波形蛋白在 PRRSV 感染 MARC-145 细胞作

波形蛋白在 PRRSV 感染 MARC-145 细胞作 中国科技 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 在线 波形蛋白在 PRRSV 感染 Marc-145 细胞作 用的初步研究 王伟伟1，张璐1，马晓春1，高继明1，肖一红1，周恩民2 5 ,1. 山东农业大学动物科技学院～泰安～271018, 2. 西北农林科技大学～杨凌～712100, 摘要:为了研究波形蛋白与 PRRSV 感染的关系～根据 GenBank 中已发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的波形蛋白序列～ 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 特异性引物～利用 RT-PCR 方法从 Marc-145 细胞中扩增目的基因～克隆入 pET-28a～ 转化表达菌 BL21(DE3)中进行诱导表达～用 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定表达产物～将表 达产物纯化后免疫 BALB/c 小鼠制备血清～用病毒阻断实验验证 PRRSV 与波形蛋白及其抗 10 体的关系。用 ELISA 方法研究了重组波形蛋白与 PRRSV 结构蛋白 N 蛋白和囊膜蛋白 GP5 蛋白之间的关系。结果表明～成功的从 Marc-145 细胞中扩增出全长的波形蛋白基因～将其 克隆入 pET-28a～诱导后得到高效表达～表达蛋白纯化后免疫小鼠抗体效价达到 105～病毒 阻断实验表明表达波形蛋白能部分阻断 PRRSV 感染～其抗血清能完全阻断 PRRSV 感染。 ELISA 结果表明波形蛋白能与 N 蛋白结合而不与 GP5 蛋白结合。此结果为 PRRSV 感染的 15 细胞的受体机制增添了新的内容～为 PRRSV 感染过程中受体间的相互作用关系研究奠定基 础。 关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒,波形蛋白,表达,病毒阻断,N 蛋白 中图分类号:S582 20 Cloning The role of vimentin during infection of PRRSV on Marc-145 cell WANG Weiei1, ZHANG Lu1, MA Xiaochun1, GAO Jiming1, XIAO Yihong1, ZHOU Enmin2 25 (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai'an, 271018; 2. Veterinary Immunobiology Research Institute of Northwest A & F University, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, 712100) Abstract: The objective of this study was to investigate the function of vimentin in PRRSV infection. Vimentin gene from Marc-145 cells was amplified by RT-PCR, cloned into pET-28a 30 vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed vimentin was confirmed by Western blot and purified which was used to immunze BALB/c mice for the production of antibodies. Vimentin and antibodies were tested for blocking PRRSV infection of Marc-145 cells. The binding of vimentin to PRRSV N and GP5 proteins were tested by the ELISA. The results showed that vimentin gene were amplified successfully and expressed as identified by SDS-PAGE 35 and Western blot. Mouse anti-vimentin antibodies were produced with the titer of 105. PRRSV infection of Marc-145 cells was blocked partially by vimentin while blocked completely by the antibobies. In addition, vimentin bound N protein, but not GP5. These results provide additional information on PRRSV entry into Marc-145 cells. Key words: PRRSV; vimentin; expression; virus blocking; N protein 40 基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(20093702120004);国家自然基金项目(U0931003，30901063， 30871857) 作者简介:王伟伟(1981-)，男，硕士研究生，主要研究方向:PRRSV 受体 通信联系人:肖一红(1976-)，女，副教授，主要研究方向:PRRSV 致病机制. E-mail: xiaoyihong01@163.com -1- 中国科技论文在线 0 引言 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)感染所致的一种急性传染病[1]，已成为危害世界养猪业的首要传染病。我国 45 [2]，自 2006 年以来出现了一种由高致病性 PRRSV 引起的高致病性 PRRS， 于 1996 年首次报道 以发病率和死亡率高、传播迅速为特征，在半年内几乎传遍了大半个中国[3-4]。PRRSV 的基 因组含有 9 个相互重叠的开放读码框，编码 7 个结构蛋白[5]。GP5 是 PRRSV 的主要结构蛋 白，位于病毒囊膜上，含有 4 个糖基化位点，不仅可在体内诱导产生病毒中和抗体，而且在 PRRSV 感染细胞的过程中起着重要的作用[5]。N 蛋白是 PRRSV 基因组中保守性蛋白，其免 疫原性最强，约占病毒粒子的 20%~40%，是形成病毒核衣壳的基础，N 蛋白含有 26%的碱 50 性氨基酸，碱性极强这利于其与病毒基因组 RNA 相互作用[6-7]。 波形蛋白作为细胞骨架中中间纤维的主要构成成分之一，对于细胞基本结构和生理活动 起着重要的作用。波形蛋白具有组织特异性，不同类型细胞含有不同的波形蛋白，广泛存在 于间充质细胞及中胚层来源的细胞中，能将细胞核和细胞器维持在特定的空间。研究表明作 为细胞基本生活构成元件之一的波形蛋白在疱疹病毒-1[8]、免疫缺陷病毒-1[9]等多种病毒感 55 染过程中起着重要作用，并且在不同的病毒感染过程中所起的作用不同。为了进一步研究波 形蛋白与 PRRSV 感染的关系，本实验从 Marc-145 细胞扩增出波形 蛋白基因，表达纯化后制备抗体，检测波形蛋白及其抗体对 PRRSV 感染对 Marc-145 细胞影响，为 PRRSV 感染过程中受体机制提供理论依据。 1 材料与方法 60 主要材料 1.1 Marc-145 细胞购自武汉细胞中心库， PRRSV 分离株 TA-12( GenBank 登录号: HQ416720)由本实验室分离并保存。大肠杆菌 DH5，、BL21(DE3)及 pET-28a 由本实验 室制备并保存。pMD18-T 载体购自 TaKaRa。N 蛋白及抗 N 蛋白单克隆抗体、GP5 蛋白及 65 其抗血清由本实验室保存，PRRSV 阳性血清(效价:1:100)由本实验室保存。 主要试剂 1.2 One Step RT-PCR (AMV)试剂盒，T4 连接酶，限制性内切酶 EcoR?和 Hind?购自 TaKaRa;DNA 胶回收试剂盒、DNA marker 、Protein marker 为北京全式金公司产品;弗氏 完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP 标记的山羊抗鼠 IgG 和 FITC 标记的山羊抗鼠 IgG 购自 70 Sigma 公司产品;抗 His 单克隆抗体购于金斯瑞生物科技公司;增强型 HRP-DAB 显色液为 北京天根生物技术公司产品。其余试剂均为进口或国产分析纯级试剂。 引物设计与合成 1.3 根 据 GenBank 上 发 表 的 波 形 蛋 白 的 基 因 序 列 设 计 并 合 成 引 物 Fv1: 5'-CAGCCATGACCACCAGG-3' ， Rv1: 5'-AAGGTCAAGACGTGCCAG-3' ; Fv2 : 75 5'-AAACCATGGCCGCAG TGTTGGTTCGATCC-3' ( 含 EcoR? 酶 切 位 点 ) 及 Rv2: 5'-AAAAAGCTTCTGCGTG GCGAGGATGCTGAC-3'引物合成由上海生工生物有限公司完 成。 -2- 中国科技论文在线 方法 1.4 波形蛋白基因克隆与鉴定 1.4.1 提取 Marc-145 细胞总 RNA 采用 RT-PCR 技术，以表 Fv、Rv 为引物扩增波形蛋白基因。 80 按 One Step RT-PCR (AMV)试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 配置反应缓冲液。反应在 50µL 总体积中进行，以 1µg 总 RNA 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，加入 5 U 的 AMV RNase XL 和 AMV-Optimized Taq。反应条件:反转 录 50?30 min，94?预变性 2 min，94?变性 30 s，58?退火 30 s，72?延伸 2 min,共 35 个 循环，72?10 min。RT-PCR 产物经 l%琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段后克隆入 pMD18-T 中，进行 PCR 和序列测定鉴定，阳性重组质粒命名为 pMD18-T-Vim。 85 表达载体的构建与鉴定 1.4.2 根据测序结果设计引物,分别以 Fv2 及 Rv2 为引物，以 pMD18-T-Vim 为模板进行扩增 目的片段，PCR 产物经 l%琼脂糖凝胶电泳分离，用 EcoR?和 HindIII 酶切回收目的片段后 与用相同酶消化的 pET-28a(+)载体连接，用 PCR、酶切和测序对重组质粒进行鉴定，阳性 90 重组质粒命名为 pET-28a-Vim。 波形蛋白的表达、鉴定及纯化 1.4.3 将 pET-28a-Vim 转化入 E.coli BL21(DE3)中，挑取阳性重组菌的单菌落，37 ?振摇 培养至对数生长期(OD600=0.6)，分别加入终浓度为 0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L 的 IPTG， 分别于诱导后 2h、4h、6h 收集菌体，通过 12%聚丙烯酰胺凝胶进行 SDS-PAGE 分析。 95 SDS-PAGE 分离后将分离条带转至 PVDF 膜上进行 Western blot 分析，以 1?2000 稀释的 抗 His 标签单抗作为一抗，以 1?2000 稀释的 HRP 标记羊抗鼠 IgG 作为二抗，以增强型 DAB 作为底物进行免疫检测。表达的蛋白经 Ni-resin 纯化。 抗波形蛋白抗体的制备 1.4.4 选取 5 只 6~8 周龄健康的雌性 Balb /c 小鼠进行首免，按照 50μg /只的剂量，对小鼠进 100 行腹腔注射免疫;2 周后进行第 2 次免疫;再间隔 2 周后进行第 3 次免疫，方法、剂量同第 1 次免疫。首免之前和每次免疫后第 14d 对小鼠进行断尾取血备用。 抗波形蛋白抗体的检测 1.4.5 将 4ug/mL 的波形蛋白 100µL 包被于 ELISA 孔板中，将保存的小鼠血清做梯度倍比稀 释，用 ELISA 方法检测抗体滴度。同时进行 IFA 检测，将抗重组波形蛋白按 1:20，1:40， 105 180，1:160 稀释的血清加入到单层固定好的 Marc-145 细胞上，每孔加入 100ul，37?作用 1h。每孔再加入 50ul 1:200 稀释的 FITC 标记羊抗鼠的 IgG.，避光干燥后镜检，用未免小鼠 血清做为阴性对照。 抗波形蛋白的病毒阻断 IFA 检测 1.4.6 分别将透析后含有 2M 尿素的 5,g、10,g、50,g 波形蛋白分别与 600/300 TCID50 的 PRRSV 后，接种到长成单纯的 Marc-145 细胞上，37?感作 1h 后加入含有 3%新 110 TA-12 37?孵育 1h 生牛血清的 DMEM，37?，5%CO2培养箱中培养，培养 24h 时用冷的丙酮固定，加入抗 PRRSV 的阳性猪血清，再加入 FITC 标记的羊抗猪二抗，荧光显微镜下观察统计病毒个数，以含有 2M 尿素的 PBS 作为对照。 抗波形蛋白抗体的病毒阻断检测 1.4.7 将抗波形蛋白抗体按 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160 稀释后分别加到 2 块长成单层 115 -3- 中国科技论文在线 的 Marc-145 细胞上，37?孵育 1h，弃上清，加入 300 TCID50 的 PRRSV TA-12，感作 1h 后 37?，5%CO2 培养箱中培养，24h 时拿出一块细胞培养 加入含有 3%新生牛血清的 DMEM， 板用冷的丙酮固定，加入抗 PRRSV 的阳性猪血清，再加入 FITC 标记的羊抗猪二抗，荧光 显微镜下观察。另一块培养 7 天，每天观察 CPE，用未免小鼠血清做为阴性对照。 ELISA 检测重组波形蛋白与 N 和 GP5 关系 120 1.4.8 将重组波形蛋白稀释成 8µg/mL，4µg/mL，2µg/mL，分别加入到 96 孔 ELISA 板中，每 孔中加入 100µL/孔，4?孵育过夜后每孔加入含有 2.5%的脱脂奶粉封闭液，再分别加入 100µL 的重组表 N 蛋白，GP5 蛋白，其浓度为为 100ug/mL，50ug/mL，25ug/mL，12.5ug/mL， 0ug/mL，37?孵育 1h，分别加入抗 N 蛋白的单抗和抗 GP-5 蛋白的阳性血清，加入 HRP 标 125 记的羊抗鼠二抗 IgG，加入 TMB 显色液室温反应 15min，每孔加入 50µL 3M H2SO4 终止液， 酶标仪 A450 读值。 2 结果 波形蛋白的克隆与序列分析 2.1 以提取的 Marc-145 细胞 RNA 为模板，通过一步法 RT-PCR 方法扩增得到在 1401bp 附 130 近的片段(图 1)，与预期大小相符。 1. DNA Marker; 2. products of RT-PCR 图 1 波形蛋白基因的 RT-PCR 产物 Fig. 1 Products of RT-PCR 重组质粒 pET-28a-Vim 鉴定 2.2 重组质粒 pET-28a-Vim 经 PCR 和 EcoR?、Hind III 双酶切后，在 1401bp 左右处均有一 135 特异性条带(图 2)。经测序证实基因阅读框正确，无碱基突变。 1. DNA Marker; 2. pET-28a-Vim digested by EcoR?and Hind ? 图 2 重组表达质粒的双酶切鉴定 Fig.2recombinant expression plasmid with analysis of pET28-Vim digested by EcoR?and Hind III 波形蛋白的诱导表达及鉴定 2.3 将重组质粒 pET-28a-Vim 转化入 E.coli BL21(DE3)，在 37?，经 1.0mM/L 的 IPTG 诱导后，在 57kD 处出现一条特异性蛋白条带，与预测分子量一致(图 3)，经对表达条件 140 的优化发现，在 0.5mM/LIPTG，诱导时间为 4h 时表达量最高。Western blot 分析结果表明 在分子量约 57KD 处出现特异性反应条带(图 3)。挑取鉴定正确的单克隆菌，大量诱导后 -4- 中国科技论文在线 用 Ni-resin 纯化，纯化产物用Bradford测定浓度为 5mg/mL 1 Protein molecular weights marker; 2 SDA-PAGE of whole protein at 4 hours induction; 3 Western blotof whole protein at 4 hours induction 图 3 波形蛋白的表达及鉴定 Fig.3 Expression and identification of vimentin 抗波形蛋白抗体水平检测结果 2.4 用 ELISA 方法检测制备的抗波形蛋白抗体，3 次免疫后的小鼠血清抗体有明显的升高 145 趋势，其中三免后 15 天时，血清按照 1:105 稀释时，其 OD 值仍达到 0.645，其 P/N 值>2.1 (图 4)。 2.5 2 1.5 1 OD value 0.5 0 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 dilution 阴性对照 二免 三免 图 4 抗波形蛋白抗体检测结果 Fig.4 Detection result of mouse serum after immunization 150 抗波形蛋白抗体 IFA 结果 2.5 用制备的抗波形蛋白的小鼠血清，检测其是否能与 Marc-145 细胞，结果发现当抗重组 波形蛋白的血清抗体稀释到 1:160 时仍然能够与 Marc-145 细胞结合。而阴性血清不与 Marc-145 细胞结合(图 5)。 155 A、B、C、D:IFA results of anti-vimentin serum at dilution of 1:20, 1:40, 1:80 and 1:160, respectively; E、F、G、 H: IFA results of negtive serum at dilution of 1:20, 1:40, 1:80 and 1:160, respectively 160 图 5 抗波形蛋白抗体与 Marc-145 细胞结果 Fig. 5 IFA result of anti-vimentin serum and Marc-145 cells. -5- 中国科技论文在线 波形蛋白的病毒阻断 IFA 检测 2.6 将不同量的波形蛋白与 600 及 300 TCID50 的 PRRSV TA-12 孵育后接种的长成单层的 Marc-145 细胞上，经 IFA 检测结果，波形蛋白能明显降低 PRRSV 感染，波形蛋白的量越大 165 阻断效果越明显，但是不能完全阻断。结果见表 1。 表 1 波形蛋白阻断 PRRSV 感染结果 Table 1 Results of virus blocking of vimentin protein PRRSV Vim 50ug/well Vim 10ug/well 2M Urea 600 300 600 300 600 300 600 300 24 6 1 0 6 1 16 6 感染 PRRSV 31 5 2 1 5 1 18 4 细 胞 个 数 26 5 5 0 3 2 9 7 ( 4/6 次 重 18 4 1 1 3 3 17 9 复) 29 1 6 17 25 2 1 10 153 20 12 2 24 7 87 26 总数 25.5 5 2 0.5 4 1.75 14.5 6.5 平均数 抗波形蛋白抗体的病毒阻断 IFA 及 CPE 检测 2.7 用 100 个 TCID50 的 PRRSV TA-12 株进行病毒阻断实验，IFA 和 CPE 检测均发现抗重 170 组波形蛋白的阳性血清按照 1:10 和 1:20 稀释时未检测到荧光信号及 CPE，而血清稀释度在 1:40 到 1:160 时能检测到明显的荧光信号及 CPE。 ELISA 检测结果 2.8 重组表达的波形蛋白与 N 蛋白随着重组波形蛋白的包被量的减少 OD 值降低，随着 N 175 蛋白加入量的减少 OD 值降低，波形蛋白包被量为 0.4-0.8µg 时，N 蛋白 1.25-10µg 时其 P/N 值>2.1。重组波形蛋白与 GP5 蛋白无论在哪个浓度其 P/N 值均<1.5 (如图 6-7)。 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 OD value OD value 0.1 图 6 波形蛋白与 N 蛋白结合的 ELISA 检测结果 0 Fig. 6 ELISA results of vimentin and N protein 100µg 50µg 25µg 12.5µg 0µg N protein 8μg 4μg 2μg 0μg 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 图 7 波形蛋白与 GP5 蛋白结合的 ELISA 检测结果 0 100μg 50μg 25μg 12.5μg 0μg Fig. 7 ELISA results of vimentin and GP5 protein N protein 4μg 8μg 0μg 2μg 180 -6- 中国科技论文在线 3 讨论 尽管世界动物卫生组织(OIE)将PRRS为B类传染病，但是近年来该病给养猪业带来的 185 巨大经济损失已经远远超过了某些A类传染病()。尽管世界各 养猪大国对PRRS给予了足够的重视，不能有效控制PRRSV感染。因此需要对PRRSV的致病 机需进一步研究。 病毒-受体的相互作用是一个多步骤连续的复杂过程，可以连续地或根据细胞类型特异 性方式使用多个吸附受体，其中受体在细胞信息传递过程中起着重要的作用。病毒与细胞受 体结合是病毒建立感染的首要步骤，同样病毒-受体的相互作用决定着宿主范围，从而构成 190 病毒感染细胞的特异性。PRRSV通过其结构蛋白与其特异性的受体结合以细胞内吞的方式 [10]。目前已报道的与PRRSV有关的细胞受体主要有:硫酸乙酰肝素受体、唾液酸 感染细胞 粘附素受体(Sialoadhesin, SN)、清道夫受体蛋白、波形蛋白受体、CD151及细胞蛋白酶 [12-17] 。波形蛋白是2006年Kim等用North-Western blot方法检测到的[15]。波形蛋白是细胞内的 基本结构，对于维持细胞的正常结构及生理功能起着非常重要的作用。为了进一步研究受体 195 在PRRSV感染过程中的相互作用，本实验从Marc-145细胞中克隆并表达波形蛋白，表达的 蛋白以包涵体形式存在，易于纯化。将纯化蛋白后免疫小鼠，制备了高滴度的抗波形蛋白抗 体。用两种不同方法进行病毒阻断实验，一种是用透析的波形蛋白(主要是去除尿素)与 PRRSV孵育后接种到Marc-145细胞上，一种是用抗血清与Marc-145细胞先孵育在接种 PRRSV，结果证明PRRSV与波形蛋白孵育后接种细胞仍能感染细胞，但是感染效率明显降 200 低，这说明波形蛋白只是影响了PRRSV与Marc-145细胞的结合而不是完全的阻断，这也进 一步证明了PRRSV进入细胞是一个多途径涉及多个受体的过程。但是抗波形蛋白的抗体却 能完全的阻断PRRSV的感染，这说明PRRSV的感染过程是一个整体，其中的一个环节受到 破坏也会影响PRRSV的感染，同时也说明细胞结构及成分的完整性对于PRRSV的感染起着 关键性作用。抗SN及CD163的抗体也能完全阻断PRRSV的感染，更进一步的证明了这一点。 205 用ELISA方法证明波形蛋白能与N蛋白结合而不与GP5结合，这充分表明波形蛋白能与 PRRSV直接结合。 4 结论 本实验证明波形蛋白及其抗体能阻断 PRRSV 感染，同时波形蛋白与 N 蛋白结合，这为 研究 PRRSV 的感染细胞的受体致病机制增加新的内容，为 PRRSV 感染过程中受体之间的 210 相互作用奠定基础。 [参考文献] (References) [1] Hopper S A, White M E, Twiddy W. 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