实验凝胶层析分离蛋白质
实验三 凝胶层析分离蛋白质 原理:
凝胶柱层析是一种分子筛层析，它利用凝胶颗粒对混合物样品的分子筛效应，可将混合物样品中分子大小不同的组分进行分离。
当在葡聚糖凝胶(Sephadex-50)柱内加入血红蛋白(分子量:64500)与二硝基氟苯(DNFP)-鱼精蛋白(分子量:2000~12000)混合物样品，以蒸馏水为洗脱剂洗脱时，血红蛋白分子量大，分子直径大于颗粒网孔，只能在胶粒空隙间流动，所受胶粒的阻力小，流速快，首先被洗脱下来，而DNFP-鱼精蛋白分子量小，分子直径小于胶粒网孔，在胶粒内外流动，受到阻力大，被后洗脱下来。经洗脱后，从区带的颜色可观察凝胶柱的层析分离作用。 器材与试剂:
层析柱、葡聚糖凝胶Sephadex-50、蒸馏水、鱼精蛋白、血红蛋白、三角铁架、三角烧杯、滴管、试管、废物杯
操作:
1、装柱:在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时，可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝胶表面应平整，然后用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积，注意不能让凝胶表面露出水面。
2、加样:取Hb和DNP—鱼精蛋白混合液3滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平(不可使床面干掉)，关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，加蒸馏水洗涤，直至两条色带分开。
3、收集，每管收集3ml，观察两种颜色出现的管号。
结果分析:
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