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双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展.doc

双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展

蔷薇艳盼
2017-09-18 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展doc》,可适用于生产运营领域

双水相萃取技术在生物活性物质分离提纯中的研究进展摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文将简要综述双水相萃取技术的基本原理、在分离提纯生物物质中的应用情况以及今后的发展方向。关键词:双水相萃取生物活性物质分离提纯SeparationandPurificationofBioactiveSubstancesinAqueousTwophaseExtractioninProgressName:ChenZhibinStudentID:Professional:BiologicalChemicalClass:classesAqueousTwophaseExtractiontechnologyhasreceivedincreasingAbstract:attentionasanewseparationtechnology,whichiscomparedwiththetraditionalextractionmethodshasuniqueadvantagesThisarticlewillbrieflysummarizetwophaseextractiontechnologythroughthebasicprincipleofseparationpurificationofbiologicalsubstancesintheapplicationandfuturedevelopmentdirectionaqueoustwophaseextractionbiologicallyactivesubstancesKeywords:separationandpurification随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开各种生化新产品不断涌现但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的对分离条件以及环境要求极其苛刻使得传统的液液萃取已不能适应分离要求因此一种新型的液液分离技术双水相萃取技术双水相萃取应运而生。双水相萃取(AqueousTwoPhaseExtractionATPE)技术是为适应生物工程的迅猛发展于六十年代首先由瑞典的P(A(Albertson等提出的。近年双水相萃取技术因设备投资少操作简单引起了人们极大的重视并且被广泛用于生物化学细胞生物学和生物化工等领域涉及到细胞、膜、病毒、蛋白质、核酸以及其他天然药物有效成分的分离及提纯。由于它具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温和且不存在有机溶剂残留的问题等优点所以在生物活性成分及天然产物有效成分的提取分离方面有良好的应用前景。双水相萃取相关理论的发展早在年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉),这种现象被称为聚合物的不相溶性从而产生了双水相体系(AqueoustwophasesystemATPS)。年由Albertson首先利用两水相技术分离生物分子他主要研究了聚乙二醇(PEG)葡聚糖(Dex)系统和PEG(NH)SO系统在分离提纯中的应用。在随后的几十年中这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中主要提出了两类模型Edmond等人提出的渗透维里模型即Edmondbgston方程Flory和Huggins根据热力学的基本原理提出FloryHuggins晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度后者在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据。自世纪年代中期以来各国学者开展了进一步的研究工作各类用于计算生物物质在双水相系统分配系数的模型也时有报道,诸如Baskir晶体吸附模型、Hayne模型、Pitzer模型、Grossman自由体积模型等,但结果均难以令人满意。年,Diamond等以FloryHuggins理论为基础,用把相间电势表达为上下相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法,提出了能对肽和蛋白质在聚合物聚合物水体系的分配系数很好关联的DiamondHsu模型。此后,针对用该模型计算蛋白质在聚合物盐两水相系统中的分配系数时精确度不高的缺点,Diamond等提出了改进的DimondHsu模型进一步提高了DiamondHsu模型的精确度和普适性。Pessoa等通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肽、蛋白质的水化壳进行描述的因子得到了FloryHuggi改进模型此模型很好地模拟了种由PEGDex组成的双水相体系的相平衡和分配系数。虽然双水相萃取技术在应用方面取得了很大进展但目前这些工作几乎都只是建立在实验数据的基础上至今还没有一套比较完善的理论来解释物质在体系中的分配机理。双水相萃取技术基本原理双水相的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时当聚合物浓度达到一定值体系会自然地分成互不相溶的两相。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性即高聚物分子的空间阻碍作用相互无法渗透不能形成均一相从而具有分离倾向在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离且憎水程度相差越大相分离倾向也就越大。与一般的水)有机溶剂体系相比较双水相体系两相的性质差别(如密度和折射率等)较小。由于折射率的差别甚小有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小仅为~Nm(一般体系为~Nm)。界面与试管壁形成的接触角几乎是直角。原则上无论是天然的还是合成的亲水性聚合物绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相构成双水相体系部分双水相系统列于表。用于生物分离的高聚物体系有:聚乙二醇(简称PEG)葡聚糖(简称Dexteran)和PEGDextran硫酸盐体系。常见的高聚物无机盐体系为:PEG硫酸性或磷酸盐体系。表各种双水相系统聚合物聚合物或盐聚合物聚合物或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯醇聚乙二醇聚乙烯吡咯聚乙烯醇烷酮聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖羟丙基葡聚糖聚蔗糖葡聚糖乙基羟乙基纤维系葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚丙二醇硫酸钾聚乙二醇硫酸镁聚乙二醇硫酸铵聚乙烯吡咯烷酮硫酸钠甲氧基聚乙二醇甲酸钠酒石酸甲钠甲基纤维素甲基纤维素葡聚糖聚乙烯醇或葡聚糖羟丙基葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮羟丙基葡聚糖萃取原理双水相萃取与水有机相萃取的原理相似都是依据物质在两相间的选择性分配但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质只要选择合适的双水相体系控制一定的条件就可以得到合适的分配系数从而达到分离纯化之目的。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示:K=CC上下其中K为分配系数C和C分别为被分离物质在上、下相的浓度。上下分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律即“在一定温度一定压强下如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里达到平衡后该物质在两相中浓度比等于常数”分离效果由分配系数来表征。双水相萃取的应用双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域并取得了许多成功的范例主要是分离蛋白质酶病毒脊髓病毒和线病毒的纯化核酸DNA的分离干扰素细胞组织抗生素多糖色素抗体等。下面就生物活性物质的应用进行阐述。在发酵工程中的应用由于发酵液中成分比较复杂目标产物含量低而传统的分离纯化方法步骤繁琐导致产品回收率低成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相休系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究并取得了一些成绩。Pan等利用PEGNaHPO体系从Trichodermakoningii发酵液中分离纯化木糖苷酶该酶主要分配在下相下相酶活回收率纯化倍数。Maria等利用PEGNaHPO体系从Fusariumsolanipisi发酵液中分离纯化角质酶该酶主要分配在上相酶活回收率纯化倍数。Mirjana利用PEGDex体系从Polyporussquamosus发酵液中分离果胶酶该酶主要分配在上相酶活回收率纯化倍数。Martinha利用PEG(NH)SO体系从Kluyveromycesmarxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶该酶主要分配在上相酶活回收率纯化倍数。冯菁等采用质量分数的PEG、质量分数为的NaSO和质量分数为NaCl组成的双水相直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶双水相萃取率达到纯化因子为。黄瑛等采用质量分数的PEG、的磷酸盐和的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G发酵粗酶液中提取脂肪酶当系统的pH为时分配系数纯化因子脂肪酶的回收率达到。在药物方面的应用薛珺等采用PEG与吐温组合表面活性剂、硫酸铵、水形成双水相体系萃取芦丁芦丁在该双水相体系的平均萃取率为。谢涛等利用PEGKHPO组成的双水相体系从三七中萃取三七皂苷三七总皂苷的分配系数为回收率为赵爱丽等利用质KHPO组成的双水相体系分离纯化黄苓苷黄苓苷的分配系数达到收率达到。石慧等利用质量分数PEG、质量分数为(NH)SO和质量分数为NaCl组成的双水相体系从加杨叶萃取液中萃取加杨叶总黄酮萃取率达到以上。朱自强等用质量分数的PEG与质量分数为的(NH)SO组成的双水相系统直接处理青霉素G发酵液分配系数高达浓缩倍数为回收率为。在生物工程中的应用双水相技术作为一种生化分离技术由于其条件温和易操作可调节因素多并可借助传统溶剂萃取的成功经验而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。Babu等用质量分数的PEG与质量分数为的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶菠萝蛋白的纯化倍数为酶活回收率达到下相多酚氧化酶的纯化倍数为酶活回收率达到。Chethana等用PEG与(NH)SO组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素质量分数为~甜菜色素被萃取到上相质量分数为以上的糖类被萃取到下相。Harve和Bajpai利用PEGDex双水相系统分离纯化了假单胞杆菌胞内的立体专一性酒石酸脱氢酶。双水相技术的发展趋势廉价新型双水相系统的开发目前双水相萃取技术走向工业化所需解决的最大问题是构成双水相成相系统组分的价格十分昂贵。为了解决这个问题国内外进行了大量的研究一方面用廉价的无机盐代替以往常用的昂贵的葡聚糖。硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐与PEG形成的双水相系统现已经大量用于萃取操作另一方面开发可替代聚乙二醇和葡聚糖的高聚物。变性淀粉PPT、阿拉伯树胶、Pulluan的微生物多糖、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟基纤维素等替代PEG均取得阶段性的成果。此外有利用临界胶束浓度下表面活性剂的特异自组织行为及良好的稳定性形成的ATPS此类ATPS分相依据的是胶束的形成包括由非离子型表面活性剂组成的ATPS和由离子型表面活性剂组成的ATPS。这些由表面活性剂组成的ATPS与传统ATPS相比有含水量更高两相更容易分离表面活性剂用量很少且可循环利用等独特的优点。亲和双水相萃取技术亲和吸附具有专一性强分离效率高等特点。利用其特点将亲和吸附与双水相萃取技术相结合即对成相聚合物进行化学修饰。该体系不仅具有萃取系统处理量大、放大简单等优点而且具有亲和吸附专一性强、分离效率高的特点。生物转化与双水相萃取技术相结合在生物转化过程中随着转化的产物量的增加常会抑制生化过程的进行。因此及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。将双水相系统与生物转化相结合形成双水相生物转化解决了生物转化过程中存在的产物抑制以及生物催化剂回收利用两方面的问题为生物转化赋予了新的内涵。双水相萃取与膜分离相结合利用中空纤维膜传质面积大的特点将膜分离与双水相萃取相结合可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相体系隔开可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面的吸附问题。因此将膜分离同双水相萃取技术相结合是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有利手段。双水相萃取与细胞破碎过程相结合利用高速珠磨机为设备将细胞破碎和双水相萃取同时在珠磨机内进行。由于珠磨机内有良好的混合条件PEG、无机盐和水得到充分混合形成均匀的双水相分散体系。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相细胞碎片分配在下相胞内产物分配在上相。这种方法不仅节省了萃取设备和时间而且由于双水相对很多蛋白质具有保持活性的特点可以避免胞内产物的损失。此外国内外又相继开展了微重力双水相萃取、高速逆流双水相分配、双水相电萃取、温度诱导相分离双水相萃取等新技术的研究。双水相萃取技术的局限和未来展望目前双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯并显示出众多其它分离技术不具备的优点是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是要将这一技术开发应用到大规模生产过程还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。主要表现在如下几个方面。()聚合物聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵对于一般的生物产品分离成本过高从经济上是不合理的。()虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数但目标产物与成相物质的分离比较困难。()双水相体系界面张力较小虽有利于提高传质效率但是较小的界面张力会易导致乳化现象的产生使相分离时间延长分离效率降低。()双水相体系中组分间的作用非常复杂目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。()缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究在体系流体力学相际间的传质传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法研究的结果只是建立在实验的基础上大部分情况下不能外延缺乏对过程规律的认识。()对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液还没有找到一条科学合理的利用及处理途径大量含盐或含成相组分的废水溶液难于回收及处理。虽然双水相萃取技术研究中还存在很多问题但随着对双水相体系研究的不断深入性能优良的新型成相物质不断发现以及相关技术的不断发展这些方面的问题将会逐步获得解决。随着双水相萃取技术的不断完善,双水相萃取技术将成为一种生物活性物质分离提纯的重要技术方法。参考文献林强霍清(双水相体系萃取甘草酸盐的研究J(中草药():(HattiKRAqueoustwophasesystems:AgeneraloverviewJ(MolecularBiotechnol():(FuruyaT,IwaiY,TanakaY,etalMeasurementandcorrelationofpartitioncoefficientsofhydrolyticenzyimesfordextranpoly(ethyleneglycol)wateraqeueoustwoPhasesystemsatJFluidPHaseEquilbria,,:~FloryPJPrinciplesofpolymerchemistryMNewYork:ComellPress,PengQH,LiZC,LiYGExperimentscorrelationandpredictionofproteinpartitioncoefficientinaqueoustwophasesystemscontainingPEGandKHPOKHPOJFluidPhaseEquilibria,,:~PitzerKSThermodynamicsofelectrolytesITheoreticalbasisandgeneralequationsequationsJPHysChem,,:~DoamondAD,HsuJTFundamentalstudiesofbiomoleculepartitioninaqueoustwophasesystemJBiotechnologyandBioengineering,,:~PessoaFPA,MohamedRSAsalvationbasedthermodynamicmodelforaqueoustwophasesystemsJBrazJChemEng,,():~徐长波,王巍杰双水相萃取技术研究进展J化工科技,,():~PanIH,YaoHJ,LiYKEffectiveexractionandpurificationofxylosidasefromtrichodermakoningiifermentationculturebyaqueoustwophasepartitioningJEnzymeandMicrobialTechnology,():~MariaImprovedpurificationprotocolofafusariumsolanipisirecombinantcutinasebyphasepartitionninginaqueoustwophasesystemsofpolyethyleneglycolandphosphateJEnzymeandMicrobialTechnology,,():~MirjanaGAPartitioningofpectinaseproducedbyPoiyporussquamosusinaqueoustwoPhasesystempolyethyleeglycolcrudedextranatdifferentinitialpHvalulesJCarbohydratePolymers,,():~WuYT,PereiraM,VenancioASeparationofendopolyglacturollaseusingaqueoustwophasepartitioningJJounralofChromatograPHyA,,():~冯菁,夏杰,等人溶菌酶的双水相萃取法分离J华东理工大学学报(自然科学版),,():~黄瑛,尹利,闫云君双水相萃取法分离纯化洋葱假单细胞菌G脂肪酸J现代化工,,():~薛珺,李蕾,练萍PEGTween硫酸铵双水相萃取紫外分光光度法测定银杏叶中的芦丁J化学分析计量,,():~谢涛,廖安平,等双水相萃取三七中三七皂苷的研究J中药材,,():~赵爱丽,陈晓青,姜新宇应用双水相萃取法分离黄苓苷的研究J中成药,,():~石慧,陈媛梅PEG(NH)SO双水相体系在加杨叶总黄酮萃取分离中的应用J现代生物医学进展,,():~朱自强,关怡新,李勉双水相系统在抗生素提取和合成中的应用J化工学报,,():~BabuBR,RastogiNK,RaghavaraoKSMSLiquidliquidextractionofbromelainandpolypHenoloxidaseusingaqueoustwophasesystemJChemicalEngineeringandProcessing,,:~ChethanaS,NayakCA,etalAqueoustwophaseextractionforpurificationandconcentrationofbetalainsJJournalofFoodEngineering,,:~HarveR,BajpaiRKProductionandpurificationoftarrtatedehydrogenase:RoleofaqueoustwophaseextracitonJAppliedBiochemistryandBiotechnology,,:~董军芳,林金清双水相萃取技术在分离提纯生物物质中的应用J,:~王雯娟双水相萃取菠萝蛋白酶的研究D广西:广西大学化学化工学院,,(~):~

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