流感病毒基础的知识

流感的危害 流行性感冒简称流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有传染性强、流行面广、潜伏期短、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。有数据表明，每年冬季流感爆发期会使全球人口近10％感染致病。 流感病毒简介 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原体，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。(是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1科)粘病毒是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和力的病毒。正、副粘病毒的区分以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一个种。 （一）形态与结构 流感病毒具有多形态，一般为球形，也有的呈丝状或杆状，病毒直径为80-120nm。流感病毒的结构主要包括内部的核心、衣壳（核衣壳）和外面的包膜（附图）。 Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference [22]) 1、核心（core）  流感病毒的核酸为分节段、负链单股RNA，称为分节段基因组（segmented genome）。其中甲型和乙型流感病毒的核酸分为8个节段，而丙型流感病毒的分为7个节段。每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性。第1~6基因节段分别编码RNA多聚酶（RNA polymerase）PB2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因节段编码包膜蛋白，包括内膜基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8节段编码非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。流感病毒各基因节段复制后，组装入子代病毒体中，但在组装过程中极易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这是流感病毒容易发生变异而出现大流行的主要原因。 2、衣壳（caspid）  核蛋白是流感病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳卷曲包绕在RNA外，并与3种RNA多聚酶（PB1、PB2、PA）一起与RNA节段形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），即螺旋对称的核衣壳。RNA多聚酶PB1、PB2、PA与RNA的转录有关，核蛋白的抗原性稳定，很少发生变异，具有型特异性。 3、包膜（envelop）  流感病毒包膜由内向外，可分为内膜基质蛋白（matrix protein, MP）和脂蛋白（lipoprotein，LP）两层。内膜基质蛋白M1，是包围在病毒核心外的一层膜结构，介于核蛋白与脂质双层膜之间，与组成脂质双层膜的类脂紧密结合，在维持病毒形状与完整性上起重要作用，具有型特异性。脂蛋白层是脂质双层膜的结构成分，来源于宿主细胞膜或核膜。基质蛋白M2为镶嵌其中的膜蛋白，形成膜通道，有利于病毒脱壳及血凝素的生成。 流感病毒包膜上镶嵌的两种糖蛋白向外突出形成刺突（spike），一种是血凝素（hemagglutinin，HA），另一种是神经氨酸酶（neuraminidase, NA）。HA的数量是NA的4~5倍。 (1) 血凝素（HA）  流感病毒与宿主细胞的结合部位，是病毒侵入宿主细胞所必需的，因能与多种动物（如鸡、豚鼠）及人类红细胞表面的糖蛋白受体相结合并引起红细胞的凝聚而得名。 HA是流感病毒的主要中和抗原，其表面有五个抗原决定簇，抗HA抗体能够抑制血凝及中和病毒，抑制病毒从感染细胞中释放出来，是重要的保护性抗体。这一重要特征使抗HA的抗体能够对流感病毒产生免疫作用。但HA的抗原结构极易发生改变，从而导致其抗原性的变异，这也成为流感病毒亚型分类的主要依据。 (2) 神经氨酸酶（NA）  具有酶活性，可水解宿主细胞糖蛋白末端的N-乙酰神经氨酸，有利于成熟病毒的释放，并可防止新生病毒体的聚集。 NA也具有抗原性，抗NA抗体可以抑制新生流感病毒从宿主细胞内释放，但没有中和病毒的作用。NA的抗原结构较易发生变异，是流感病毒亚型划分的另一依据。 （二）分型、变异与流行 根据核蛋白与内膜基质蛋白M1抗原性的不同，可把感染人类的流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒对人类及多种动物有致病力，是Smith于1933年从雪貂的鼻腔分泌液中首次分离出来的。乙型流感病毒仅对人类有致病力，是1940年由Francis和Magill发现的。丙型流感病毒于1947年由Taylor发现，是对人类危害较小的非临床病原体。 各型流感病毒又根据其表面HA及NA抗原性的不同再分为若干亚型，目前已发现16个HA亚型（H1~H16）和9个NA亚型（N1~N9），而病毒的命名也是据此表示的，人类间流行的亚型主要是H1、H2、H3和N1、N2。流感病毒的抗原性结构由于分节段基因组的存在，使病毒在复制中易发生重组变异，从而产生新的亚型。通过对世界上过去流感流行的资料分析发现，甲型流感病毒的表面抗原HA、NA最易变异，二者可同时变异，也可分别变异。乙型和丙型流感病毒的抗原性比较稳定。自1933年分离出甲型流感病毒以来，已发生多次世界性的大流行（附表）以及大流行间期的小流行。其流行规模的大小，主要取决于病毒表面抗原变异幅度的大小。 附表 甲型流感病毒抗原变异情况 流行年代 病毒亚型 代表病毒株* 抗原结构 1934-1946 A（原甲型） A/PR/8/34 H0N1 1946-1957 A1（亚甲型） A/FM/1/47 H1N1 1957-1968 A2（亚洲甲型） A/Singapore/1/57 H2N2 1968-1997 A3（香港甲型） A/Hong Kong/1/68 H3N2 1977- A1A3（香港甲型与亚甲型） A/USSR/90/77 H1N1         *代表病毒株：型别/病毒分离地点/毒株序号/分离年代（19××），例如，A/Hong Kong/1/68表示甲型/香港/1/1968年。 流感病毒的变异与流感的流行性密切相关，可分为抗原性漂移（antigenic drift）和抗原性转变（antigenic shift）。变异幅度小，属于量变的称抗原性漂移，是由核酸序列的点突变致使HA和NA抗原表位发生某些改变或人群免疫力选择性的不同而造成的，可以使流感病毒不受宿主免疫系统的作用。这类变异属于亚型内变异，可引起中小流行。若变异幅度大，即新毒株的HA和/或NA完全与前次流行株失去联系，形成新的亚型，属于质变的则称抗原性转变，是由核酸序列不断的突变积累或外来基因片段重组所致。这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效，因此可以引起大规模甚至世界性的流感流行。 关于流感病毒抗原性转变的机制有两种学说，一种是基因突变（gene mutation），流感病毒经过人群免疫力的自然筛选，抗原性的变异经历一个从量变到质变的过程，直至形成新的亚型，这一过程需要10~15年；另一种是基因重新配对（gene reassortment），新的流感病毒亚型来源于人类流感病毒不同亚型之间或人类与动物流感病毒之间的基因重新配对，如1957年的H2N2亚型的HA、NA、PB1的基因来自于禽流感病毒，其他5个基因片段来自于人类的H1N1亚型；1968年的H3N2亚型是由人类的H2N2亚型与一株鸭流感病毒基因重新配对产生的。1999年，香港首次从人体中分离得到H9N2亚型禽流感病毒。 禽流感（avian influenza, AI）是由甲型流感病毒引起的一种急性传染病，主要发生在禽类，也发生在哺乳动物甚至人类。迄今，已有多起世界高致病性禽流感暴发的报道。研究发现，高致病性禽流感的致病性极强，可导致家禽近100%死亡，1g受污染的禽类粪便所含的病毒可以感染100万只家禽，对禽类危害较大的有H5、H7、H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不感染鸟类以外的动物。2003年12月至2004年3月，禽流感（H5N1）在日本、韩国、越南、泰国、中国等国家出现，其中越南、泰国出现人类感染禽流感病毒的病例并造成死亡。 流感病毒感染过程 流感病毒经飞沫传播，进入呼吸道，然后侵入呼吸道黏膜细胞并进行增殖。病毒的复制过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放五个步骤。 （一）吸附（absorption） 带有流感病毒颗粒的飞沫（直径一般小于10μm）侵入呼吸道后，病毒的NA破坏神经氨酸，使粘蛋白水解，糖蛋白受体暴露，从而实现糖蛋白受体与HA（含糖蛋白成分）的结合。这是一种专一性吸附，具特异性，能被抗HA抗体所抵制。 （二）穿入（penetration） 流感病毒在与易感细胞结合后，在其附着处的细胞膜内陷，形成一个将包膜病毒包囊在内的小体，然后病毒包膜与宿主细胞融合。 （三）脱壳（uncoating） 在宿主细胞溶酶体酶的作用下，衣壳脱去，释放出病毒RNA。 （四）生物合成（biosynthesis） 流感病毒RNA被转运到细胞核内，在RNA多聚酶的参与下，以亲代病毒-ssRNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，复制出互补的+ssRNA，形成复制中间型。然后复制中间型解链，互补的+ssRNA发挥mRNA的功能，翻译出病毒结构蛋白和酶；同时以互补的+ssRNA为模板，复制出大量的子代-ssRNA（附图）。 附图  负股单链RNA（-ssRNA）病毒（如流感病毒）的生物合成 （五）装配与释放（assembly and release） 合成的子代病毒RNA和衣壳蛋白在胞质中参加装配，形成子代病毒核衣壳。然后以出芽的方式，不断通过细胞膜，释放到胞外，同时获得包膜，从而成为有感染性的真正意义上的子代病毒。新生的子代病毒即由感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散。 【流感病毒在细胞膜上获得包膜，然后以出芽的方式释放出成熟病毒。病毒的出芽释放不直接引起宿主细胞死亡，因为细胞膜在出芽之后可以被修复，宿主细胞仍能进行正常的新陈代谢。病毒以出芽方式释放后，也将病毒成分留在细胞膜上，使感染细胞具有免疫原性，引起免疫应答。包膜上的脂质来自宿主细胞，可因在不同细胞内增殖而不同，但包膜的蛋白质由病毒的核酸编码，故具有病毒的特异性及免疫原性。】 【附注：抗原是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性immunogenicity和反应原性 reactiongenicity。免疫原性又称为抗原性，是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。反应原性是指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。具备免疫原性和反应原性两种能力的物质称为完全抗原，如病原体、异种动物血清等。只具有反应原性而没有免疫原性的物质，称为半抗原，如青霉素、磺胺等。半抗原没有免疫原性，不会引起免疫反应。但在某些特殊情况下，如果半抗原和大分子蛋白质结合以后，就获得了免疫原性而变成完全抗原，也就可以刺激免疫系统产生抗体和效应细胞。在青霉素进入体内后，如果其降解产物和组织蛋白结合，就获得了免疫原性，并刺激免疫系统产生抗青霉素抗体。当青霉素再次注射人体内时，抗青霉素抗体立即与青霉素结合，产生病理性免疫反应，出现皮疹或过敏性休克，甚至危及生命。】 病毒在黏膜上皮细胞内增殖，造成这些细胞变性、坏死、脱落，黏膜充血、水肿，腺体分泌增加。经过1~2天的潜伏期，感染者即可出现流感症状，如打喷嚏、鼻塞、咳嗽等。病毒在上皮细胞内复制，很少入血，但可释放内毒素样物质入血，引起全身中毒症状，如发热、头痛、全身酸痛、疲乏无力、白细胞数下降等。流感病毒感染发病率虽高，但一般数日内自愈。幼儿或年老体弱者易继发细菌感染，如合并肺炎等，病死率高。 抗流感药物的靶点 基于对流感病毒复制周期（replicative cycle）的理解，可以发现，抑制或阻断其中的任一环节均能实现对流感的控制。结合流感病毒的结构和功能，可以用来设计抗流感药物的靶点有：神经氨酸酶（neuraminidase, NA）、血凝素（hemagglutinin，HA）、RNA多聚酶、M2离子通道。其中又以NA最受关注，后面将单独加以详述。在此先对后三者做一简述。 （一）血凝素（hemagglutinin，HA） HA是由3条相同的糖基化多肽以非共价形式聚合而成的三聚体（trimer），在病毒感染的初始阶段起着两个非常重要的作用：受体结合与膜融合。前者能够使病毒吸附于宿主细胞表面的神经氨酸受体，后者导致病毒包膜与宿主细胞膜的融合而使病毒RNA及相关酶进入细胞。 当HA单体被宿主细胞的丝氨酸蛋白酶切割裂解成HA1（重链）和HA2（轻链）时，流感病毒才表现出感染性。其中，HA1是与宿主细胞膜神经氨酸受体结合的亚单位；HA2其N末端的疏水性氨基酸序列，是融合结构域，而其C末端附近的氨基酸序列则插入病毒包膜的脂质双层膜中，是HA与病毒包膜的结合部位。HA1和HA2共同作用可以使流感病毒吸附于宿主细胞表面，成为流感病毒进入宿主细胞的先决条件。 HA与宿主细胞膜神经氨酸受体结合作用较弱，但协同结合可加强其作用。尽管自然界有大分子量的流感病毒HA抑制剂（在人的呼吸道分泌物中有一种可溶性黏液蛋白，也具有流感病毒受体能结合HA，从而抵制病毒侵入细胞，但只有在流感症状出现后，呼吸道黏液分泌增多时，才有一定的防护作用）存在，但开发单一结合配体的努力迄今尚未获得成功。 HA的活化裂解对于其感染性是必需的，故而也是一个诱人的靶点。实验显示，在组织培养和小鼠肺脏中，某些蛋白酶抑制剂确实能有效地抑制病毒复制。由细支气管上皮Clara细胞分泌的一种蛋白酶被发现可以裂解HA0成HA1和HA2，并且这种酶的抑制剂也被考虑用于临床。不幸的是，由于Clara蛋白酶是一种宿主酶，任何用于治疗流感感染的此种抑制剂均可能产生不良的副作用。 与宿主细胞的神经氨酸受体结合后，病毒颗粒被纳入到内涵体中。在此，pH下降且HA构象发生改变，从而导致HA2先前隐藏的N末端疏水性氨基酸序列（融合结构域）暴露，进而使病毒与宿主细胞膜发生融合，病毒核酸复合物进入胞质开始复制。其融合机制尚不完全清楚。融合抑制剂仍在开发中，目前未见此类化合物进入临床的报道。 （二）RNA多聚酶 流感病毒是分节段的负链单股RNA病毒，其基因转录、病毒蛋白翻译及子代病毒RNA的复制均需通过正链RNA来完成。上述过程是在宿主细胞核内由病毒编码的RNA依赖的RNA多聚酶实现的，并且此酶只存在于被感染的宿主细胞中。因此，RNA多聚酶成为又一个诱人的抗流感病毒药物设计靶点，但遗憾的是，目前无相关化合物进入临床研究阶段。 （三）基质蛋白M2 基质蛋白M2为镶嵌于病毒包膜的膜蛋白，其功能类似于离子通道。当病毒颗粒处在内涵体低pH环境下及HA介导的融合发生前，允许H+进入病毒颗粒中。降低病毒内部的pH致使内膜基质蛋白M1从核糖核蛋白体中分离出来，从而使后者进入宿主细胞核开始复制。目前临床可得的抗流感药物金刚烷胺（amantadine）和金刚乙胺（rimantadine）即属于M2蛋白抑制剂，但该类药物阻断M2蛋白离子通道的作用机制仅与甲型流感病毒相关，对由乙型流感病毒引起的流感无效，而且耐药病毒株的很快出现和比较严重的中枢神经系统副作用，均使这类药物的临床使用受到很大影响。 神经氨酸酶（neuraminidase, NA） 神经氨酸酶（NA，EC 3.2.1.18）即唾液酸酶（sialidase），是存在于流感病毒A和B表面的糖蛋白，在病毒的复制过程中起关键酶的作用。在每一个流感病毒体上存在约100个呈蘑菇状的NA分子，该酶在许多其他病毒、细菌体和哺乳动物细胞中也广泛存在。电镜显示NA包括一个方盒状的头部和一个细长的柄，而HA则是一个三角棒状分子。 （一）流感病毒NA的结构 甲型（H2N2）流感病毒颗粒经链霉蛋白酶处理，可释放出可溶性的小分子量NA（其四聚体的为240kD）。1978年，用同样的处理 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，从重组的含有N2亚型的流感病毒中得到了NA的“头部”。这个200-kDa的蛋白质含有4条完全相同的糖基化多肽，其组成部分具有膜结合NA所有的抗原性及酶学性质[59]。由此获得了NA的晶体及其X-射线衍射数据[60]。 Fig 2. Three-dimensional structure of an N9 neuraminidase tetramer, [PDB entry 7NN9]. The colours change from blue (N terminus) to red (C terminus) through green along the amino acid sequence.(Reference [5]) 1983年，Varghese等通过X-ray结晶学研究以2.9?的分辨率首先确定了流感病毒NA N2亚型的三维结构，这是结晶学上的一个创举。其结构显示各单体均是由6个4股反平行的β-折叠片状结构组成（Fig 2），并以类似螺旋桨叶片的形式排列、以单体的中心为轴线均匀分布。各折叠片段呈特征性排列，其中央的也是第一股平行于所谓“螺旋桨”的轴线，而最外面一股几乎垂直于轴线。前一折叠片段的最外面一股接着与下一折叠片段的中央一股相连。病毒膜表面的这些环状连接含有许多抗原学及酶学上的重要氨基酸[11]。在所有的甲型和乙型流感病毒中，NA 的活性位点都位于每一个糖蛋白亚单位表面的口袋中。 自此N9[61]、N8、N6及乙型流感病毒[62] NA的结构先后被测定。N2、N9、N6、N8亚型结晶具有进行衍射测定的品质。相反，N1, N3、N5亚型虽也被结晶但并不适于结构解析[63]。对N4、N7亚型结晶的尝试并未获得成功。 （二）NA的底物及活性位点 通过对四种来自甲型流感病毒亚型及两种来自乙型流感病毒的酶进行结构研究，发现了一相当保守的结构。尽管相比于N2亚型，它们的氨基酸序列同一性低至40%，在乙型流感病毒NA中甚至低至25%。换句话说，它们具有与N2亚型NA相似的整体拓扑学结构。 其四倍体对称结构是通过金属离子及面向内部的糖基侧链来稳定的，而糖基侧链藏于内部可免受免疫学影响。两个钙离子结合位点，一个位于结合口袋附近，另一个位于四聚体轴线上。推测看来，新生病毒颗粒从宿主细胞表面释放时，流感病毒NA的钙离子活化作用可能在其酶活性的正性调节上发挥着重要的生理学作用。 NA的活性位点高度保守，并存在一个催化中心。唾液酸（Sialic acid, SA, N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac, Fig 3a）本身是相对活性较弱（其Ki约为10-3M）的NA抑制剂。1969年，Meindl等报道了唾液酸的衍生物Neu5Ac2en（2-deoxy-2,3-dehydro-N- acetyl-neuraminic acid, Fig 3b），与NA的结合能力（其Ki约为10-6M）比唾液酸高约1000倍，并被认为是酶催化裂解唾液酸的过渡态类似物。 Fig 3. Chemical structure of (a) N-acetyl neuraminic acid; (b) 2-deoxy-2,3- dehydro-N-acetyl neuraminic acid. 催化活性位点是通过解析底物唾液酸与NA复合物的晶体结构得到的。包围唾液酸结合位点的口袋周围环绕着12条环形链，其中6条连接第四股与下一折叠片段的第一股（L01），另6条连接第二股与第三股(L23)。在活性口袋及其周围有大量带电的氨基酸残基，这些带电残基在迄今已知的甲型及乙型流感病毒NA序列中均高度保守。它们是Arg 118, Glu 119 (on β1L01), Asp 151, Arg 152 (β1L23), Asp 198 (β2L23), Arg 224, Glu 227 (β3L01), Asp 243 (β3L23), His 274, Glu 277 (β4L01), Arg 292 (β1L23), Asp 330, Lys 350 (β5L01), and Glu 425 (β6S2)。如图所示，酸性氨基酸▲Glu119, Asp 151, Asp 198, Glu 227, Asp 243, Glu 276, Glu 277, Asp 330, Glu 425; 碱性氨基酸▼Arg 118, Arg 152, Arg 224, His 274, Arg 292, Lys350; 中性氨基酸◆Tyr 121, Leu 134, Trp 178。靠近唾液酸结合位点的其他残基包括三个疏水性残基，Tyr 121 (Phe in N1 and B strains), Trp 178 and Leu 134。 Fig 4. Ribbon diagram of a monomer of N2 influenza NA showing the active site residues which are conserved across all influenza strains (Reference [11] ). （三）流感病毒NA的功能 结构决定功能。简而言之，NA是甲型和乙型流感病毒侵染、复制、成熟和释放等过程中的关键酶，其作用至关重要： 首先，NA催化裂解并切断末端唾液酸残基与邻近寡乳糖之间的α(2-6)或α(2-3)酮苷键。此键的断裂对促进流感病毒在呼吸道的内传播发挥着重要作用： 1、实现病毒通过黏液的转运并破坏宿主细胞上的HA受体，从而促使子代病毒颗粒从被感染的宿主细胞中释放出来。 2、移去新生HA和NA糖基表面的唾液酸，对防止子代病毒从宿主细胞释放后的自我聚集非常必要。 3、通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸可防止病毒失活，并尽可能地促使病毒穿入呼吸道上皮细胞。 其次，某些毒株HA糖基的改变可能增强流感病毒的毒力，NA对此也有贡献。它通过催化裂解以非共价形式与成熟或活性分子相结合的潜在相关肽上的唾液酸残基，可直接激活潜在的转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF-β）。这些活化的细胞因子水平的增加，会诱导细胞凋亡，可认为是流感病毒NA导致病原性的机制之一。最近NA的纤溶酶原结合活性可决定甲型流感病毒病原性的新机制已被阐明。在小鼠身上研究发现，A/WSN/33 (WSN)毒株的NA结合并分离细胞表面的纤溶酶原，从而导致HA催化裂解的增强。而蛋白酶对HA的催化裂解是甲型流感病毒具有传染性的必要条件。 第三，NA可促进巨噬细胞中炎症前细胞因子如白介素-1（interleukin-1, IL-1）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）的产生。这些细胞因子可导致炎症细胞的聚集，活化并促进炎症介质的释放，直接刺激发热中枢进而引起全身发热，从而引发流感症状及呼吸道炎症。