薄层色谱法

l定义：薄层色谱法，或称薄层层析(thin—layerchromatography），系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀的薄层；将供试品与相应的对照物点于薄层板的一端，在展开容器内用适宜的溶剂（展开剂）展开，使供试品中所含成分分离，采用适合的显色剂或显色方法显色，将供试品色谱与对照物色谱比较，或采用薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查，或含量测定的方法。l特点:高效、快捷、方便、直观、经济。l分型：ü薄层吸附层析（吸附剂）ü薄层分层层析（纤维素）ü薄层离子交换层析（离子交换剂）ü薄层凝胶层析（分子筛凝胶）Ø一般中药分析中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析Ø薄层吸附层析法：它是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（展开剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。三、仪器和器材薄层板点样器展开缸显色装置检视装置扫描仪薄层板1、吸附材料不同分为：硅胶板薄层板、聚酰胺薄层板硅胶薄层板是目前应用最广泛的薄层板，最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF2542、薄层板涂布的背材不同分为：玻璃板、铝箔板、聚酰胺薄膜板3、吸附材料的粒径分为：普通板与高效板高效薄层板（HPTCL）所使用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。传统薄层板与高效薄层板的比较TCLHPTCL平均粒度（um）10-405-10颗粒分布（um）宽窄点样量（ul）大小展距(cm)10-155-8分离时间(min)30-2003-20检测限：可见光（ng）100-100010-100荧光（ng）1-1000.1-10薄层厚度（mm）0.2-0.30.1-0.24、按来源分为：Ø市售薄层板青岛海洋化工（玻璃）天津斯利达（铝箔）进口薄层板（Merck等）Ø不同品牌的薄层板，所用的硅胶粒度、粘合剂不同，薄层行为和薄层色谱效果存在差异，因此实验时必须明确品牌。Ø自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm。(自制薄层板由于操作粗放，硅胶质量不高和手工操作个体差异大致使色谱质量不高，分离度、重现性均难以达到满意效果，所以一般只针对需特别处理和化学改性的薄层板。)l点样器:一般采用微升毛细管（定量点样毛细管：0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等）、微升注射器或半自动、全自动点样器材，手动点样时建议采用微量毛细管。l展开缸应用适合薄层板大小的薄层色谱专用展开缸（箱），展开缸有水平式和直立式两种类型。日常用的最多的是直立式展开缸。它又分平底展开缸或双槽展开缸。双槽展开缸具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开缸内相对湿度等有点，故此常推荐使用。水平展开用专用的水平展开缸。l显色装置薄层色谱法可针对不同的样品采用不同的显色方法和显色剂进行显色，从而可以专门针对某一化合物进行检视，或对紫外光和可见光下无吸收的化合物进行检视。极大的提高了薄层检视的专属性与灵敏性。这是薄层色谱法灵活性的一个集中体现。即同一薄层板可生成可见光、紫外光谱、荧光光谱和荧光淬灭光谱。主要的显色方法有：喷雾显色、浸渍显色与蒸气熏蒸显色。三氯化铝：黄酮类专属显色剂碘化铋钾：生物碱专属显色剂硫酸：许多成分激发荧光的通用试剂Ø喷雾显色应：使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出。Ø浸渍显色：使用浸渍槽也可用适宜的展开缸代用，使用时，将展开的薄层板平稳垂直的放入浸渍槽中一至数秒后取出，擦去薄层扳背面残存的试剂，显色后的图像供分析用（需要时可以加热）。Ø蒸气熏蒸显色：可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替，如碘蒸汽。l检视装置为装有可见光、254nm（荧光萃灭）及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。l薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。四、点样操作l点样前薄层板准备Ø薄层板表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。Ø临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。Ø如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用异丙醇、二氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂（8:2）在展开缸中上行展开预洗，取出，晾干，110℃活化，置干燥器中备用。（注意标记方向）Ø如需对薄层板进行化学改性，可浸入改性剂溶液中数秒，取出，晾干，活化后备用。l点样除另有规定外,在洁净干燥的环境，按规定用微升毛细管分别吸取供试品溶液或对照品溶液，以垂直方向小心接触薄层表面做点状点样或条带状点样(或符合要求手动、半自动、自动点样工具点样，条带状点样最好用专用的半自动、自动点样仪）。操作时要细致小心，注意勿损伤薄层表面，条带状点样要注意条带的均匀；原点尽量减少溶剂扩散现象，特别是点样量较大时要更要注意。《中国药典》2015版一部点样要求TLCHPTLC距底mm10～158～10点间距mm以互不干扰为宜8以互不干扰为宜5点直径mm≤4≤2条带长mm5～104～8展开剂与原点间距mm55展距cm8-155-8以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点样两种Ø接触式点样将吸有样品溶液的毛细管或针头与薄层板表面接触，从而使样品在薄层板上形成圆点状的点。多采用毛细管微量注射器手动点样，有的仪器也可以进行接触式点样。Ø喷雾点样点样针针杆匀速向下推，针头部形成小液滴被喷头喷出的气流垂落在薄层板上，机械推动薄层板匀速摆动，则形成均匀的条状原点。必须采用仪器进行。喷雾点样的优点：1、点样过程中，点样器不与薄层板接触，防止薄层板物理损伤；2样品密集，有利于展开后检视；3、减少样品扩散，样品斑点窄，展开后分离度提高；4、自动化程度高，样品溶液不易在针壁上残留。五、展开将点样后的薄层板放入加有展开剂的展缸中，密闭，展开，薄层板浸入展开剂的深度一般要求溶剂的液面距原点约5mm，密闭展开，展开至规定规定的展距后，立即取出薄层板，晾干，以备检测。多数品种展距为7～9cm,必要时可用长度为15或20cm的板，展距可适当延长至12～14cm。高效薄层板上展开5～8cm。Ø薄层板展开方式主要有：上行展开、下行展开、水平展开和环形展开，必要时也可进行二次展开或双向展开。Ø展开前如需溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，保持15～30分钟，待溶剂蒸气平衡后，应迅速放入点有样品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。Ø展开用的溶剂需要使用分析纯并要求临用前配制，不可多次反复使用。展开剂如需分层，则放置分层后按要求分取上层或下层，备用。六、显色与检测色谱斑点本身有颜色者，可直接在日光下观察可见光谱；斑点在紫外光激发下可以发射荧光者，可直接在365nm紫外灯下观察荧光色谱；对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。需要加试剂方能显色或发射荧光者，需要将试剂均匀喷洒于薄层板面，直接观察或加热显色后观察。用浸渍法，具有板面显色均匀的特点，但有的样品经试剂浸渍后，斑点容易被浸润而扩散或拖尾。加热显色需注意加热时间和温度，如含羟甲基纤维素钠的手工自制薄层板代替预制板，注意加热温度过高或加热时间过长，容易引起板面焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果，需要特别注意。有的成分加试剂（如挥发油或甾醇类经香草醛硫酸、硫酸醋酐等）显色后，加热温度高低和时间长短不同或放置时间不同，斑点的显色可能随时间而有所改变。有的品种可以熏以试剂或试液的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）显色。七、记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。（在紫外光下拍摄时，应使用适宜的滤光片滤除紫外光。）八、系统适用性试验按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度、重复性和比移值要求。Ø检测灵敏度用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。Ø分离度用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：R=2（d2-d1）/(W1+W2)式中：d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.0。Ø重复性同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0%。Ø比移值系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。计算：比移值(Rf)=从基线至展开斑点中心的距离/从基线至展开剂前沿的距离鉴别时可用供试品的主板点与对照品溶液主板点的比移值进行比较，或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置，除另有规定外，比移值（Rf）应在0.2-0.8之间（含量测定时比移值（Rf）应在0.3-0.7之间）。九、测定法Ø鉴别取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。Ø限度检查采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定检查的斑点数和限量值。Ø含量测定照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。十、影响因素1、样品预处理与供试品溶液的制备由于中药的成分复杂，未知成分多，供试品溶液中溶出的物质较多，其中既有待测成分也有“其它杂质”，常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认。所以许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试品溶液得到净化，往往是一个主要的甚至是关键的步骤。Ø供试品溶液提取净化常用方法：单一溶剂提取法、分段提取法、液-液萃取法、固-液萃取法等2、薄层色谱点样技术点样是薄层色谱分析的第一步，也是非常关键的一步。它既关系到能否得到可以重现的良好分离度的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确度，因而不良的点样是最主要的误差来源。Ø点样容积（原点直径）：薄层板的原点位置对样品的负荷量是极为有限的，如果点样量过大将明显降低分离效率。Ø点样环形色谱效应：如果样品在溶剂中的溶解度过大，点样原点将变成空心圈，会对随后的线性展开造成极不利的影响。Ø供试品溶液溶剂残留：若供试品溶液溶剂残留，会改变展开的选择性，特别是供试品溶液的溶剂极性与展开的溶剂极性相差较大时更为明显；再者，亲水溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特别是高湿环境）对色谱质量的影响也不可低估。Ø薄层表面的的机械损伤：点样对薄层表面的的机械损伤，对色谱质量尤其是定量分析将带来灾难性的影响。Ø点样时间：在薄层点样时，点样时间不宜太长，要求控制在10min以内；Ø相对湿度：在薄层点样时，要求在洁净干燥的环境内点样，一般要求相对湿度控制在65%以下。3、吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响Ø吸附剂的活性：吸附剂的活性是由表面能与表面积决定的，表面能越大吸附力越大，即活性越高，反之吸附力越小，活性越低。如硅胶之所以有活性，是由于表面含有众多的硅醇基，硅醇基的活泼羟基和游离羟基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键所致。而硅醇基是亲水基团，很容易吸附水而形成水和硅醇基从而失去活性。所以硅胶板在使用前常常需要在105℃-110℃活化30min。Ø相对湿度：a、由于硅胶表面吸附水分的作用是可逆的，活化后的薄层板可以吸附大气中的水分而降低活性，在不同的相对湿度下可以达到不同的吸附平衡，在相对湿度改变的情况下会重新达到新的吸附平衡。b、有些样品所选的展开剂对相对湿度有较宽的适应能力，即对相对湿度的要求不甚严格，大致相对湿度在30%～70%下可以得到相对稳定的色谱；但另外有些样品所选的展开剂对相对湿度要求非常严格，只有在相对湿度恰好合适的情况下才能把试验做好，因此，此类试验应在相对湿度控的条件下展开为宜。c、相对湿度的控制：可在双槽展缸的一侧或预先准备好的控制箱中加入一定量适当浓度的硫酸，将薄层板放在另一侧15～30min；然后在另一侧倒入展开剂展开。表：控制不同相对湿度所需浓硫酸溶液相对湿度所需硫酸浓度（v/v）硫酸（ml）水（ml）18%10095.532%6810042%5710047%5010058%39.510065%3410072%27.510088%10.81004、溶剂蒸气的饱和度吸附剂表面的空间是很有限的，当多种溶剂展开时，不同溶剂分子在吸附区相互竞争，发生“取代效应”，尤其在薄层板的下部更为严重。由于这种影响极为复杂，若不加以控制很难得到稳定的色谱。Ø溶剂预饱和是减少边缘效应最有效方法。5、色谱的优化及溶剂系统（展开剂）的选择固定相的极性（正相或反相），展开剂的种类（溶剂的极性和选择性）、极性大小或酸碱性，以及展开方式都会对色谱造成较大的影响。展开剂配置Ø展开用的溶剂需要使用分析纯并要求临用前配制，不可多次反复使用。展开剂如需分层，则放置分层后按要求分取上层或下层，备用。（溶剂所含杂质、水分、或吸收空气中干扰气体均会影响分离效果，如甲酸乙酯遇水水解、多次开瓶残存溶剂吸收了大气中的水分等）Ø取液体积<1ml，使用微量移液器；1ml≤以液体积≤20ml，使用移液管；取液体积>20ml，使用量筒；为减少误差，可以一次性准备足够一天使用的展开剂的量；保存于具塞容器中，确保混合均匀。6、温度对薄层色谱的影响首先，温度的变化会影响展开剂各有机溶剂因沸点、蒸汽压、蒸发数目、相对密度等不同而蒸发程度各异，因而造成展开缸内各有机溶剂蒸气的比例发生变化，最终影响到带分离物质的色谱行为。其次，由于温度的变化，含水两相展开剂在放置分层过程中或展开时有机相中水的比例不同，从而改变了展开剂的极性，影响到色谱的分离。另外，温度的变化还会对Rf造成影响。一般温度越高Rf值越大7、薄层板对薄层色谱的影响由于不同厂家生产的薄层板所用的硅胶的粒度、性质以及黏合剂均有所不同，其色谱行为和重现性也存在一定差异。十一、常见问题1、薄层色谱背景干扰大原因：样品前处理除杂不够。2、Rf值过大或过小（Rf一般在0.2～0.8，定量测定在0.3～0.7之间）原因：展开剂的极性过大或过小。3、多前缘效应原因：由于展开剂中溶剂沸点不一致，展开时蒸发的速率不一致（特别是含甲酸、冰醋酸），展开后薄层板上会出现双前缘或多前缘。（解决办法：控制展开时温度，不宜过高或过低，建议在室温下进行。）4、边缘效应（边缘效应是指样品在展开时，薄层板两边的斑点比中间的斑点移动快，并向两边偏斜）原因：混合展开剂展开过程中，其极性较弱和沸点较低的溶剂在薄层板两边沿处较易挥发，使薄层板上展开剂的比例不一致，极性发生变化，重现边缘效应（多发生在三氯甲烷-甲醇系统）。（解决办法：增加展开缸内溶剂蒸气浓度，可在展缸内壁贴上浸润展开剂的滤纸；选择公沸试剂代替一般混合试剂。）5、拖尾现象（最常见）原因：点样过量，薄层板超载；重复点样圆心未重合；薄层板、展开剂选择不合理。十二、注意事项1、薄层板的活化与保存自制薄层板和商品薄层板在使用前均应进行活化，活化后的薄层板应立即放置于有干燥剂的干燥器中保存。保存时间不宜过长，最好随用随制，放入干燥箱中保存近作为使用前的一种过渡。2、供试液的制备溶剂选择是否适当影响点样原点及分离后斑点的形状，一般应选择极性小的溶剂；只有在供试品极性较大，薄层板活性较大时，才选择极性较大的溶剂。除特殊情况外，试液的浓度药适宜，最好控制在使用点样量不超过10ul(高效薄层板不超过5ul)。3、点样薄层板上供试品溶剂的负荷量极为有限，普通薄层板的点样量最好在10ul以下，高效薄层板在5ul以下。点样量过多可造成“超载,展开剂产生绕行现象,使斑点拖尾.点样速度要快,在空气中点样以不超过10min为宜，以减少薄层板与大气的平衡时间，点样时必须注意勿损坏薄层板表面。待溶剂挥发后方可展开。4、点样环境实验环境的相对湿度和温度对薄层分离效果有着较大的影响（实验室一般要求相对湿度在65%以下为宜），因此应保持试验环境的相对恒定。对温、湿度敏感的品种必须按品种项下的规定，严格控制实验环境的温、湿度。5、点样时几个样点要在一条直线上，大小要合适(斑点直径一般不超过4mm)，间距8mm。6、点样用的毛细管不能交叉使用。7、因溶液太稀，一次点样如果不够需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。8、点样要轻，不可刺破薄层；点样结束待样点干燥后，方可进行展开。放板时手要平稳，否则走出斜线。