【doc】我国蝗虫微孢子虫超微结构与致病特性研究
我国蝗虫微孢子虫超微结构与致病特性研
究
草地
ACTAAGRESTIASINCA
1994正
1994
.
苎乏
我国蝗虫微孢子虫超微结构与致病特性研究
王丽英曹春
(北京覆叵j保94)
摘要:从我国末亚飞蝗上分离出微孢子虫病原物圆形裂殖体(Meront).除单棱,双核和
四核外,还在本菌株观察到六核,八核等多棱裂殖体超微结构生活史观察,裂殖体细胞质膜很
薄,与寄主细胞紧密相接,其细胞内含许多棱糖体,囊泡和大量光滑内质网,双核,四核裂殖体.
均呈双核相伴排列,以及正进行细胞质分裂的裂殖体和产孢体(Sporont);产孢体细胞壁加厚
明显区别于裂殖体.整个生活史均为双核相伴排列产孢体
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
面有多层电子致密物质呈短线条
沉积.成熟孢子极膜层为指纹状片层结构,龊丝圈18~20个该病原物主要感染脂肪体和唾
腺,并能弓【起寄主死亡,其死亡率有随接种剂量的增高而增大的趋势.而且3龄比4龄更敏感.
接种后群体饲养比单头饲养死亡率高.病虫比健虫生育期延长2,3天,产卵能力
下降,接种后
24天病虫食物消耗比健虫减少35~75.
1前盲
微孢子虫(Microsporidia)是细胞内专性寄生物.成熟孢予以有极丝结构而区别于其 它原生动物.近半数种类寄生于昆虫并能削弱寄主引起慢性病常常具有经卵传播的特性,
在昆虫种群中引起流行病.对调节害虫种群起重要作用.有些种类能快速杀死寄主(Mad—
dox,1988).成为潜在微生物杀虫剂的候选者,引起国内外学者关注 微孢子虫在寄主体内发育循环因病原物种类而异.因此用作微孢子虫重要的分类
标准
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,
早期研究均以光镜描述为依据,70年代以来采用电镜技术观察其超微结构生活史,为种的
分类标准提供了更精细结构资料(Larsson,1988).昆虫微孢子虫的生活史描述在国内有些
报道(问锦曾等,1990),但多停留于光镜观察或仅观察成熟孢子的超微结构. 蝗虫微孢予虫国外已报道5种(Wangetal,1991),蝗虫微孢子虫(Nosemalocustae)已 经注册商品化(Henry,1971)Henry等,1981Henry,1986),其生活史早期描述比较简单.尚
未区分产孢体和孢子母细胞(Canning.1953)Huger.1960~Canmng,1962).国内'985年引
入该种进行应用研究(王丽英等,1990).1986年首次从内蒙亚洲小车蝗和白边痴蝗上分离
到微孢予虫(王丽英等,1987),其后又在新疆,河北等草地多种蝗虫上分离到微孢子虫,为防
治草原蝗虫提供更多的病原物.本文报道从东亚飞蝗上分离的微孢予虫研究结果. 2
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
和方法
2.1病原与试虫从河北,天津附近草地上采集的东亚飞蝗(Locustamigrattoria
manilensis),取其脂肪体涂片,于显微镜下检查孢子,留下有孢子的虫体加少量无菌
水研磨
过滤,离心,取粗提液,保存于4?或一20?冰箱中.
'国家自熊科学基金资助项目
^
期
第
畚N
22
,
一
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第1期王丽英等:我国蝗虫微孢子虫超微结构与致病特性研究?15? 试虫:在河南,河北当地采集蝗卵,室内保存于4?冰箱,使用时将卵块移至30?养虫箱
内,待孵出蝗蝻后饲喂麦苗,麦麸,昼夜光照,饲养到所需虫龄.
2.2接种与饲养取上述粗提液稀释成试验所需浓度,用微量吸液器滴在10mm.的小麦
叶片上,晾干,挑选试验中所需龄期的蝗蝻,单头饲喂一片叶片,将接种叶片全部食尽的蝗
嫡取出,作为试虫,然后喂其新鲜饲料.试验中单头接种后单头饲养的蝗蝻置于直径6.5cm,
长15cm塑料管内;单头接种后群体饲养的蝗蝻置于直径9cm,长50cm塑料管内,或直径
25cm,高30cm铁纱笼内.养虫室保持恒温30"C,昼夜光照,RH70,以麦叶,玉米叶加麦
敷为饲料.
2.3组织病理观察接种后于7,1o,25,30天后分别取感病蝗虫的脂肪体,唾腺,中肠,马
氏管,卵巢和精巢组织,在解剖镜下去除附在组织上的脂肪体,用生理盐水反复清洗干净,然
后取不同的组织少许涂片,甲醇固定,Giemsa染色,光学显微镜下检查. 2.4超微结构观察取接种1o,15,3o天后的感病蝗蝻解剖,分别取脂肪体,唾腺,卵巢和
精巢组织,切成】mm小块,2.5戊二,】锇酸双固定,丙酮系列脱水,Epon812包埋, LKB超薄切片机切片,柠檬酸铅醋酸铀染色,z—M一100CX电镜观察. 2.5致病特征观察
2.5.1对蝗虫死亡率的影响选取健康的3,4龄蝗蝻,单头接种,接种量分别为1×10孢
子/头,1×10孢子/头,1×10孢子/头,以不接种同龄期蝗蝻为对照,接种后分单头饲养(1
头/管)和群体饲养(20头/笼),重复3次,接种后饲养条件同前,每天观察
记录
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死亡虫数.
2.5.2对蝗虫生殖力的影响选取3,4,5龄蝗蝻,以浓度为1.6×10孢子/ml和1.6× 10孢子/ml的孢子液接种,每处理5o头,群体饲养到成虫期,然后将雌雄蝗虫配对,置同一
养虫笼中使其交配产卵,检查产卵块数,测量卵粒长度(30粒)和】00粒卵的卵粒的重量,以
不接种蝗虫为对照.
2.5.3对蝗虫生长发育的影响选取3龄健康蝗蝻以浓度为1×10孢子/ml和1×01孢
子/m[的孢子液接种,以不接种的健康蝗蝻为对照,单头饲养,记录从5龄发育到成虫期经
历的天数以及接种后不同天数发育到成虫期的百分率.
2.5.4对蝗虫食物消耗的影响选取4,5龄蝻接种1×10孢子/头,群体饲养,于接种后 第14天和24天分别取雌雄蝗虫各10头,测定24小时的取食量.以麦叶为饲料,取食前麦
叶与食后余下麦叶,于7O.C下烘48小时后称干重.
3结果与分析
3.1微抱子虫在蝗虫体内的发育循环
3.1.1光学显微镜取接种后7,20天感病蝗虫的脂肪体涂片,Giemsa染色,在光学显微
镜下观察,可见处于裂殖体生殖时期的大量裂殖体,其细胞质染色为淡兰色,细胞核为深紫
红色,除具有直径为1.91的单核和直径为3.5m的双核裂殖体外(图1),还有大量的 四核裂殖体,直径为4.3m,核的排列方式不同:有的呈十字形,有的呈一条线形,还有的成
对移向细胞的两边(图2—4),图3可见裂殖体正在进行细胞质分裂,细胞核变大,核物质变
得疏松,染色变浅,最后形成两个子细胞(图4);具有三核且三个核呈三角形排列的三核裂
殖体也时常可见(图5);另外还观察到五核和六核裂殖体(图6,7),六核呈两两成对分布的
六核裂殖体,六个核可以在细胞中部也可移到细胞边缘(图7),大小为6.9×7.9m}图8
草地
为八核裂殖体,大小为8.4×9.6/zm.产孢体为长椭圆形或两头较尖(图9,10),大小在1.9
×7.4/zm范围内,细胞质染色较淡,除具二核外,还有四核产孢体,后期发育形成孢子母细
胞,孢子母细胞形状近似于成熟孢子,为长椭圆形,其长度为6.4/zm(图11);图12为成熟
孢子,其大小为1.6×4.7/zm,孢子母细胞和成熟孢子均为双核相伴排列. 3.1.2电子显微镜在电镜下观察感病寄生脂肪体超薄切片,可见脂肪体组织中含有大量
近圆形的裂殖体,单核或多为双核紧密排裂聚集成堆(图13),大小为4.6×5.2m;图12
为放大的双核裂殖体,可见其双核相伴紧密排列,由于相邻细胞核的核膜并列,可见双核交
界处呈现出四条核膜带(箭头),细胞核中部常常出现电子致密区域,其直径为0.53/zm,这是
核仁,核膜周围的核膜孔也清晰可见(箭头).裂殖体细胞质膜很薄.于寄主细胞质紧密相接,
裂殖体细胞质含有大量核糖体和光精内质网以及许多囊泡.在裂殖体细胞外表面的寄主细
胞内也有很多囊泡,中空与裂殖体细胞膜紧密相接(箭头).这可能与裂殖体的发育有关.四
核裂殖体为长椭圆形,大小为3.5×6.2/zm(图15—16).四核两两相伴紧密排列,细胞核一
端出现中心板(cP),从中心板放射出微管(mt),中心板呈凹井形状,中部为电子致密层,但
未见分层,图15表示正在进行细胞质分裂的裂殖体,从中心板发射出微管(mt),由此可见
裂殖体是以二分裂方式进行裂殖生殖;产孢体的细胞壁加厚,明显区别于裂殖体(图17),大
小为3.4×4.3m,4.1×5.9p.m,双核或四核,细胞质内含有许多核糖体和内质网及囊
泡,图17表示正在进行细胞质分裂形成两个双核子代的产孢体.在产孢体发育后期,细胞质
内膜物质减少,在细胞表面常出现电子致密的具有膜结构的短线沉积,这些短线可能与成熟
孢子的形成有关(图17,19).孢子母细胞(图18),具有双核,也能见到似蜂窝状的高尔基体
(Gb),成熟孢子(图19)大小1.6X4.7/zm,孢子外壁很薄,三层单位膜构成,内壁很厚.为外
第1期王丽英等:我国蝗虫微孢子虫趣微结构与致病特性研究'17'
图片说明
l,l2光学显微镜图片(1ightmicroscopy)660X12双棱,四核裂殖俸
(Binucleate,quadriucleatemeront)
34四核裂殖俸进行细胞质分裂,产生二个子代双棱裂殖俸
(Bivisionofquadrniucleatemerontintoblnucleatedaughternleront~)
58.多棱裂殖俸(Multinucleatemerortt)9l0四檀产孢子(Q~uaddnucleatesporonts) 11双核孢子母细胞(Binucleatesporoblasts)l2成熟孢子(Giemsa—stainedspores) 13—2O电子显嫩镜超檄结构图片(Transmissionelectronmicroscopy)符号ICP,中心
板(Centrlolarplaque)een,孢子内壁
(endosporeu-oatlayer)|ex,孢子外壁(exosporeco自tlayer)emt.散管(microtubule);n,核
(nucleus);np,棱孔(nucle—
arpo~e);AD,锚状板(anchoring如k)|P】,极膜层(polaroplast)?Pt,极管(polartube)|ser,光滑内质网(smoothe力一
doplasmicretieulam);Gb,高尔基俸(Golgibody)
13裂殖俸:示双核相伴捧列(Merontwkhdiplokarya)6.400 ?取棱裂殖俸菔太:景核膜棱孔,中心板盈囊泡(箭
头)(Highermagnificationofdiplokaryot~~erontshownuclear?
洲s,centrloarplaqueandvesicuhrStrUcture(arrows)20.o0o×
15四棱裂殖俸分裂成二个子代双棱裂殖俸
(AmerDntunder—goingcytoklneslstoformtwodipiokaryoticdaughtercells)12,500×
16四棱裂殖俸1示中心板,馓管
(Quadrinucleate(twodlplokarya)rnerontwitheentrlniarplaqueandmicrotubules)l6,000
×
l7进行细胞质分裂的产孢俸(Adividingsporont)(arrow)l0,500×
18孢子母细胞l示双棱,高尔基俸(Abinucleatesporoblastwithgolgiosome)l5,000×
19成熟孢子示双棱,孢子内壁,孢子外壁极管18—2o个
(AmRtur~blnueleatespowith18—20polartubes)Z4,O00X
20成熟孢子放大;示极臂五层结构,呈指纹状极膜层,锚状盘,极孔
(Highermagni~cationofrftRtnresporewithpolaro-
plastllkefingerprint)99,000×
?
18?草地
壁厚度的8倍,双核,极丝圈18--20个.图2O为放大的孢子超微结构,极丝圈为五层,极膜
层为指纹片层结构,顶部为锚状盘,接着是极丝孔(Pa).
3.2微袍子虫感染蝗虫的组织病理
经口摄入孢子虫孢子后,在中肠消化液作用下,释放出极丝,侵入肠壁细胞穿透细胞壁
进入体腔,感染敏感组织并开始裂殖生殖.接种后第7天观察即有裂殖体产生,1O,15天可
见到大量裂殖体,并伴随着有成熟孢子,2O,30天则产生大量成熟孢子.感病初期,病原发
育尚处于裂殖生殖初期,寄主外表症状不明显,不易与健虫区别,当裂殖体大量产生期间,寄
主体色开始变化,逐渐由灰绿色变成深褐色甚至于虫体发红(体内产生虫红素所致)}特别是
蜕皮期间常出现畸形,或因蜕皮不正常死亡,接种后期孢子大量形成,寄主脂肪体耗尽,体内
全部充满孢子,寄主便大量死亡.
经光镜和电镜观察,该微孢子虫主要感染脂肪体和唾腺.但从卵巢和精巢组织中也观察
到裂殖体,其大小比脂肪体内的裂殖体稍小,因此也有可能感染生殖系统,只是发病较轻,这
尚须进一步研究但不感染马氏管,气管组织.
3.3微抱子虫对蝗虫的致病作用
3.3.1影响蝗虫的死亡率蝗虫微孢子虫由于感染寄主的脂肪体而使寄主死亡,死亡率与
病原物的接种剂量和寄主的龄期有关.
同一虫龄接种不同病原物,病原物剂量增大,死亡率有升高趋势i同样的接种剂量,3龄
比4龄更敏感,接种后单独饲养和群体饲养的两个处理组中,死亡率也显着不同(表1)这
是由于在群体饲养中,蝗虫个体间有自相残杀的现象,感染微孢子虫后,这种自残机会增大.
3.3.2影响蝗虫的生长发育4龄蝗蝻接种微孢子虫后19天,从5龄发育到成虫仅44,
77,而对照全部进入成虫期(表2),对照发育到成虫期经历的天数部分在5,8天完成,平
均6,7天;而处理组则要拖较长时间,最短的也要7天,最长的则需要11天,平均为9.25
天(表3).
3.3.3降低蝗虫的生殖力3,4龄蝗螭接种微孢子虫后死亡率较高,很少发育到成虫;5龄
蝗蝻接种后大多可发育到成虫,交配后也可以产卵,但其产卵量明显低于对照,其卵粒长度
衰1N.1ocu~tae感染寄主后对其死亡宰的影响
TableIEllectonmortalityofhostinfectedwithN.1oc~stae
第1期王丽英等:我国蝗虫微孢子虫超微结构与致病特性研究?19? 和百粒卵粒重也均低于对照(如表4)..
3.3.4减少食物消耗由表5可见,接种微孢子虫的蝗蝻,第14天取食量比对照低,接种
24天后,取食量减少35,70'并且雌虫的取食量比雄虫的减少更明显,4龄比5龄明显
4讨论
表2N./oeacstae感染寄主后对其生长发育的影响
Table2EffectondevelopmentofhostinfectedwithN.~ocust,fce
表3N.1oc~tae感染寄主后对其发育期的影响
Table3EEectondaysofdevelopmentofhostin~ectedwithN.1ocustae
c
.带:c.:Nymphs一训.山
?20?草地1994年
4.1从我国东亚飞蝗上分离的微孢子虫,经光镜,电镜两个水平上观察病原物在寄主体内
发育循环的形态特征和超微结构表明,该种微孢子虫无孢子芽膜,整个生活史中均具有双核
紧密相伴排列的发育阶段,裂殖体不呈链状,裂殖体和孢子的形态,大小以及寄主侵染部位
等的观察结果均与Canning描述的Nosemalocustae相似.六核?核等多核裂殖体是前人
没有观察到的,为本菌株特有,在产孢体细胞表面沉积的多层电子致密物质,很可能最后形
成孢子外壁,这一超微结构特征是蝗虫微孢子虫种特有的(Street等未发表),在该菌株中也
观察到了
4.2该种病原物主要感染脂肪体,也感染唾腺.卵巢,精巢组织涂片染色后见到裂殖体和少
量孢子,可能也有感染,只是感染程度较轻微.卵巢传播前人仅有推测,没有实验证据.
4.3'该种微孢子虫属脂肪体感染类型,其致病特性不同于中肠,马氏管等腺体感染类型.病
原繁殖速度快,大量消耗寄主营养,能加快寄主死亡速度,引起较高的死亡率,增强蝗虫群体
中个体间的自相残杀能力,成为第二性死亡因子.感染虫体生长发育受阻,生殖力和食物消
耗明显降低,从而间接地减轻蝗害,减少损失.考虑到减轻环境污染,保证环境质量,
在选择
替代或部分替代化学农药的生物防治措施时,把微孢子虫用于管理粗放,且能忍受
低数量虫
Izl密度的草原上,防治草原蝗虫是值得探讨的.
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LondonandNewYork'
ULTRASTRUCTUREANDPATH0GENICITYOFA
MICROSpORIDIANFROMLOCUSTINCHINA
WangLiyingCaoChun
(Departmentofplantprotection,BeijingAgriculturalUniversitytBeijing,100094) AbstractTheult~astructureanddevelopmentBmlcrosporid'怡
n,i~Ntedfromthedeadbodyofori—
entalmigratorylocust(Locustamigratoriamanitensis)inHebeiprovincewasobservedunderlight—and
electron—microscope.ThemerontwBssphericalorovocylindricalcontaininguni…
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一,guadrinucleatesmerontswereatrangmertttwonucleiinadiplokary? on.Sporonrsweredifferentiatedfrommeronrswiththethickenedplasma]emmaandobservedundergoJag
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malemmasurface.
Studiesofpathogenicityshowedthatthemortalityincreasedasthedosage血ed'thethird—
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moresusceptiblethanthatofthefourthithemortalityoflocuatsreardtogetherwa8higherthanreardsep?
arately;thedeveloraenttimeofinfectedlocustaweredelayed2,
3days'thenumberofeggsinfectedlo—
CUStSdecreasedlrhefoodconsumptionoftheinfectedWas35~75lessthancontrolledafter24days'inoc—
ulatinn.
Keywortls}Nosemalocustae}Locust;Ultrastructure