苦参总黄酮体内外抗肿瘤作用实验研究

苦参总黄酮体内外抗肿瘤作用实验研究 苦参总黄酮体内外抗肿瘤作用实验研究 左剑, 段继峰, 韩军, 范士明, 张炜, 朱丽芳, 姚明作者:孙明瑜, 辉【关键词】 苦参; 黄酮类; 抗肿瘤药; 小鼠 Objective: To explore the antitumor activities of kushen (Sophora flavescens) flavonoids (KS-Fs) in vivo and in vitro. Methods: Cell proliferation was assayed by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. H22 hepatocellular carcinoma and S180 sarcoma were induced in ICR mice. Lewis lung carcinoma was induced in C57BL/6 mice. H460 and Eca-109 tumor were induced in Balb/c nude mice by injecting 5×105 or 5×106 tumor cells in the right flank, respectively. Results: KS-Fs could inhibit the growth of a variety of human tumor cell lines (A549, SPC-A-1, NCI-H460, etc.) in vitro. The antitumor efficacies were confirmed in the mice models of H22, S180 and Lewis lung tumors and the nude mice models of human H460 and Eca-109 xenografted tumors. The oral or intravenous maximum tolerated dose of KS-Fs was more than 2.8 g/kg or 750 mg/kg respectively, far more than the oral medial lethal dose of kushen alkaloids (?1.18 g/kg). No adverse reactions were observed. Conclusion: These results suggest that KS-Fs or kurarinone may be developed as a novel antitumor agent. Keywords: Sophora flavescens; flavones; antineoplastic agents; mice 苦参(Sophora flavescens Aiton) 为豆科槐属植物，是中国传统常用中药之一，始载于《神农本草经》， 列为中品，常用于治疗急、慢性炎症和癌症等疾病。苦参主要含有生 物碱和黄酮两大类化学成分,1,。1992年以苦参碱和氧化苦参碱为 主的苦参总碱注射液吗特灵,(92)卫药试字X-10(2)号,已作为 抗肿瘤药批准上市。相对于苦参碱，苦参黄酮的研究较迟。现已从苦 参根中分离出56种黄酮类化合物，其中大部分化合物的A环上存在 异戊烯基侧链,2-14,。研究表明异戊烯基侧链黄酮有抗病原微生物、 抗炎、抗肿瘤(体外)等生物活性,2-14,。 一系列从苦参中分离出 的含异戊烯基侧链的苦参黄酮在体外对一些人肿瘤细胞株有细胞毒活性，例如人白血病HL-60,2,、K562，小鼠白血病L10,10,，人乳腺癌MCF-7,11,，非小细胞肺腺癌A549，卵巢癌SKOV-3,,、1A9,9,，皮肤黑素瘤SK-MEL-2，中枢神经系统肿瘤XF498，肠癌HCT,,，子 10,，鼻咽上皮癌KB，KB-Vin(drug-resistant variant 宫颈癌HeLa, KB)等细胞株,10,。这些黄酮还可以抑制一些酶的活性，例如phospholipase Cγ1,7,，diacylglycerol acyltransferase,9，13,，tyrosinase,5，14,，testosterone 5α-reductase,6,，cGMP phosphodiesterase 5,8,。但苦参黄酮在体内是否有抑制肿瘤作用，目前国内外均没有相关报道。 本研究提取分离苦参总黄酮(kushen flavonoids, KS-Fs)和苦参酮(kurarinone, Kur)，检测KS-Fs和Kur对肿瘤细胞增殖的影响，并比较KS-Fs与市售苦参碱(kushen alkaloids, KS-As)制剂(主要成分为苦参生物碱或氧化苦参碱)的细胞毒作用。考察KS-Fs和Kur对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌及裸小鼠人移植肿瘤非小细胞肺癌H460和食管癌Eca-109的影响。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1 材料 1.1.1 药物 苦参饮片，雷允上医药有限公司，经鉴定为豆科槐属植物苦参的根，苦参碱含量大于2%，符合《中华人民共和国药典》1995年版规定。苦参素(kushenin)，宁夏制药厂;苦参碱注射液，广州明兴制药厂。体外实验:将KS-Fs和Kur用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)配制成20 mg/ml储备液，,20 ?贮存，临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。体内药效实验:将KS-Fs和Kur用5% DMSO和9% Cremophor EL助溶后，加85%蒸馏水配成溶液。急性毒性实验注射配方:用10% DMSO和18% Cremophor EL溶解到最大浓度，加蒸馏水配成终浓度为50 mg/ml溶液。急性毒性实验口服配方:20%聚乙二醇(PEG 400)，18% Cremophor溶解到最大浓度，加蒸馏水配制成混悬液，终浓度为70 mg/ml。注射用环磷酰胺(cytoxan, CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为04061821;注射用顺铂(cisplatin)，齐鲁制药有限公司，批号为040541;临用时用生理盐水稀释。 1.1.2 细胞株 肺癌A549、SPC-A-1、NCI-H460(H460)、H446，人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7，子宫颈癌HeLa，肠癌HCT-116、HT-29、SW-620和CaCo-2细 胞株，均购自美国菌种细胞保藏数据库(American Type Culture Collection, ATCC);白血病HL-60、食管癌Eca-109、胃癌BGC-823和肝癌SMMC-7721细胞株以及小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌细胞，均购自中国科学院细胞生物研究所。 1.1.3 动物 nu/nu裸小鼠，雄性，6,8周龄，18,22 g，上海市肿瘤研Balb/c- 究所，合格证号:2002-0001。雌性ICR、C57BL/6小鼠，20,22 g;昆明鼠，雌雄各半，20,22 g。均购自斯莱克动物中心，合格证号:2003-0003。 1.1.4 试剂 伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium, IMDM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)、1640培养基、胎牛血清和0.05%胰酶-乙二胺四乙酸，来自GIBCO公司;青霉素、链霉素、DMSO、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)和Cremophor EL，为Sigma公司产品。 1.2 方法 1.2.1 KS-Fs和Kur的分离提取 由和记黄埔医药有限公司提取鉴定。将苦参饮片粉碎成粗粉，10倍量95%乙醇渗漉，渗漉液经减压浓缩，加水以石油醚萃取，回收后得到KS-Fs粗提物。乙醇重溶解，过大孔树脂得到KS-Fs，紫外分光光度计检测(ultraviolet rays, UV)方法检测黄酮含量和纯度。KS-Fs经过聚酰胺和硅胶柱联用层析分离提取得到Kur。 5 kg苦参用乙醇渗漉、溶剂萃取得到KS-Fs粗提物6 g，得率为2.52%，黄酮含量超过55%。乙醇重溶解，过大孔树脂得到KS-Fs，UV方法检测黄酮含量，纯度超过80%。KS-Fs经过聚酰胺和硅胶柱联用层析分离提取得到Kur。KS-Fs主要含有Kur，降苦参酮 (norkurarinone, NKur)和二甲氧基苦参酮 (2’-methoxy-kurarinone, MKur)及其他黄酮，其中Kur、NKur和MKur的含量分别是29.5%、4.6%和1.4%。见图1。 图1 KS-Fs的高效液相图谱和主要化合物结构 Figure 1 High-performance liquid chromatograms and chemical structures of compounds in KS-Fs 1.2.2 KS-Fs和Kur在体外对肿瘤细胞株的抑制作用 将(0.5,1)×105个生长至对数生长期的细胞接种于96孔板，细胞在37 ?，5% CO2培养箱中培养24 h后，更换成含不同浓度药物的培养基，其中KS-Fs、Kur和其他待测药物按梯度浓度加入，共设8个浓度，每孔 中药物溶剂(DMSO或水)的体积不超过1%总体积。每个浓度设3个复孔，继续培养48 h，MTT法检测,15,。以溶剂孔为对照，数据用XLfit Wizard软件 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，计算各药物对细胞生长抑制的半数抑制浓度(median inhibitory concentration, IC50)。实验重复3次。 1.2.3 Fs和Kur体内抗肿瘤作用 1.2.3.1 小鼠肿瘤模型的建立 小鼠KS- S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌细胞，采用中国科学院上海细胞研究所推荐的培养基和血清浓度培养在25,75 ml培养瓶中，置于37 ?，5% CO2培养箱中静止培养。 分别收集对数生长期S180和H22细胞，调整细胞数为5×106/ml。ICR小鼠腹腔注射细胞悬液，每只0.2 ml。体内腹水传两代后，无菌条件下抽取生长良好的S180肉瘤或肝癌H22小鼠腹水，用生理盐水稀释至5×106/ml，充分混匀种植于小鼠右前腋下，每只0.2 ml。 收集对数生长期Lewis肺癌细胞，以5×106/ml种植于C57BL/6小鼠右前腋下，每只0.2 ml。动物种植肿瘤细胞后，每天观察小鼠情况，待肿瘤长出后，每隔2,3 d测量肿瘤直径，并估计肿瘤质量。体内传两代后，待Lewis肺癌瘤块长到直径大约1 cm左右时，选取肿瘤生长旺盛，无溃破的肿瘤，在无菌条件下剥离肿瘤，去除坏死部分，剪成约1.5,2.0 mm3大小组织块，皮下接种于6,8周龄健康的雌性C57BL/6小鼠右侧腋下。 1.2.3.2 裸鼠肿瘤模型的建立 收集对数生长期的H460和Eca-109细胞，调整细胞数为5×105/ml或5×106/ml，无菌注射于Balb/c-nu/nu裸鼠右侧背部近腋窝处，每只0.2 ml。裸鼠在 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 无菌环境下饲养，每天观察并测量肿瘤直径，待肿瘤直径大约为1cm左右时，保种传代。肿瘤体积计算公式:V=(W2×L)/2，W代表肿瘤的宽度，L代表肿瘤的长度,16,。在无菌条件下自保种传代的H460或Eca-109裸鼠中剥离肿瘤，剪成约1.5,2.0 mm3大小组织块，分别皮下接种于Balb/c-nu/nu裸鼠右侧腋下，肿瘤块体积大致相等。 1.2.3.3 分组、给药、测量和取材 小鼠接种H22肝癌第2天，将小鼠随机分组，设KS-Fs溶剂对照组，KS-Fs高(500 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(20 mg/kg)剂量组，CTX(30 mg/kg)阳性对照组。小鼠接种S180肉瘤第2天，Lewis肺癌小鼠肿瘤长至150 mm3左右时(接种后第8天)，将小鼠随机分组，设KS-Fs溶剂对照组，KS-Fs高(200 mg/kg)、低 (60 mg/kg)剂量组，CTX(30 mg/kg)阳性对照组。各组小鼠均腹腔注射给药，1次/d，连续7 d，给药体积为10 ml/kg体质量。每天观察小鼠的一般情况，体质量变化，每周测量2次小鼠体质量。小鼠接种S180肉瘤、H22肝癌肿瘤后10 d及接种Lewis肺癌后18 d结束实验。脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤，称瘤质量，计算瘤质量抑瘤率，肿瘤质量抑制率(%)=(对照组平均瘤质量,给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100,17,。