转染pcdna3

转染pcdna3 转染pcDNA3             作者:马俊芬～黄幼田～赵明耀～杨洪艳～ 郑智敏～董子明 【关键词】  癌胚抗原     Inhibition of MGC803 growth in nude mice by human dendritic cells transfected with pcDNA3hCEA 【Abstract】 AIM: To investigate the inhibition of dendritic cells (DCs) (pcDNA3hCEA) inoculation on MGC803 in nude mice. METHODS:  DCs were generated from human fresh peripheral blood in the presence of rhGMCSF and rhIL4 and DC vaccine was prepared by transfection with pcDNA3hCEA using lipofectine. CEA mRNA expressing in DCs (pcDNA3hCEA ) was confirmed by RTPCR and specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) was induced in vitro. The inhibition of the DC (pcDNA3hCEA) inoculating on MGC803 in nude mice was observed. RESULTS:  CEA mRNA of DCs (pcDNA3hCEA ) could be detected at 588 bp with a pair of specific primers by RTPCR and the specific CTL (%) at effecttarget rate 10〕 1, 20〕1, 40〕1 were respectively 19.4〒3.8, 24.7〒 3.7, 38.1〒5.4. DCs (pcDNA3hCEA) effectively inhibited the growth of MGC803. The median of tumor genesis time in the experiment group was longer than that of control (10 d vs 6 d, n=5) and the growth speed of tumor inoculating on DCs (pcDNA3hCEA) in nude mice was slower than that in control group. The size of tumor inoculating on DCs (pcDNA3hCEA) in nude mice was less than that in control group ,(0.24〒0.10) cm3 vs (1.36 〒0.42) cm3, n=5, P<0.05,. CONCLUSION:  The human dendritic cells transfected with pcDNA3hCEA can inhibit MGC803 cells in nude mice. 【Keywords】 dendritic cell; carcinoembryonic antigen;  plasimd; transfection 【摘要】 目的:探讨转染癌胚抗原基因pcDNA3hCEA 的人树突状细胞(DC)对胃癌细胞MGC803裸鼠移植瘤生长的 影响. 方法:采用细胞因子rhIL4和rhGMCSF诱导培养法制 备人外周血DC～并用Lipofectine向人DC转染pcDNA3hCEA. RTPCR检测转染人CEA真核表达质粒的表达. 使用DC(pcDNA3hCEA)疫苗体外诱导人T淋巴细胞靶向性杀伤反应～并在体内实验中观察DC(pcDNA3hCEA)对MGC803在裸鼠上致瘤性的影响. 结果:针对特定引物DC(pcDNA3hCEA)在588 bp处有CEA片段的表达,DC(pcDNA3hCEA)能够诱导的人T淋巴细胞靶向性杀伤活性,%,～在效靶比分别为10〕1～20〕1～40〕1时的结果为19.4〒3.8, 24.7〒3.7, 38.1〒5.4,DC(pcDNA3hCEA)能显著抑制MGC803的生长～其肿瘤生成日期较对照组延长,中位数10 d vs 6 d, n=5,～瘤体生长速度较对照组缓慢～d 23瘤体体积明显小于对照组,(0.24〒0.10) cm3 vs (0.65〒0.17) cm3, (1.36〒0.42) cm3, n=5, P<0.05,. 结论:转染pcDNA3hCEA的人DC能有效抑制MGC803在裸鼠体内的生长. 【关键词】 树突状细胞,癌胚抗原,脂质体,转染 0引言 抗原基因修饰的树突状细胞,dendritic cell, DC,克服了对肿瘤抗原量的限制～可以在体外通过PCR方法得到大量纯的肿瘤抗原基因～并在DC内通过内源性持续表达TAA～由MHCI类途径得到充分提呈～更有效地控制和增强免疫效 果. 癌胚抗原,carcinoembryonic antigen, CEA,不能有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应～是CEA阳性肿瘤细胞免疫逃逸的原因之一,1,. 我们向人DC转染含人CEA真核表达质粒～使DC特异性的表达和提呈CEA～观察该疫苗对CEA表达阳性的MGC803在裸鼠体内的抑制作用. 1材料和方法 1.1材料 人重组白细胞介素4(rhIL4),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)购自美国R.D Systems公司;RPMI 1640为美国Gibco产品;Lipofectine为Amine Reagent产品;Taq酶、AMV为Promega产品;上下游引物由上海生工合成;pcDNA3hCEA由本室构建室构建. 人胃低分化黏液性腺癌MGC803 由郑州大学医学院组胚教研室惠赠.  雌性BALB/c裸鼠15只～4~5 wk龄, 购自复旦大学实验动物中心. 在恒温、恒湿的半屏障系统中饲养. 抽取健康成人新鲜外周全血30 mL～0.5 mL肝素抗凝～采用常规密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞,peripheral blood monon 1uclear cell, PBMC,,2,. 用含rhGMCSF 1〓106 U/L～rhIL4 5〓105 U/L及100 mL/L人血清RPMI 1640培养液～ 37?～50 mL/L CO2培养箱培养～每3 d换液～于d 9收集DC. 取同一健康成人新鲜外周全血～按前述方法操作获得PBMC～常规培养2 h后～小心吸出非贴壁细胞～用RPMI 1640培养液悬浮后～轻轻注入T细胞尼龙毛柱～37?水浴1 h, 冲洗出非贴壁细胞～即为同种自体T细胞. 1.2方法 取对数生长状态的DC～加入DMEM培养液. 将纯化的pcDNA3hCEA质粒1 μg溶解于250 μL的DMEM中～同时将Lipofectamine 5 μL溶解于250 μL DMEM中. 温和混合二溶液～25?孵育30 min后～在37?～50 mL/L CO2培养箱中孵育4 h～换含有血清的RPMI 1640培养液,3,4,. 分别提取转染和未转染DC的RNA. 逆转录获得cDNA～25 μL的反应体系中～RNA 10 μL～随机引物1 μL～RNA酶抑制剂1 μL, 5〓buffer 5 μL～dNTP mix 1 μL, DEPC处理水6 μL, AMV 1 μL, 80? 5 min, 38? 1 h, 85? 10 min.  PCR扩增目的基因及电泳鉴定:50 μL反应体系中～上下游引物各2 μL, 5〓buffer 5 μL, dNTPmix 1 μL, cDNA 2 μL, Taq酶1 μL,  DEPC处理水37 μL,  94? 2 min, 93? 45 s,  56? 70 s～72? 5 min, 30个循环～PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.1T淋巴细胞杀伤活性反应(cytotoxicity Tlymphocyte, CTL)将转染后72 h的DC,pcDNA3hCEA,分别与T淋巴细胞按数量比为1〕10的比例混合培养4 h, 做为致敏T淋巴细胞. 致敏的T淋巴细胞为效应细胞～胃癌细胞MGC803为靶细胞进行混合培养12 h～按以下分组:DC,pcDNA3hCEA,+T淋巴细胞+MGC803,DC+T淋巴细胞+MGC803,组内设定不同的效靶比观察孔～分别为10〕1, 20〕1, 40〕1～每种效靶比设3个复孔～并且重复3次. 每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL, 混匀～继续培养4 h～每孔再加入二甲基亚砜100 μL,用酶联免疫反应仪测570 nm A值. 同时以相同效靶比的未致敏T淋巴细胞+MGC803为效应对照孔～以相同数量级的MGC803为靶细胞对照孔, 计算:T细胞杀伤活性=,靶细胞对照A值-,实验组A值-效应对照A值,,〔靶细胞对照A值〓100% 1.2.2动物实验T淋巴细胞为效应细胞, 按效靶比20〕1加入MGC803～培养24 h. BALB/c裸鼠随机分3组: ?DC,pcDNA3hCEA,+T淋巴细胞+MGC803; ?DC+T淋巴细胞+MGC803; ? MGC803～每组5只～在无菌的条件下按1〓106个MGC803将细胞接种于裸鼠右侧前肢皮下～每3 d用游标卡尺测量、记录肿瘤的大小～按椭圆体积公式计算肿瘤体积 =,4π/3,〓,长径/2,〓,短径/2,〓,长径+短径,/4～并绘制生长曲线. 统计学处理: 采用SPSS 10.0版软件包进行统计学处理. 数据用x〒s表示,采用t检验～α=0.05作为差别有显著性的检验水准. 2结果 2.1RTPCR 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 DC(pcDNAhCEA)的表达将pcDNA3CEA转染人的DC,RTPCR检测到在588 bp处有一特异性的扩增带(Fig 1). 2.2DC(pcDNA3hCEA)诱导人T淋巴细胞的杀伤活性见Fig 2. 2.3裸鼠致瘤性接种的3组均有肿瘤结节出现～但出现的时间和生长速度存在明显差异. DC,pcDNA3hCEA,+T淋巴细胞+MGC803组较DC+T淋巴细胞+MGC803组和MGC803组生长缓慢(瘤体生成时间中位数:10 d～ 8 d～ 6 d; d 23瘤体体积(cm〓cm〓cm):0.24〒0.10, 0.65〒0.17, 1.36〒0.42)～致瘤性降低,P<0.05, Fig 3). 3讨论 CEA是一种大分子糖蛋白～通过糖基化磷脂酰肌醇与细胞膜结合～CEA在胃癌、结肠癌、胰腺癌等多种人类恶性肿瘤高表达,5,. CEA对人体来说是一种弱抗原～不能有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应～不能阻止CEA相关肿瘤的发生. 但是～Smita通过将CEA阳性肿瘤的mRNA导入DC～成功地诱导了抗CEA的CTL～说明CEA可作为靶点而被机体的免疫系统攻击,6,. 我们通过将pcDNA3hCEA转染人的DC使其内源性递呈激活T淋巴细胞,并观察其对在体瘤体的作用. ,,是抗原提呈能力最强的抗原提呈细胞～高表达MHCI、MHCII类分子和多种共刺激分子如,7,, B72及CD40等. 基因修饰DC的研究为抗肿瘤免疫提供了内源性抗原提呈新的策略,7～8,. DC加工处理内源性抗原后～通过MHCI分子递呈内源性抗原肽激活CD8+T淋巴细胞～形成特异细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞直接发挥特异性的杀伤作用. 我们将pcDNA3hCEA转染人的DC后, 通过RTPCR检测到在588 bp处有一特异性的扩增带～说明DC(pcDNA3hCEA) 具有内源性表达CEA抗原的特点. DC(pcDNA3hCEA)体外诱导 和激活的CTL与非转染组相比～具有更强特异性的杀伤带有 同种抗原的肿瘤细胞的作用～说明转染组所引起的内源性抗 原递呈较非转染组所引起的外源性递呈具有较强的靶向性. 在裸鼠动物实验中DC(pcDNA3hCEA)诱导和致敏的T淋巴细胞 对肿瘤的生长较未转染组有明显的抑制作用～其结果与体外 实验结果相一致～表明DC(pcDNA3hCEA)内源性抗原递呈和诱 导致敏T淋巴细胞的功能稳定～可以提高,,对,,,阳性 肿瘤免疫效应～具有进一步在临床实施研究和应用的潜力和 价值～为人群CEA阳性肿瘤的防治提供了新的思路和方法. 【参考文献】 ,1, Brown RD, Pope B, Nuray A, et al. Dendritic cells from patients with meloma are vnumerically normal but functionally defective as they fail to upregulate CD80((B71) expression by transforming growth factorbatal andd interleukin10 ,J,. Blood, 2001; 98(10): 2992-2298. ,2, Aradavin C, I artinez del Hoyo G,Iartin P, et al. Origin and differentiation of dendritic cells ,J,. Trends Immunol, 2001; 22(2): 691-700. ,3, Albert ML, Stauter B, Bhardwaij N. Dndritic cells acquire antigen from apototic cells and inducee class I restrited CTLs,J,. 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