【doc】龟龄集对大鼠脊髓灰质内突触小泡蛋白变化的影响

【doc】龟龄集对大鼠脊髓灰质内突触小泡蛋白变化的影响 龟龄集对大鼠脊髓灰质内突触小泡蛋白变 化的影响 CHINESEJOURNALOFANATOMYV01.26No.62003解剖学杂志2003年26卷6期 龟龄集对大鼠脊髓灰质内突触小泡蛋白变化的影响 任占川郭建平郭-~,[dl3郭连魁 (1山西医科大学汾阳学院,汾阳032200;2山西省汾阳医院;3山西省孝义市妇幼保健站;4山西医科大学) 摘要目的:研究龟龄集对大鼠脊髓灰质内突触小泡蛋白的影响,探索龟龄集的抗衰老功效.方法:采用免疫组织 化学结合图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法,对龟龄集喂药鼠和对照鼠的脊髓颈膨大,胸髓,腰膨大和骶尾髓灰质内突触小泡蛋白的免疫 反应产物进行了观测.结果:对照和喂药鼠各自的脊髓各段后角内突触小泡蛋白免疫反应产物的灰度值不同,均 以脊髓胸段最小,腰膨大最大;脊髓后角内免疫反应产物的灰度值均低于前角.对照组脊髓各段后角内突触小泡 蛋白免疫反应产物的灰度值均明显高于喂药组.结论:龟龄集可延缓神经元的衰老,防止脊髓灰质内突触小泡蛋 白的丢失,增强动物肢体感觉的灵敏性和活动的灵活性. 关键词龟龄集;突触小泡蛋白;脊髓;衰老 EffectofGuilingjionvariationofsynaptophysininratspinalcordgraymatter PENZhan-Chuan,GUOJian—Ping,GUOJun—Xian,GUOLian—Kui (FenyangCollege,ShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China) AbstractObjective:ToexploreGuilingii'SactionbyrGsearchintoitseffectonsynaptophysin inratsspinalcordgray matter.Meth~:Thesynaptophysinimmunoreativeproductsinratsspinalcordcervicalenlarg ement,thoracicpulp, lumbarenlargementandsacrococcygealpulpofGmlin~iadminitrationgroupandcontrolgroupwereobservedbymeadsof immunohistochemistrycombinedwithimageanalysis.Results:Differentgraydensitiesofsynaptophysinimmuoreative productswithinposteriorhomindifferentsectionsofspinalcordwereobservedinboth.Thedegreewasthesmallestin thoracicsectionofspinalcordandthebiggestinlumbarenlargement;thegraydensityofimmunoreactiveproductsin spinalcordposteriorhomwerelowerthanthoseinanteriorhom.Thegraydensityofsynaptophysinimmuoreactiveprod— uctsinposteriorhornofdifferentsectionsofspinalcordincontrolgroupwasobviouslyhigherthanthatinadministration group(P<0.O1一 P<0.001).Czmclus/on:Guilingiicandelaytheagingofneuronandpreventthelossofsynaptophysin inspinalcordgraymatter,strentheningthesensitivityofanimalslimbperceptionandtheflexibilityoftheirmovements. KeywordsGuilingji;synaptophysin;spinalcord;aging 突触小泡蛋白是突触小泡的一种特异性膜 蛋白,参与突触小泡的发生和神经递质的释 放[1-3],其变化直接影响着突触的结构和功 能,对各种神经活动有着重要的影响.因此,突 触小泡蛋白已成为目前的研究热点.陈运 才[4I,任占川[5]曾分别以运动和滋养性中药对 大鼠的小脑和海马,脊髓前角内突触小泡蛋白 的影响作过研究.本文采用免疫组织化学结合 图像分析的方法较全面地研究了龟龄集对脊髓 灰质后角内突触小泡蛋白的影响,旨在探索龟 龄集对中枢神经系的抗衰老功效. l材料和方法 1.1材料龟龄集(人参,鹿茸,海马,枸杞,雀 脑等)由山西中药厂生产,批号:920406.抗突 触小泡蛋白抗体,SP试剂盒,购自北京中山生 物技术有限公司.Wistar雄性大鼠,由山西医 科大学动物中心提供.MIAS-300型图像分析 ---—— 583.-.—— 仪(四川大学图象图形研究所研制). 1.2动物分组和给药将18只大鼠随机分为 对照组(8只)和喂药组(10只).对照组以普食 喂养;喂药组从12月龄开始服龟龄集,按25 mg?kg_1-dI1将药溶于饮水中.每日上午让动 物自由饮用药溶液,待饮用完毕后,下午再让其 饮用普通水,喂养12个月至24月龄. 1.3切片的制作和免疫组化动物用戊巴比 妥纳腹腔内麻醉后,开胸经主动脉插管冲洗,再 灌注4%的多聚甲醛500ml后,取出脊髓置于 4%的多聚甲醛液后固定3h,分别作颈膨大,腰 膨大的最粗处,胸髓的中段及骶尾髓连续冠状 冰冻切片.片厚40/.tm,每隔5张取一片,用 SP法进行突触小泡蛋白免疫组织化学染色:切 片入抗突触小泡蛋白抗体(1:100)孵育过夜 (4?),再依次入生物素标记的IgG(1:100)和 辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(1:100)中 各孵育1h(室温),反应产物用DAB显色,而后 贴片,脱水,透明,DPX封片.对照实验以正常 羊血清代替一抗,其它步骤相同,结果为阴性. 1.4图像分析及统计处理采用图像分析仪 测定脊髓颈膨大,胸髓,腰膨大及骶尾髓的后角 内突触小泡蛋白免疫反应产物的灰度值,每例脊 髓各段均各测10张切片,得其均值,作t检验. 2结果 2.1动物的一般情况2组大鼠在18月龄以 前,外观上无明显差异.当18月以后对照鼠逐 渐出现毛无光泽且发黄,有不同程度的倦怠,经 常处于蜷曲不动状态.而喂药鼠毛光泽顺滑, 且活泼爱动. 2.2突触小泡蛋白免疫阳性产物的一般形态 学突触小泡蛋白免疫反应阳性产物主要局限 在脊髓灰质,在被测脊髓灰质各段中,以胸髓染 色最深.神经毡内突触小泡蛋白免疫反应产物 呈颗粒或点状,淡染的点状反应产物间散布的 深染的大结构是一些突触复合体6(图1,8). 白质内也有少量免疫阳性纤维分布,这些阳性 纤维可能反应了白质内的"旁侧联系",因为白 质纤维束的旁侧支可以与伸入白质的树突发生 突触联系【. 2.3龟龄集对各段脊髓后角内突触小泡蛋白 免疫反应产物的影响(附表,图1,8)对照和 喂药两组突触小泡蛋白免疫反应产物的一般形 态学未见差异.研究结果显示,对照和喂药组 各自的脊髓各段后角内突触小泡蛋白免疫反应 产物的灰度值不同,以胸髓最低,腰膨大最高. 对照组脊髓各段后角内反应产物的灰度值均明 显高于喂药组(P<0.05),增高的幅度分别是: 颈膨大9.40%,胸髓2.10%,腰膨大5.40%, 骶尾髓4.20%. 附表龟龄集对老龄大鼠脊髓后角内突触小泡蛋白免疫反应产物灰度值的影响(X ?) TabGuilingjieffectongraydensityofsynaptophysinimmunoreactive productsinoldratsspinalcordposteriorhorn(X?) Comparedwiththerespectivesectionsofthespinalcordincontrolgroup.P<0.05 3讨论磊篡嚣篓 3.1突触小泡蛋白(synaptophysinP38)特异性位和定量可以准确的反应突触的分布 和密 地位于轴突终末突触前囊泡膜上[8l.光镜下度[.本研究通过突触小泡蛋白免疫反 应产物 ?---—— 584?---—— 圉i 图5 Fig1-4 Fig5-8 Shewingstainingresultsofsynaptophysinimmunohistochemistryinspinalcordposteriorhe mofcervicalenlargement,themcic cord,lumbarenlargementandsacrococcygealcordrespectivelyincontrolgroup,×200. Shewingstainingresultsofsynaptophysinirnmunohistochemistryinspinalcordposteriorhe mofcervicalenlargement,themcic cord,lumbarenlargementandsacrococcygealcordrespectivelyinadministrationgroup.十 inFig6standsforspottedsynapto. physinimmunoreativeproducts.? inFig6standsfordeep-stainingsynapsiscomplexofthosespottedproducts.x200. 的灰度值,推测突触数量的变化.研究显示,脊 髓各段后角内突触小泡蛋白免疫反应产物的灰 度值对照和喂药组均以胸髓最小,腰膨大最大, 即脊髓灰质胸段内突触小泡蛋白的含量最为丰 富,而腰膨大内含量最少.综合有关研究结果, 在个体发育过程中,脊髓灰质内合成的突触小 泡蛋白在胚胎时期随着胎儿的生长发育而逐渐 增加,出生后则与年龄的变化关系不明显l9j. 而脊髓灰质各段内突触小泡蛋白的合成程度不 同,胸髓内突触小泡蛋白的合成能力最强,腰膨 大最弱. 3.2我们以往的研究中,脊髓颈膨大,胸髓,腰 膨大,骶尾髓前角内突触小泡蛋白免疫反应产 物的灰度值在对照组分别为205.73?1.84, 195.90?1.65,213.53?2.37,206.92?3.16: 在喂药组分别为200.71?4.40,178.30? 7.20,203.38?4.42,191.50?2.28LuJ,对照组 和喂药组各段的前角与后角比较,均为后角小 于前角(P<0.05).脊髓后角内的突触小泡蛋 白主要来自脊神经节细胞,上述表明脊神经节 细胞的蛋白合成功能较强.至于脊髓后角内的 突触较前角丰富,其意义有待进一步研究. 3.3龟龄集的抗衰老作用.脊髓前,后角内突 触小泡蛋白含量的正常与否影响着动物躯干, 四肢感觉的灵敏性和运动的灵活性.本研究结 果显示,喂药鼠脊髓前,后角内突触小泡蛋白免 疫反应产物的灰度值明显低于对照鼠,即喂药 鼠脊髓前,后角内突触的数量较多,故出现喂药 鼠肢体活动灵活且活泼爱动.而对照鼠肢体运 动笨拙且不愿活动的衰老现象.运动的灵活性 必然依靠感觉的灵敏性.因此可认为,喂药鼠的 神经活动无论感觉还是运动均较对照鼠灵敏. 有研究认为,突触小泡蛋白的减少,标志着神经 ?---—— 586?---—— 元的衰老,因为当神经元衰老时蛋白质的合成能 力下降最终导致突触小泡蛋白含量的降低... 综合上述结果认为,龟龄集具有延缓神经元衰 老,防止脊髓内突触小泡蛋白丢失的功效. 参考文献 1RubensteinJL,GreengardP,CzemikAJ.Calcium—depen— dentserinephosphorylationofsynaptophysin.Synapse, 1993,13(2):161—172. 2BergmarmM,SchusterTH,GrabsD,etalSynaptophysin andsynaptoporinexpressioninthedevelopingratolfactory system.DevBrainRes,1993,74(1):235—244. 3OvtscharoffW,BergmannM,Marqueze-poueyB,eta1. OntogenyofsynaptophysinandSyrmptoporininthecentral nervoussystem:Differentialexpressioninstriatalneurons andtheirafferentsduringdevelopment.DevBrainRes, 1993,72(3):219—225. 4陈运才,姚志彬,顾耀铭,等.运动对小鼠海马结构突触素年 龄变化的影响.中国运动医学杂志,1995,14(4):198-202 5任占川,侯迎潮,王树党,等.龟龄集对大鼠海马结构内突 触小泡蛋白年龄变化的影响.解剖学杂志,2000,23(60): 563—567. 6NavoneF.ProteinP38:Anintegralmembraneproteinsl0e— cificforsmallvesiclesofneuronsandneuroendorinecel1.J Cel1Bio1.1986,103(6):2511-2515. 7陈运才.运动对小鼠脊髓前角运动神经元树突结构可塑 性的影响.广东解剖学通报,1993,15(1):28.33. 8WiedenlTlannB.FrankeWW.Identificationandlocalization ofsynaptophysin,anintegralmembraneglycopmteinofMr 3800characteristicofpresynapticvesides.Cell,1985,41 (3):1017.1028. 9CaballkaLM.Irnmunolocalizationandquantitationofanovel nerveterminalproteininspinalcorddevelopment.JComp Neurol,1990,295(1):83.87. 10洪岸,姚志彬,顾耀铭,等.老年大鼠学习记忆减退与海 马结构的突触索改变.解剖,1996,27(2):164—168. 11任占川,郭俊仙,田林,等.龟龄集对老龄大鼠脊髓前角 内突触素变化的影响.中成药,2002,22(10):734—736.