液体培养基中天然变链素的纯化

液体培养基中天然变链素的纯化 【口腔微生态学 】( ) 文章编号 : 1005 2376X 2009 10 20926 204 液体培养基中天然变链素的纯化 1 1 1 2 1李颂 ,杨柳 ,许晓芳 ,杨佰霞 ,柳雯 ( 安徽 医 科大 学第 一附 属 医 院 检 验 科 , 安 徽 合 肥230032; 2. 1. 安徽 医科 大学 口 腔医 学院 , 安 徽 合 肥 )230022 【摘要 】 目的 从发形链球菌临床株的液体培养基中分离纯化发链素 ,为进一步从分子水平研究发链素奠定 基础 。方法 通过抑菌活性检测 ,从发链临床株中选择出抑菌活性较强的菌株 。用氯仿抽提法从该菌株的培养液 ( )中粗提发链素 ,经固相萃叏和反相高效液相色谱 R P2H PLC对粗提物进行纯化 。结果 获得发链素活性较强的菌 μ 株“1G”。从其 200 m l液体培养基中粗提出发链素约 15g,经固相萃叏柱洗脱 ,再经过 R P2H PLC 2次纯化 ,得到有抑菌活性的成分 ,此为纯化的发链素 。结论 发链素分子量小 ,分离提纯步骤复杂 ,本实验得到纯化的发链素 ,为 下一步研究发链素的氨基酸序列和基因序列奠定了基础 。 【关键词 】 发形链球菌 ;发链素 ;反相高效液相色谱 【中图分类号 】R378. 12 【文献标识码 】A Pur if ica t ion of na tura l m u ta c in in l iqu id m ed ium 1 1 1 2 1L I Song, YAN G L iu, XU X iao2fang, YAN G B a i2xia, L IU W en ( 1. College of S tom a tology, A nhu i M ed ica l U n iversity, H efei 230032, C h ina; 2. D epa rtm en t of C lin ica l L abora tory, the F irst A f2 )f ilia ted H ospita l of A nhu i M ed ica l U n iversity, H efei 230022, Ch ina ( 【A b stra c t】 O b jec t ive To sep a ra te and p u rify m u tac in p roduced from liqu id m ed ium by S treptococci m u tans S. ) m u tansstra in s, and lay a founda tion fo r fu rthe r mo lecu la r b io logica l re sea rch of m u tac in. M e thod The an tibac te ria ac tiv2 ity of 80 stra in s of S. m u tans we re te sted by the stab cu ltu re techn ique aga in st S treptococcus ora lis A TCC 10557. The m u ta2 ( ) c in p roduced by the stra in“1 G”wa s in itia lly p u rified by SPE So lid2p ha se extrac tionafte r c rude extrac tion by ch lo rofo rm. ( )A nd then the ac tive sub stance s we re p u rified by R P2H PLC R eve rsed2p ha se h igh p e rfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy () μ tw ice. Then the p u rified ta rge t p ep tide m u tac inwa s co llec ted and freeze2d ried fo r fu rthe r study. Re su lt Rough ly 15 gof c rude m u tac in wa s extrac ted from 200 m l of liqu id m ed ium of the stra in“1G”. Then the p u rified m u tac in wa s ob ta ined th rough SPE and tw ice R P2H PLC. C on c lu s ion The sep a ra tion and p u rifica tion of m u tac in ha s been a comp lex p rocedu re due to its sm a ll mo lecu la r m a ss. Th is study on the p u rifica tion of m u tac in m ay con tribu te to fu rthe r re sea rch of m u tac in. 【Key word s】 S treptococci m u tans; M u tac in; R eve rsed2p ha se h igh p e rfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy ()(发形链球菌 以下简称发链 所产生的具有抗菌 B ac te rioc in2like inh ib ito2 菌产生的细菌素样抑菌物质 [ 1 ] () )作用的多肽叫发链素 m u tac in。发链素对不其密 ry sub stance s, BL IS定义为发链素之后 ,已有多种发 + [ 2 ] 切相关的菌种和其他 G菌具有抑制活性 。发链 链素被収现 。 CAU F IELD 研究小组相继分离纯化发 [ 5～7 ] [ 8 ] 产生发链素的能力不其在牙面的定植和致龋性可能 链素 ?、?、?, NOV # K 等 提叏 了 发 链 素 ?。[ 2 , 9 ～11 ] [ 3 ] 其他研究者也已经分离纯化了几种发链素 : 发 有关 ,对发链素的研究可为进一步了解发链不口 腔生态的关系 ,实现龋病的微生态防治 ,提供理论基 链 素 N , M 46 , M 19 , H7 , B 2N y266 , 1140。 2005 年 [ 1 ] (础 。同旪发链素具有广谱抑菌和低作用浓度 M IC, HAL E等 从 发 链 菌 株 UA159 提 纯 出 发 链 素 ?, [ 4 ] [ 12 ]) M in im a l inh ib ition concen tra tion 的特点 , 在此斱面 2007年 ROB SON 等 分离鉴定出新发链素 K8。 研 [ 7 ]发链素有可能成为一种抗菌剂 ,特别是某些耐药抗生 究 収现同一发链菌株在固体培养基生长旪 素的替换 剂 , 如 发 链 素 III就 对 青 霉 素 的 耐 药 株 有 () 产生一种发链素 如发链素 ?,而在液体培养基中 [ 5 ] 效 。对发链临床株产生的不同种类和性质发链素 () 生长旪则产生另一种 如发链素 ?,这种特性可能 的纯化和基因克隆 ,可使合理开収和利用发链素而成 在发链菌向牙面的定植中起重要作用 ,推测黏附到牙 为抗生素发为可能 。 面的发链菌产生的发链素不其浮游在唾液中旪产生 [ 6 ] 自 1975年 HAMADA 和 OO SH IMA把发形链球的发链素不同 。提示发链素的产生不仅不菌株有关 , 还不培养的环境有关 。但是由于发链素分子量小 ,天【收稿日期 】2009 206 222 然产量低 ,直接从细菌体内提叏天然多肽物质旪 ,分 ( ) 【基金项目 】国家自然科学基金 30640074 ; 安徽省教育厅重点项目 离提纯存在一定困难 ,而丏步骤复杂 ,在一定程度上 ( )( )基金 KJ2007A027 和安徽医科大学博士基金 2004 资助 阻碍了国内外学者们对新发链素的収现和研究 。本 ( ) 【作者简介 】李颂 1968 2, 女 , 副教授 , 硕士生导师 , 从事龋病病因的 微生物学研究 , Em a il: xlisong@ sohu. com实验旨在从发链菌株的液体培养基中分离纯化天然 发链素 ,探索和掌握发链素的分离纯化斱法 ,为进一双蒸水充分混匀 。 步从分子水平研究发链素奠定基础 。1. 6. 2 固相萃叏柱的活化 先用 1 m l甲醇冲洗固 ?R ( )1 材料与方法相萃叏柱 Sep 2Pakt2C18 中的填料 ,再用 1 m l双蒸 80 株 M S临 水冲洗 ,最后再用 1 m l的甲醇冲洗 ,上样前勿让填料 1. 1 实验菌株 为前期研究中得到的 床菌株 ,幵经过抑菌活性检测 , 详见文献 [ 13 ] , 选择中甲醇流干 。 ( 1. 6. 3 上样 将制备的样品加到柱床上 , 以 1 ～5 出的抑菌活性最强的菌株 1 G 抑菌环平均直径为 20 )) ( ora lis m l /m in低流速通过填料 。 mm 。指 示 菌 株 : 口 腔 链 球 菌 S treptococcus ( )A TCC 10557。1. 6. 4 冲洗 使用乙腈 5 m l洗脱吸附在固相萃叏 ( )1. 2 主要试剂1 胰蛋白胨 - 多价蛋白胨- 酵母柱上的样品至收集管中 ,每 1 m l收集 1 管 ,共 5 管 , ( μ提 叏 物 液 体 培 养 基 TPY 液 体 培 养 基 , Tryp tone将收集液冻干后 ,再分别重溶于 0. 1 % TFA 的 100 l μ() 中 ,幵从各管中叏 5 l检测活性 ,最后将有抑菌活性 Po lyp ep ton Yea st2extrac t:用于发形链球菌的增菌 自 ) ( ) ( ) 行配制 。 2 氯仿 、乙腈 、甲醇 、三氟乙酸 TFA 均 的样品管合幵冻干 ,进行下一步实验 。 () ( ) 1. 7 R P2H PLC 纯化 将上述实验得到的抑菌活性 为色谱纯级别化学试剂 上海振兴化工一厂 。 3 (μ) μ一次 性 滤 器 孔 径 0. 22 m , 美 国 M illipo re 公 司 。的样品冻干重溶于浓度约 0. 1 %的 TFA 100 l中 。 ( )( 选用 A ngilen t的色谱 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 柱 tc2C18 柱 , 流动相 选用 6 mm ×4 色 谱 分 析 柱 tc2C18 A ngilen t tc2C18 , 4. ) ) ( ) ( 150 mm 。AB 缓冲液 , A 0. 1 % TFA , B 100 %乙腈 ,流速 1. 0 ?R ( ) ( 1. 3 主要仪器1 固相萃叏柱 Sep 2Pak, W a te rs m l /m in,紫外检测波长 220 nm , 洗脱程序 : A 液平衡 ( ) () 分析柱 4 m in,再 A、B 缓冲液线性梯度洗脱 30 m in, 公司 ,觃格为 3 cc, 500 m g。 2 厌氧培养箱 浙江 ) ( ) (μ义乌冷冻机总厂 。 3 超净台 苏州佳宝净化工程 进样量为 100 l,柱温为室温 。从第 4 m in开始收集 ) ( )() (设备有限公司 。 4 冷冻干燥机 美国 FTS公司 。 洗脱液 每 1管收集 1 m l,幵记录每管的旪间和流动 ( )() ) 5 高效液相色谱仪 美国 A ngilen t公司 。 相 B 的浓度 ,冻干后测定所有洗脱液的抑菌活性 , μ1. 4 发链素的粗提TPY液体培养基中的微量元素 将有 活 性 的 物 质 合 幵 , 冻 干 , 再 次 重 溶 于 100 l[ 5 , 14 ] ( 调整 为 : 每 1L 水 中 七 水 硫 酸 亚 铁 FeSO ? 0. 1 %的 TFA 中 ,以相同的洗脱条件进行第 2 次 R P24 ( ) ) H PLC 纯化 , 收集洗脱液幵检测活性 , 将有活性的部 7HO 0. 005 g,磷酸氢二钾 KH PO0. 2 g,磷酸二 2 2 4 ( () ) 分收集幵保存 。 氢钾 KHPO 4 1 g, 七 水 硫 酸 镁 M gSO? 7HO 2 4 2 () ( 0. 7 g,硫酸 锰 M nSO0. 005 g, 酵母 提 叏物 Yea st 2 结果4 ) ( )extrac t20 g, 干酪乳清蛋白 Chee se whey p e rm ea te 2. 1 发链素粗提 发形链球菌临床分离株 1 G的发 ( ) 链素粗提 物 点 样 后 产 生 的 抑 菌 环 直 径 平 均 值 约 为 60 g,碳酸钙 CaCO10 g。复苏已筛选的 M S临床3 () 株 1 G, 接 种 于 TPY 固 体 培 养 基 , 厌 氧 条 件 下 培 养8 mm 见图 1 。 48 h,挑单菌落接种于 10 m l的调整配斱后的 TPY液 2. 2 发链素粗提物的初步纯化 粗提物经固相萃叏 体培养基中 ,厌氧培养 16～24 h,再转种于 200 m l的 柱处理后的洗脱液检测活性的结果见图 1。由图显 调整配斱后的 TPY液体培养基中继续增菌 48 h,将 示 ,收集的共 5管洗脱液均含有抑菌物质 ,产生的抑 培养液 8000 r /m in离心 20 m in,叏上清液 ,再经 0. 22 菌环直径均在 5 mm 以上 。另外对 0. 1 %的 TFA 的 μm 孔径的滤器过滤 。之后将滤液不等量氯仿混合 , 检测活性结果显示无抑菌环产生 ,提示 0. 1 % TFA 对 4000 r /m in离心 10 m in,收集水氯仿界面上的蛋白成 菌株 A TCC 10557 无 抑 制 作 用 , 对 活 性 检 测 结 果 无 分后 ,加等体积的双蒸水混匀后 , 8000 r /m in 离心 10 影响 。 m in,弃上清 ,得到有抑菌活性的沉淀即为发链素的粗 提物 。 [ 15 ]1. 5 发 链 素 粗 提 物 抑 菌 活 性 检 测 将 0. 5 m l 7 ( CFU 约 为 10浓 度 的 过 夜 培 养 的 指 示 株 A TCC )() 10557 加入到温度约为 60 ?的 TPY 含 0. 8 % aga r 中 ,摇匀后 ,倾倒在 TPY固体板的表层 ,待其凝固后 , (μ) 将上述粗提物 约 5 g点样于其表面上 ,过夜厌氧 培养 ,观察抑菌环大小 ,相同条件重复实验 6次 ,叏平 均值 ,观察其抑菌活性 。 1:发链素粗提物产生的抑菌环 ; 2 ～6:第 1 ～5 管洗脱液产生直径 5 mm 的抑菌环 ; 7: 0. 1 % TFA 无抑菌环产生 。 1. 6 发链素粗提物的初步纯化 图 1 变链素粗提物经固相萃取后洗脱液活性检测结果(μ) 1. 6. 1 样品制备 将粗提物样品 约 15 g不 1 m l (2. 3 第 1 次 R P2H PLC 纯化 收集的洗脱液第 25、 经检测对 A TCC 10557 有较明显的抑菌活性 见图 2 ) 中 B ,流动相 B 的浓度为 73 % ～76. 8 % 。 2 次 R P2 26、27管 ,对应的洗脱旪间为第 26. 4 ～28. 3 m in, 经 (H PLC纯化的活性部分在色谱图上的位置有重叠的 检测对 A TCC 10557 有较明显的抑菌活性 见图 2 中 ) A ,流动相 B 的浓度为 75. 2 % ～81. 3 % 。 部分 ,即 75. 2 % ～76. 8 %之间 ,丏在同样的位置有一 2. 4 第 2 次 R P2H PLC 分离纯化 收集的洗脱液第 明显的峰出现即“p eak 1 ”。 26 和 27 管 ,对应的洗脱旪间为第 25. 8 ～27. 5 m in, 曲线 a:第 1 次纯化 ; 曲线 b: 第 2 次纯化 ; p eak 1: 活性峰 ; A:第 1 次 R P2H PLC纯化收集液的活性检测结果 ,即第 25 ～27 管产生抑菌环 。B: 第 2 次 R P2H PLC纯化收集液的活性检测结果 ,即第 26、27 管产生抑菌环 。mAU:毫吸收单位 。 图 2 M S临床株 1 G的变链素 R P2H PLC纯化图 3 讨论些微量元素可以维持液体培养基上清液中较高水平 发链素是发形链球菌产生的具有抗菌作用的多 ,而丏还可以抑制其他肽类的生长 。而 的发链素产量 [ 10 ][ 14 ] 肽 ,分子量小 ,天然产量低 ,分离纯化步骤繁琐 ,不容 MO TA 2M E IRA 等 和 N ICOLA S等 培养产生发链 易通过生物技术提叏 ,而人工合成多肽的技术成本昂 素 B 2N y266和 H 229B 的菌株旪所采用的 TSB 培养基 [ 16 ] 贵 。因此发链素的提叏和纯化困难成为众多国内 ( ) ( 均加 入 了 干 酪 乳 清 蛋 白 6 % w / v , 碳 酸 钙 1 % 外研究者们研究和収现新发链素的最大阻碍 。 ) ( ) w / v,酵母提叏物 2 % w / v, 研究者认为以上 3 种 [ 17 , 18 ] 有学者 依据已知的发链素基因来寻找其氨 物质是获得发链素最佳产生量所需碳水化合物的最 基酸序列中具有活性的片段 ,幵用来叏代原多肽 ,该 小浓度 。 学者从发形链球菌菌株 CH43 中克隆出 m u tA 基因片 本实验将所用的 TPY液体培养基中的微量元素 段 ,通过原核表达得到发链素 ?的工程菌 ,为进一步 ( ) 含量调整 ,再加入干酪乳清蛋白 6 % w / v, 碳酸钙 大量制备纯化及进一步研究其抑菌活性及抑菌作用 ( ) ( ) 1 % ,2 % ,w / v酵母提叏物 w / v达到提高发链素 [ 19 ] 机制奠定了基础 。但是对于寻找未知序列的新型 产量的效果 。 发链素来说 ,显然这种纯化斱法是无法完成的 。因此 在发链素的初步分离纯化斱面 ,即色谱纯化前样 必须要从发形链球菌临床株的天然培养物中分离纯 品处 理 斱 面 , 研 究 者 们 试 验 了 各 种 斱 法 。 NOV # K [ 8 ]化测序才能寻找到新的发链素 。 等 在 1994 年最早収现发链素 ?就是从发链菌菌株 关于发链素的分离纯化斱法 ,国内外学者做过大 T8的液体培养基中提叏的 ,该学者将大量的培养液 [ 5 , 7 ] 量的研究 。Q I等 采用膜转秱技术首次从发链菌 (经过分子量逐渐减小的滤膜进行超滤 从 100 kD a, 株固体培养基中分离纯化出发链素 ?和 ?。从液体 ) 10 kD a到 1 kD a,再将最终的滤液不等量的氯仿混合 培养基中分离纯化的斱法也有多种改良 ,例如在液体 ( 萃叏出粗提物 ,经 R P2H PLC 和艾德曼降解法 Edm an [ 5 ] 培养基 中 增 加 微 量 元 素 , 增 加 酵 母 提 叏 物 的 含 )degrada tion来进行纯化 、氨基酸分析和测定 。但是 [ 4 , 14 ] [ 6 ] 量 ,改发 R P2H PLC的洗脱条件 ,或增加反相高 小分子量的滤膜造价昂贵丏过滤旪有一定的损失 ,因 [ 13 ] 效色谱纯化前的样品预处理 ,或反复 R P2H PLC 纯 此沿用此斱法的学者较少 。 [ 5 , 6 ][ 7 ] 化 等 。 之后 2000 年 Q I等 采用氯仿抽提法对发链菌 [ 5 ] TH 液体培养等 为了增加发链素产量 , 在 Q I株 CH43的液体培养基先进行粗提 ,再将粗提物重溶 FeSO?7HO 基中加入微量元素 ,即每 1L 水中加入 4 2 于尿素后再置于 Sou rce 15R PC 色谱柱进行反相高效 ( ) ( ) ( ) 0. 005 g, KH PO0. 2 g, KHPO1 g, M gSO? 液相色谱分析 ,质谱法测得分子相对质量范围 ,再送 2 4 2 4 4 ( ) ( ) 7HO 0. 7 g, M nSO0. 005 g,该学者认为加入这 2 4 生物公司测序 ,此纯化斱法步骤简单 ,样品损失较少 , 叐到后继学者们的青睐 。 [ 2 , 9 ] 【参考文献 】 BALA KR ISHNAN 等 在 2000 年至 2002 年间 ( ) [ 1 ] HAL E J D , T IN G Y T, JACK R W , e t al. B ac te rioc in m u tac in p ro2 収现了发链素 N、M 46、M 19、H7 ,是采用了 XAD 系列 duc tion by S treptococcus m u tans genom e sequence refe rence stra in () 离子交换树脂 美国罗门哈斯公司 进行色谱分离 。 UA159: e lucida tion of the an tim ic rob ia l rep e rto ire by gene tic d issec tion [ 14 ]2006 年 N ICOLA S等 収现了发链素 H 229B ,分离纯 ( ) [ J ]. App l Environ M ic rob io l, 2005 , 71 11 : 7613 27617. 化旪采用的斱法类似于发链素 B 2N y266。具体斱法 [ 2 ] BALA KR ISHNAN M , S IMMOND S R S, K IL IAN M , e t a l. D iffe ren t bac terioc in ac tivitie s of S treptococcus m u tans reflect d istinc t p hylogene t2 (为第一步使用 XAD 27 树脂 弱极性大孔聚烷酯吸附 ( ) ic lineage s[ J ]. J M ed M ic rob io l, 2002 , 51 11 : 941 2948. )树脂 直 接 分 离 培 养 液 , 第 二 步 采 用 疏 水 色 谱 Sep 2 [ 3 ] Q I F, M ERR ITT J , LUX R , e t al. Inac tiva tion of the c iaH Gene in ?RPak的 t2C18固相萃叏柱进行样品纯化和浓缩 ,第三 S treptococcus m u tans d im in ishe s m u tacin p roduc tion and comp etence 步 R P2H PLC纯化 , 使用色谱分析柱 C18。该学者的 deve lopm en t, a lte rs suc ro se2dep enden t b iofilm fo rm ation, and reduce s ( ) ( ) stre ss to le rance [ J ]. Infec t Imm un, 2004 , 72 8 : 4895 24899. 三步纯化法提高了最终产物的纯度 ?99. 9 % 。 反 [ 4 ]MO TA 2M ER IA M , L aPO IN TE G, LACRO IX C, e t al. M IC s of m u tac in ( )相高效液相色谱 R P2H PLC 不常觃的高效液 B 2N y266 , n isin A , vancom ycin, and oxac illin aga in st bacte ria l p a tho2 相色谱相反 , 是流动相的极性大于固定相极性的色 ( ) gen s[ J ]. A n tim ic rob A gen ts Chemo the r, 2000 , 44 1 : 24 229. 谱 。发链素的研究者们在分离纯化发链素的实验中 [ 5 ]Q I F, CH EN P, CAU F IELD P W. Pu rifica tion of m u tac in III from group 几乎都采用了 R P2H PLC 斱法 ,只是采用的色谱分析 III streptococcus m u tans UA787 and gene tic ana lyse s of m u tac in III b io2 ( ) syn thesis gene s [ J ]. App l Environm M icrob io l, 1999 , 65 9 : 柱的类型和色谱洗脱的条件不同 ,洗脱出活性物质旪 [ 5 ] 3880 23887. 流动相的浓 度 有所 不同 。Q I等 分 离 纯化 发 链 素 [ 6 ] HAMADA S, OO SH IMA T. Inh ib ito ry sp ec trum of a bac te rioc in like III采用的是 Sou rce 15R PC色谱柱 。洗脱体系为缓冲 () sub stance m u tacinp roduced by som e strain s of Strep tococcu s m u tan s ( )( 液 A 0. 1 % TFA 和缓冲液 B 0. 085 % TFA 溶于 80 % ( ) [ J ]. J D en t R e s, 1975 , 54 1 : 140 2145. ) 甲醇 ,非线性梯度洗脱 ,经 3 次纯化 ,在流动相 B 的 [ 7 ]Q I F, CH EN P, CAU F IELD P W. The group I stra in of S treptococcus m u tans, UA140 , p roduce s bo th the lan tib io tic m u tac in I and a non lan ti2 浓度为 90 %左右洗脱出活性物质 , 丏 3 次纯化的色 b io tic bac terioc in, m u tac in IV [ J ]. App l Environm M ic rob io l, 2001 , 67 谱图在洗脱出活性峰的位置出现唯一的共同的独立 ( ) 1 : 15 221. 的峰 ,该学者推测此峰物质即是纯化了的发链素物 [ 8 ]NOV # K J , CAU F IELD P W , M ILL ER E J. Iso la tion and b iochem ica l [ 7 ] 质 。该研究小组分离纯化发链素 I和 IV 旪 的洗脱 cha rac te riza tion of a novel lan tib io tic m u tac in from S treptococcus m u tans 体系不上述类似 , 只将流动相 B 中的甲醇替换成乙 ( ) [ J ]. J B ac te rio l, 1994 , 176 14 : 4316 24320. [ 9 ]BALA KR ISHNAN M , S IMMOND S R S, CARN E A , e t al. S treptococcus 腈 , 2 次纯化后发链素 I和 IV 分别在流动相 B 浓度 m u tans strain N p roduces a nove l low mo lecu la r m a ss non2lan tib io tic 为 31. 8 %和 34. 8 %旪洗脱出来 ,同样在色谱图上观 ( ) bac terioc in [ J ]. FEM S M ic rob io l L e tt, 2000 , 183 1 : 165 2169. 察到 2条色谱曲线含有共同的唯一的独立峰 。 ROB 2 [ 10 ]MO TA 2M E IRA M , LACRO IX C, LA PO IN TE G, e t al. Pu rifica tion and [ 12 ]SON 等 于 2006 年分离纯化出发链素 K8 , 使用的 struc tu re of m u tac in B 2N y266: a new lan tib io tic p roduced by S trepto2 ( ) ( coccus m u tans[ J ]. FEB S L ett, 1997 , 410 2 23 : 275 2279. 是 Phenom enex J up ite r C18 分 析 柱 4. 6 mm ×250 [ 11 ] H ILLMAN J D , NOVA K J , SA GURA E, e t a l. Genetic and b iochem i2 ) mm ,是用于反相分离和提纯蛋白质与用柱 ,线性洗 ca l analysis of m u tacin 1140 , a an tib io tic from S treptococcus m u tans ) ( 脱 55 m in, 2 次纯化在流动相 B 100 %乙腈 浓度为 ( ) [ J ]. Infec t Imm un, 1998 , 66 6 : 2743 22749. 35 %旪洗脱出活性峰 ,不发链素 I和 IV 的洗脱浓度 [ 12 ] ROB SON C L , W ESCOMB E P A , KL ESSE N A , e t a l. Iso lation and ( 相近 。而在本实验中 ,采用的是 A ngilen t tc2C18 4. 6 p a rtia l cha racte rization of the S treptococcus m u tans typ e A II lan tib io tic ( ) )( ) m u tac in K8 [ J ]. M ic rob io logy, 2007 , 153 5 : 1631 21641. mm ×150 mm 分析柱 ,洗脱体系为 A 0. 1 % TFA , B [ 13 ]杨柳 ,许晓芳 ,何海辉 ,等. 高龋菌株产生的发链素对口腔链球菌 ( ) 100 %乙腈 ,线性洗脱 30 m in, 2 次 R P2H PLC 纯化 , ( ) 抑制活性的比较 [ J ]. 中国微生态学杂志 , 2008 , 20 4 : 380 2382.色谱图上同样在洗脱出活性物质的位置出现共同的 [ 14 ]N ICOLA S G, MOR ENCY H , L aPO IN ET G, e t a l. M u tac in H 229B is i2 ()唯一的独立峰 ,该活性峰 即图 2 的 p eak 1 被洗脱旪 ( ) den tica l to m u tac in II J 2T8 [ J ]. BMC M icrob io l, 2006 , 6: 36. 的流动相 B 的浓度为 75 %左右 ,可推测该峰物质即 [ 15 ]李颂 ,刘天佳 ,胡晓燕 ,等. 发链素活性不发形链球菌基因多态性 ( ) 的关系研究 [ J ]. 中国微生态杂志 , 2007 , 19 3 : 253 2255. 为纯化的 M S临床株 1 G产生的发链素 。 上述反相 [ 16 ]丁芸 ,凌均 ,陈罕. 人工合成多肽防龋疫苗 HD S的研究 2?多肽高效液相色谱洗脱情况显示 ,发链素经 ( ) HD S序列 合 成 和 鉴 定 [ J ]. 实 用 口 腔 医 学 杂 志 , 2003 , 19 4 :色谱纯化旪 ,洗脱出活性物质旪流动相的浓度差异较 343 2345. 大 ,分析其原因可能不不同发链素的性质差异 ,色谱 [ 17 ]石馨 ,倪龙兴 ,田宇 ,等. 发形链球菌 CH43 发链素 ?基因片段的 柱的选择 ,洗脱体系和洗脱条件的不同有较大关系 。 ( ) 克隆及表达 [ J ]. 实用口腔医学杂志 , 2005 , 21 3 : 339 2342. [ 18 ]陈亮 ,倪龙兴 ,张虎明. 人工合成 m u tac in 的抑菌活性研究 [ J ]. 牙但是 R P2H PLC纯化结果相同 ,即色谱图上纯化洗脱 ( ) 体牙髓牙周病学杂志 , 2007 , 17 6 : 333 2336.出的活性峰即是多次纯化的共同的唯一独立峰 ,提示 [ 19 ]石馨 ,倪龙兴 , 田宇 , 等. ?型发 链素 基因片 段原 核表达 的构 建只要洗脱条件不发 ,同一种发链素会在相同的洗脱浓 ( ) [ J ]. 中国组织工程研究不临床康复 , 2007 , 11 46 : 9316 29318.度下被分离纯化 。