PCR扩增;并琼脂糖凝胶电泳看连接情况。 2.5 扩增子的纯化 对雌虫、雄虫DNA的PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化，限制性内切酶Hind?酶切。将酶切后的PCR产物过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头R Hind24和R Hind12。如此制备的雌虫DNA为检测子，雄虫DNA为驱动子。 2.6 扣除杂交法及PCR 2.6.1 取以上的检测子1ug连接新的适配子接头(J Hind24 5’-ACCgACgTCgACTATCCATgAACA-3’和J Hind12 5’-AgCTTgTTCATg-3’);然后取0.5ug带有新接头的检测子与40ug的驱动子溶于4ul的3×EE缓冲液中，加入1ul的5M的NaCL， 琼脂糖凝胶电泳 扣除杂交，67?、20小时;并做PCR和。 2.6.2 将RDA的第一轮产物酶切后，过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头J PCR Hind24和J Hind12，连接下一个新的接头(适配子N Hind24 )，取检测子0.1ug5’-AggCAgCTgTggTATCgAgggAgA-3’和N Hind12 5’-AgCTTCTCCCTC-3’ 与40ug驱动子进行第二轮RDA，PCR和琼脂糖凝胶电泳。 2.6.3 同上，酶切后过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头N Hind24和N Hind12，再连接适配子接头J Hind24和J Hind12，取400pg检测子与40ug驱动子进行第三轮扣除杂交，PCR和琼脂糖凝胶电泳。 2.7 将获得的特异性DNA片段进行低熔点琼脂糖凝胶回收，PCR纯化试剂盒纯化。 2.8.1 制备大肠杆菌E.coli TG1感受态细胞:本实验以E.coli TG1菌株为受体细胞，用氯化钙处理是受体菌处于感受状态。 2.8.2 DNA的重组和克隆筛选:将获得特异性DNA片段连接到载体质粒pUC19制得重组质粒;经α-互补现象筛选(蓝白斑筛选)方法对重组质粒进行筛选。 2.8.3 重组DNA的转化:用电击转化的方法，设定电击仪参数(电脉冲25uF、电压2.5KV、电阻200Ω);吸取一定量的感受态细胞和重组质粒pUC19，加入预冷的电击杯，放入样品池，按以上设定参数启动对细胞的电脉冲，仪器会显示4-5ms具有12.5KV/cm的电场强度，脉冲结束后，将细胞取出加入到1mlSOC培养液中复苏1h，接种于特制平板上，37?培养。 2.8.4 挑选培养出的单个白色菌落，接种于液体培养;用质粒DNA提取试剂盒提取质 粒DNA。 2.9 Southern-blot 方法验证:利用DIG DNA Labeling and DNA探针和Southern-blot验证。Detection Kit制备 3. 将经Southern-blot方法验证出的雌虫特异性序列进行测序，并设计引物。 4. 根据设计好的引物，对提取的成虫基因组DNA和已知性别的尾蚴DNA作PCR，琼脂糖凝胶电泳来进行证实。 5. 根据设计好的引物，采用直接法(不提取DNA)对单个尾蚴作PCR，琼脂糖凝胶电泳，来确定此尾蚴的性别。 6(日本血吸虫尾蚴性别鉴定PCR法操作条件优化研究。 四、 现有工作条件和基础: 1 工作基础 本实验室是江苏省寄生虫分子生物学重点实验室，寄生虫学为江苏省135重点学科，拥有清洁级小鼠动物房，从事寄生虫免疫学和分子生物学研究二十余年，在仪器设备上完全具备进行寄生虫免疫学和分子生物学研究以及动物试验的的条件。 有一定的专业技术和专业人员队伍，人员配置合理。 2 仪器设备 主要包括温控设备:4?、-20?、-70?冰箱、THZ-95型恒温振荡器、SCS-24型摇床、光照培养箱、恒温水浴箱、微波炉等;净水设备:MilliQ水纯化设备;消毒设备:高压蒸气灭菌锅;计量设备:各种精密度天平、量筒、移液管及各种规格的可调试微量移液器、PH计、紫外分光光度计等;离心设备:各种不同规格的普通、高速冷冻离心机;蛋白核酸分析设备:DY-A琼脂糖凝胶电泳仪、多功能蛋白电泳仪(Bio-Rad)、核苷酸序列分析仪(Bio-Rad)、核酸蛋白测定仪(BECKMAN)、快速蛋白液相层析系(Pharmacia)等;其它分子生物学仪器:PCR仪、超声仪、电穿孔转基因仪、干胶仪、酶标仪、凝胶扫描仪、影像密度扫描仪等。 五、 MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1713543288831_0进度: 总期限一年: 1-3月 采购钉螺，并筛选阴性钉螺。 2-4月 购阳性钉螺并感染家兔，剖杀家兔收集成虫和虫卵。 4-5月 单只毛蚴感染单只钉螺. 4-5月 订购试剂 5-11月 分离雌虫特异性序列，并测序和设计引物，进行尾蚴性别鉴定。 11-12月 收集、分析资料和书写总结 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 六、 项目研究预期成果及效益 采用分子生物学技术，准确、有效的建立一种快速、日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法， 发表相应的论文。 并为进一步开发响应的鉴定试剂盒打下基础;和 七、 经费预算 万元试剂 万元 试验动物 万元 试验耗材费 交通、差旅费用 万元 管理费 万元 总计 万元 八、 主要研究人员 单位 姓名 性别 年龄 专业 职务(称)项目中的作用 九、单位意见、盖章 年 月 日 十、主管部门意见、盖章 年 月 日 课题类别 卫生厅编号 湖南省医药卫生科学技术研究课题计划(合同) 课题名称:脑脊液中β-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值及临床意义 的研究 湖南省卫生厅 一九九三年十月制 简 表 脑脊液中β-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值 研名称 究及临床意义的研究 (25字内) 课 题 类别 A.重点 B.一般 C.青年基金 起2002年10月 申请金额 2万元 起止年月 止 2003年9月 姓名 性别 男 出生年月 1966年7月 申 请专业技术职务 主治医师 学位 博士 者 所在部门 工名称 作 所在地 单 位 性质 A.高等院校 B.医疗卫生单位 C.科研单位 D.其它 辅助参加单位课总人数 高级 中级 初级 博士 硕士 学士 人员 数 题 5 2 2 1 2 2 1 1 组 年参专业技术项目中课姓名 年龄 加月工作单位 签章 职务 的分工 题数 组 负责 35 主治医师 全程 主 副主任医要 44 全程 协作 师 成 40 主任医师 全程 负责 员 ? 31 主管技师 全程 协作 含 负 28 医师 全程 协作 责 人 ? --------------1------------ 研 究脑脊液中β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, 内β-AP，Aβ)是淀粉样前体蛋白(APP)在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液容 中Aβ有Aβ和Aβ两种形式;两者在正常老年人和和4042 Alzheimer病(AD)脑脊液中均存在，Aβ与AD老年意42斑形成密切相关。 义 Tau蛋白是脑细胞内的一种功能蛋白，有形成细胞摘 骨架、组装和稳定微管的作用。正常脑细胞内Tau蛋白要 磷酸化位点很少，因而不易被磷酸化，脑脊液中Tau? 蛋白的含量较少。AD患者脑细胞内Tau蛋白磷酸化位200 点增多，Tau蛋白呈异常磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的字 含量增多。 内 本研究拟采用放射免疫法检测不同年龄段人群(包? 括痴呆和非痴呆)脑脊液β、Aβ和Tau蛋白含量，4042 通过大样本的分析，界定其参考正常值范围，为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。 脑脊液中β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, β-AP，Aβ)是淀粉样前体蛋白(APP)在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中Aβ有Aβ和Aβ两种形式;两者在正常老年人和4042 Alzheimer病(AD)脑脊液中均存在，Aβ与AD老年42斑形成密切相关。 脑脊液中β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, β-AP，Aβ)是淀粉样前体蛋白(APP)在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中Aβ有Aβ和Aβ两种形式;两者在正常老年人和4042 Alzheimer病(AD)脑脊液中均存在，Aβ与AD老年42斑形成密切相关。 --------------2------------- 一( 本研究的立项依据和目标 ,(本课题研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在问题，列出主要参考文献 随着社会人口逐步进入老龄化阶段，Alzheimer病(AD)已成为人类的第四大死因。AD的研究具有重要的经济意义和社会意义。目前AD的诊断主要靠临床表现、神经心理学测试和影像学检查，缺乏客观的实验室诊断依据。AD的基本病理变化是老年斑和神经元纤维缠结，前者的主要成分是β淀粉样蛋白(Aβ)，后者的主要成分是Tau蛋白。AD患者脑 [1-4]脊液中Aβ水平是增高还是降低，各家报道不一致。其原因主要与没有分别测定Aβ、Aβ和总Aβ有关;且因均4042 采用ELASA法，测出的结果受主客观影响较大，致使Aβ测定的应用价值降低。AD患者脑脊液Tau蛋白水平是增高的， [5-6]国内外报道是一致的。由此推断:脑脊液Tau蛋白和Aβ联合测定可能会提高实验室诊断AD的应用价值。虽然，国外 [7]新近有脑脊液Tau蛋白和Aβ正常值的报道 ，但目前尚无国人脑脊液Tau蛋白和Aβ的参考正常值。界定国人的脑脊液Tau蛋白和Aβ的参考正常值可为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。 参考文献 1( 丁新生，程虹，张雪玲，等。脑脊液中β淀粉样蛋白检 测对老年期痴呆的诊断意义。临床神经病学杂志，2001， 1:3-5。 2( 吴恺，胡刚，国泓，等。Alzheimer病患者脑脊液β淀 粉样蛋白的检测。中华老年医学杂志，1999，1:13-15。 3( 王磊，袁锦楣，郝洪军，等。Alzheimer病血清和脑脊 液β-淀粉样蛋白的测定。中国神经精神疾病杂志， 1999，2:102-103。 4( Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et al.Longitudinal study of cerebraospinal fluid levels of tau, Aβ,Aβ in 1-401-42(43) Alzheimer’s disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:17-26. 5( 王琨，丁新生，程虹。阿尔茨海默病患者脑脊液Tau、 Aβ、Aβ蛋白测及其临床意义。徐州医学院学1-401-42(43) 报，2000，2:109-112。 6( Shoji M,Matsubara E,Kanai M,et al.Combination assay of CSF tau , Aβ and Aβas a biochemical marker of 1-401-42 Alzheimer’s disease.J Neurol Sci ,1998,2:134-140. 7( Sjogren M,et al .Tau and Abeta42 in cerebrospinal fluid from healthy adults 21-93 years of age:establishment of reference values .Clin Chem 2001;47(10):1776-81. --------------3------------- 2(研究内容、研究目标和拟解决的关键问题 研究内容、研究目标: 本研究拟通过对不同年龄段非AD和AD病人脑脊液中 Aβ、Aβ和Tau蛋白的检测，确定脑脊液中Aβ、Aβ40424042和Tau蛋白的参考正常值。为AD的诊断提供实验室依据。 拟解决的问题: 理论上说，只有痴呆患者(包括AD性和非AD性)的脑脊液Aβ和Tau蛋白异常，正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病患者脑脊液中Aβ、Aβ和Tau蛋白4042含量是一致的。但为证实这一理论，先将非痴呆组分为正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病三个亚组的脑脊液分别检测，如这一理论得到证实，则将这三个亚组的脑脊液Aβ和Tau蛋白的含量视为正常人的含量来分析，以增加样本量，克服真正的正常人脑脊液来源不足的弊端。 --------------4------------- 3(本课题的特色和创新之处及立论根据(与国内外类似研究比较) 脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下腔内的一种无色透明液体，脑细胞的代谢产物可释放到脑脊液中，脑脊液中成分的变化一定程度反应了脑细胞的活动情况。脑脊液取材操作简单，放射免疫法检测受主观干扰因素少，结果可靠。 目前，国内外关于脑脊液Aβ和Tau蛋白检测的报道主要是对已确诊为痴呆的研究，对非痴呆患者脑脊液Tau蛋白和Aβ的检测的报道甚少。本课题拟通过对非痴呆患者的不同人群脑脊液Aβ和Tau蛋白含量的研究，界定其参考正常值，为确诊AD提供实验室依据。 4(研究工作的预期结果或成果 预期通过对不同年龄段的非痴呆人群脑脊液Tau蛋白和 Aβ的检测，界定其人群的参考正常值。 --------------5------------- 5(本课题的情报查新情况及结论 ? 检索关键词(,―,个): ? 检索年限(前3年以上): ? 检索刊物名称(至少有,种系国外刊物): ? 检索手段(光盘、手工、其它): ? 检索结论: ? 检索机构及检索人盖章 --------------6------------- 二、研究方法和路线 ,、 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证 方法、步骤、技术路线: 1) 脑脊液的收集:包括所有行腰穿(神经内科 和非神经内科住院患者)时的脑脊液，除外 有明显出血的脑脊液，经离心沉淀后分管于 -20?冰箱中保存待测。根据痴呆的临床诊断 标准分为痴呆组和非痴呆组，然后再分亚组。 详见表。 ——AD 痴呆组------- ——非AD ——正常人 非痴呆组----——非神经系统疾病 ——非痴呆神经系统疾病 2) 选用相应的试剂合，用放射免疫法测定。 3) 实验数据的分析、处理。 4) 书写论文。 可行性、可靠性论证: 1) 腰穿留取脑脊液化验检查是神经内科诊断疾病 常用的方法，因而收集足够的脑脊液是可行的。 2) 本院核医学科有一流技术的医技人员和成套设 备，能够完成该科题的实验检测。 3) 试剂合可在国内外生物技术公司购买。 --------------7------------- 2、研究工作的总体安排及进度: (1)2002年10月----2003年3月 规范实验程序，收 集标本。 (2)2003年4月---2003年6月 购买试剂，实验阶 段。 (3)2003年7月---2003年9月 实验数据处理，结 果分析，撰写论文。 --------------8------------- 三、实现本课题预期目标已具备的条件 1(与本课题有关的研究工作基础 本研究负责人在读硕士研究生期间(1997.9—2000.7)曾参加国家“九五”攻关课题——Alzheimer病的流行病学调查，与该课题密切相关。 2(实现本项研究已有的主要仪器设备，尚缺的仪器设备及解决途径 本院核医学科有成套的仪器设备，已开展放射免疫检测多年，不缺任何仪器设备，只需购买相应的试剂合。 3(课题负责人及主要成员的学历和研究工作简历，已取得的主要科研成就 4(不需动物实验 --------------9------------- 四、申请课题经费预算 预算支出科目 金额(万元) 计算根据及理由 2 合计 0.5 1、科研业务费 调研费 万元;业务 交流费 万元; 培训 焊锡培训资料ppt免费下载焊接培训教程 ppt 下载特设培训下载班长管理培训下载培训时间表下载 费 万元。 2、实验材料费 1(0 编程软件材料费 万元;资料、书籍购 买费 万元 3、小型土建安装费 4、协作费 0.5 直接主管部门开户 银行及帐号: 主要研究单位开户 银行及帐号 --------------11------------- 五、合作单位意见 (一)同意申请书的内容并做到: 1、保证参加合作研究的人员、物力和时间: 2、督促课题参加者按计划完成所承担的研究工作，并按时报送有关报表 (二)需要说明的其它问题: 合作单位1 合作单位2 合作单位3 合作单位4 (公章) (公章) (公章) (公章) --------------12------------- 六、申请单位学术委员会审查意见(对本课题的意义特色和创新之处，研究方法的先进性、可行性及研究者素质水平等签署意见) 本研究课题紧密联系临床，研究人群脑脊液的Aβ和Tau蛋白的参考正常值，为AD的诊断提供客观的实验室依据。课研思路清晰，研究方法先进，论证可行，在国内属首创。 主任或副主任委员(签字) 年 月 日 七、申报单位领导审核意见 (一)同意学术委员会的意见并做到以下几点: 1、保证研究计划实施所需的人力，物力和工作时间等条件; 2、督促课题负责人严格执行计划进度安排 3、督促课题负责人按时报送有关报表资料 (二)需要说明的其它问题 单位领导(签章) 单位(公章) 年 月 日 --------------13------------- 八、推荐意见(申请青年基金课题需填写此栏由两名同行高级科技人员填写，推荐意见要说明课题的意义和取得预期成果的可能性，申请者和课题组的学术水平及研究能力，现有工作条件等) 推荐人(签字) 专业技术职务 专长 单位 推荐人(签字) 专业技术职务 专长 单位 --------------14------------- 主管部门审核意见 委托单位组织同行评议或情报咨询意见: 卫生厅审批意见: --------------15-------------- 合 同 条 款 1(本研究课题为期 年。从 年 月起，到 年 月止。实验、临床、现场等研究工作结束后二至三个月内， 乙 方应向 方提出科研总结或申请成果 的完总资料。 2本课题确定为 偿拨款。由甲方资助经费总额 元，分 次拔完，完成全部合同任务。其中按 协议 离婚协议模板下载合伙人协议 下载渠道分销协议免费下载敬业协议下载授课协议下载 应偿还的 元，于 年内 分次还清。 3(所 签定的此项合同课题，乙方不得另向其它部门或单位申报计划。如向省科委、卫生部等上一级主管部门申报时，应通过甲方协同办理。 4(合同执行过程中，如因不可抗拒的客观原因，确需调整合同期限和内容时，乙方必须及时提出书面报告，报请甲方审批备案，方能生效。 5(合同执行过程中，乙方应于每半年向甲方汇报一次进展情况，整个合同完成时，及时向甲方申请验收。申请任何一项科研成果奖励时，有关文件、资料应注明为 方合同课题。 6(乙方对科研资料负有保密责任。其研究成果未经专家鉴定或未经 方同意，不得对外提供成公开发表具有保密价值的关键资料、数据(包括某些诀窍、方法)。 7(乙方拟将成果转让成开发时需征得甲方同意，凡有经济效益者，需提纯利润的百分之三十为 方扩大科研基金费。 8(凡未被甲方认可的理由，不如期按要求完成合同任务者，进行文字通报。如 乙方仍未采取新的有效措施保证完成，或要求终止合同时，甲方将采取措施追回部分或全部科研以费，并在二至三年内不受理课题负责人的科研任务。 签定合同各方签字 委托单位(甲方) 负责人 年 月 日 委托单位(乙方): 单位负责人: 课题负责人 年 月 日 保证单位(丙方):(系指各附属医院及地市所属单位的主管部门) 负责人 年 月 日 --------------16----------- 合同执行过程中有关事项记载 时 间 内容摘要 --------------17-----------