浅论腺病毒穿梭质粒pshuttle cmv- vegf121-ires-hrgfp-1的构建和鉴定

浅论腺病毒穿梭质粒pshuttle cmv- vegf121-ires-hrgfp-1的构建和鉴定 浅论腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的构 建和鉴定 浅论腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- +VEGF121-IRES-hrGFP-1的构建 和鉴定 【摘要】 目的 构建腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-+VEGF1-IRES-hrGFP-1，为构建 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达具有抗原表位标记的血管内 皮生长因子1(vascular endothelial growth factor 1,VEGF1)，并 同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告分子 的腺病毒真核细胞表达载体打下基础。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对目的基因供体质粒 pTG19T-VEGF1携带的VEGF1基因测序和序列内部存在的限制性内切 酶识别位点进行分析，利用PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR) 技术对pTG19T-VEGF1携带的VEGF1基因突变，以去除翻译终止密码 子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。 将突变后的VEGF1基因(+VEGF1)定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1，通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果 重 组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论 成功构建了pShuttle CMV- +VEGF1-IRES-hrGFP-1。 【关键词】 腺病毒穿梭载体;血管内 皮生长因子1 Abstract: Objective To clone vascular endothelial growth factor 1 (VEGF1) gene into the adenovirus shuttle plasmid pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1, preparing for construction of a novel recombinant adenovirus vector expressing the VEGF1 fused to FLAG epitope and humanized Renilla reniformis green fluorescent protein 1(hrGFP-1) as a reporter on the same transcript. Methods The VEGF1 gene contained in the plasimid of pTG19T-VEGF1 was sequenced, and the profile of restriction endonuclease sits existing in the sequence was analysed. Then the translation stop codon TAG was removed. Meanwhile, NotI and Xho I restriction sites were added before the start codon and after the 3 end of the mutant through polymeras chain reaction (PCR) mutagenesis technology. The mutant of VEGF1 gene(+VEGF1 gene) was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP一1by the directional cloning method. To identify the correct recombinants the analysis of sequencing and electrophoresis was adopted. Results The electrophoresis and sequencing map of the recombinant accorded with theoretic analyses of pShuttle CMV-+ VEGF1-IRES-hrGFP-1. Conclusions The adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV- VEGF1-IRES-hrGFP-1 has been constructed successfully. Key words:adenovirus shuttle plasmid; vascular endothelial growth factor 1(VEGF1) 在骨组织的胚 胎发生或骨损伤愈合的过程中，缺乏良好的血供将导致骨生长异常和 骨愈合不良。临床植骨修复缺损时，要求植骨床具有丰富的血供，而 自体骨移植时，也常通过带血管蒂或带肌瓣增强血供，促进移植骨早 期成活。因此，一个较为完善的血管网对于骨形成是非常必要的，它 不仅能提供营养和氧气，还能输送成骨前体细胞，分泌成骨细胞所需 的生长因子[1]。在众多已发现的诱血管生成的因子中，血管内皮细 胞生长因子(VEGF)被公认为是作用最强，特异性最高的一种，这个细 胞因子本身也和骨形成有着直接密切的关系[3-5]，在各类成骨的活 动中起着积极的作用。血管内皮细胞生长因子在体内通过选择性剪切 mRNA编码序列可产生六种不同的异构体，其中其中以VEGF165和 VEGF1的作用最为显着，但由于VEGF165以一半可溶性，一半不可溶 性蛋白在机体内表达，可分泌到细胞外，但一部分与细胞膜或细胞间 质结合，而VEGF1则全部为可溶性，不结合于肝素的弱酸性蛋白质， 完全分泌到胞外并游离于细胞间质，可以更好的发挥旁分泌的作用， 促进血管生成。本实验利用hrGFP-1为报告基因，构建含VEGF1和 hrGFP-1基因的穿梭载体，为进一步研究VEGF1在体内的表达和促血 管生成及成骨的活动打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株 pTG19T-VEGF1质粒购自上海东方肝胆外科研究所; 腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1购自Stra-tagene公 司;pMD19-T和大肠杆菌感受态DH5α购自TaKaRa公司。 1.1.2 主 要试剂、试剂盒 各种限制性内切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、 高保真DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 质粒小量提取试 剂盒、dNTP、DL15000等购自TaKaRa公司。 1.2 方法 1.2.1 VEGF1基因的突变及携带突变后VEGF1基因(记作 +VEGF1)的pMD19-T质粒的亚克隆:?以pTG19T-VEGF1为模板利用PCR技术突变VEGF1 基因以去除VEGF1基因中终止密码子TAG序列，之后在基因序列前后 分别加入NotI和XhoI酶切位点:引物序列 F:5′-GCGGCCGCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′ R:5′-CTCGAGCCGCCTCGGCTTGTCACATT-3′ 以pTG19T-VEGF1为模 板，进行PCR反应，反应条件:98 ?，10 s,30 cycles;55 ?,5 s,3030 cycles;72 ?,30 s,30 cycles;72 ?,5 min,1 cycles，琼脂糖凝胶 电泳鉴定。?PCR产物加“A”和纯化:切胶回收PCR产物，然后进 行加“A”反应，然后使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0进行精制。?连接,转化,筛选阳性克隆:使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0中的Solution I将PCR产物与pMD19-T质粒 连接。转化感受态细胞，涂平板，37 ?过夜培养。?提取质粒及测 序。