川芎嗪对大鼠缺氧性呼吸抑制的保护作用

川芎嗪对大鼠缺氧性呼吸抑制的保护作用 川芎嗪对大鼠缺氧性呼吸抑制的保护作用 四川大学(医 S 学 ciE 版 dJSichuanUniv(MedScEdi) )2005 536…'_,-'-,.?_''.' ;36(4):533— 川芎嗪对大鼠缺氧性呼吸抑制的保护作用* 李丽,李自成,严亨秀,呼海燕,陈丽,杨文星,郑煜? 1.四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室(成都610041);2.西南民族大学生命科学与技术学院 【摘要】目的探讨川芎嗪(TMP)对缺氧大鼠呼吸中枢的保护作用.方法制备缺氧大鼠模型,观察TMP 对缺氧大鼠的呼吸活动和存活时间的影响,采用尼氏染色和免疫组化方法分另?检测TMP对缺氧大鼠脑干神经元 尼氏体及FOS蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响.结果TMP可显着推迟缺氧性呼吸抑制和动物死亡的发生(尸<O.01);与空气对 照组相比,缺氧后脑干神经元尼氏染色着色变浅,但缺氧加TMP组着色深于单纯缺氧组,其灰度值明显低于单纯 缺氧组(P<O.05);缺氧后FOS蛋白在脑干的阳性表达神经元主要见于孤束核,最后区,舌下神经核,中缝苍白核, 下橄榄核,外侧网状核,面神经核,斜方体核,但缺氧加TMP组的阳性表达强度明显低于单纯缺氧组(P<O.05). 结论TMP对呼吸中枢的缺氧性损害具有保护作用,脑干内FOS蛋白可能参与了这一过程. 【关键词】川芎嗪缺氧呼吸FOS大鼠 【中圈分类号】R338.2 ProtectiveEffectofTetramethylpyrazineontheRespiratoryInhibitionInducedbyHypoxiainRatsLILi,LIZi— cheng.YANHeng—xiu,HUHai—Fan,CHENLi,YANGWen— xing,ZHENGYu.DepartmentofPhysiology,West ChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine.SichuanUniversity,Chengdu610041,China [Abstract]ObjectiveTostudytheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(TMP)ontherespiratory inhibitioninducedbyhypoxia.MethodsForty-fourSDratswereused.Thehypoxicratmodelwasestablished. TheeffectsofTMPontheresponsesofrespiratoryactivityandlifetimetohypoxiawereobserved.TheNissl'S stainingandimmunohistochemicaltechniquewereusedtoinvestigatetheeffectofhypoxiaontheNissl'Sbodiesand FOSexpressioninthebrainstemandtheantagonisticactionofTMP.ResultsIncontrasttothegroupof hypoxia,theoccurrenceofrespiratoryinhibitionwasdelayedandthelifetimewasprolongedobviouslyintherats ofhypoxiaplusTMP(P<O.01).ComparedwiththeairContronlgroup,theintensityoftheNissl'Sstainingofthe brainstemneuronsbecameweakerinthegroupofhypoxia,butinthegroupofhypoxiaplusTMP,theNissl'S stainingwasstrongerandthegraydegreedecreasedobviously,comparedwiththegroupofhypoxia(P<O.05). FOSpositiveneuronswereinducedbyhypoxiaandmainlyexistedinthenucleusofsolitarytract.areapostrema. hypoglossalnucleus,lateralreticularnucleus,inferiorolivarynucleus.nucleusraphepallidus,facialnucleus, trapezoidnucleus,butinthegroupofhypoxiaplusTMP,thelevelofFOSimmunoreactivityde creased remarkably,comparedwiththegroupofhypoxia(P<0.05).ConclusionTMPhasprotectiv eeffectonthe respiratoryinhibitioninducedbyhypoxiaandFOSmaybeinvolvedintheprotection. [Keywords]TetramethylpyrazineHypoxiaRespirationFOSRat 川芎嗪又名四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine, TMP).TMP易通过血脑屏障进人中枢神经系统, 而且,在中枢神经系统以脑干分布最多[1],提示脑干 是TMP重要的靶点.TMP具有扩张血管,增加动 脉血流,抑制血小板聚集和降低血小板活性等作 用L2],因此,目前TMP已被广泛应用于治疗脑缺血 缺氧性疾病.关于TMP对脑干呼吸中枢缺氧性损 害的保护作用的研究尚无文献报道.在本研究中,我 *高等学校博士学科点专项科研基金(批准号20020610040) 和纽约中华医学基金会(CMB,No.82—412)资助 ?Correspondingauthor 们首先观察TMP对缺氧引起的呼吸变化是否具有 保护作用,然后以脑干神经元尼氏体染色情况及 FOS蛋白表达情况为指标,进一步探讨TMP的保 护作用及其机制. 1对象与方法 1.1实验动物 健康成年SD大鼠44只,雌雄不限,体质量为 250"~300g,由四川大学华西实验动物中心提供. I.2主要试剂 TMP注射液购自上海第一生化药业有限公司; 钠石灰购自上海陆都化学试剂厂;FOS抗体,免疫 四川大学(医学版)2005年第36卷第4期 组化染色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公 司;硫堇购自上海标本模型厂. 1.3TMP对大鼠缺氧性呼吸效应保护作用的观察 将20只大鼠随机分为单纯缺氧组(,z一8),缺氧 加TMP组(,z一8),缺氧加生理盐水组(,z一4).动物 经30g/L戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉 后,气管插管,待其恢复30min后放人预先装有钠 石灰,容积为2I的无色透明广口瓶中,盖紧瓶盖, 并涂以凡士林保持密闭,以引起动物缺氧,观察其呼 吸变化.自缺氧前10min开始每5min记录一次呼 吸频率,直至动物出现张口呼吸,然后连续观察其呼 吸活动并记录其死亡时间.缺氧加TMP组的动物, 分别于麻醉前30min和缺氧前30min(手术完成 后)腹腔注射20g/LTMP注射液(80mg/kg),两 次注射间隔约50min;缺氧加生理盐水组动物,除 以等体积生理盐水取代TMP外,其余同缺氧加 TMP组.瓶中粉红色钠石灰颗粒吸收CO.后会变 为灰白色,本实验中,实验结束时钠石灰颗粒未完全 变为灰白色,表明动物呼出的CO.被钠石灰全部吸 收,不会因为CO.分压升高而继发性影响呼吸活 动. 1.4尼氏染色和FOS蛋白表达情况的检测 1.4.1动物模型的制备将24只大鼠随机分为空 气对照组(,z一4),单纯缺氧组(,z一8),缺氧加TMP 组(,l一8)和单纯TMP组(,l一4).动物经30g/L戊 巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,气管插管, 切断双侧颈迷走神经,颈部皮肤缝合,待其恢复30 min后开始观察.对空气对照组动物,向其气管套管 侧管通人流量为1300ml/min的空气;对单纯缺氧 组动物,向其气管套管侧管通人相同流量的低氧气 体(80ml/IO2和920ml/LN2);对缺氧加TMP组 动物,除气管内通人低氧气体外,在麻醉前30min 和缺氧前30min(手术完成后)分别腹腔注射20g/ LTMP注射液(80mg/kg),两次注射间隔时间约 55min;对单纯TMP组动物,除气管内通人相同流 量的空气外,其余同缺氧加TMP组. 1.4.2标本的制备和染色我们的前期研究资料 表明,在本实验条件下,缺氧20min时,动物的呼吸 活动受到明显抑制,因此,在本实验中,我们选择在 给动物通人气体20min时为取材时间.动物经左心 室插管,先后用生理盐水和40g/L多聚甲醛溶液各 250ml灌流固定脑组织;取脑干置于40g/i多聚 甲醛溶液中后固定8h;200g/L蔗糖磷酸缓冲液中 过夜,至脑干下沉;液氮冷冻后,恒温冰冻切片机从 延髓尾端至脑桥头端连续冠状切片,片厚30m,每 6张切片取两张,一套切片按朱晓琴等[3]的方法进 行尼氏染色.另一套切片按王廷华等的方法进行 FOS蛋白(滴度为1:5O)免疫组化染色. 1.4.3染色结果的判定利用图象分析系统 (MISA一1000),测定脑干神经元尼氏染色和FOS免 疫组化染色灰度值.在每例动物所取每张切片的某 个观察神经核团,任意取10个视野测定其灰度值, 此例动物所有切片该核团的平均灰度值即为该例动 物该核团的灰度值.灰度值的大小与神经元内尼氏 体的数量或FOS蛋白的表达强度成反比.利用BI- 2000图象分析系统计数每例动物各FOS阳性神经 核团的阳性细胞.在每例动物每张切片的某个观察 核团,任意取5个不重叠的视野计数其阳性神经元 个数,此例动物所有切片该核团计数的阳性神经元 个数之和即为该例动物该核团的阳性神经元个数. 1.5统计学方法 数据以?s表示,两均数比较采用t检验,P< 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1TMP对大鼠缺氧性呼吸效应及存活时间的影 响 各组动物在缺氧开始阶段呼吸变化很小,但随 着缺氧时间的延长,三组动物的呼吸活动均相继出 现兴奋,抑制和停止的变化过程.如表1所示,三组 动物均在缺氧后第40min开始出现呼吸频率升高 (PdO.O5);但出现呼吸抑制的时间不同,单纯缺氧 组和缺氧加生理盐水组于缺氧后第100min开始出 现呼吸频率减慢(P<0.O5),而缺氧加TMP组于缺 氧后第140min才开始出现呼吸抑制,呼吸频率减 慢(P<0.O5).从开始缺氧到呼吸停止为动物的存 活时间,三组动物的存活时间分别为(107?5.9) min,(148?5.9)min和(110?5.3)min,与单纯缺 氧组和缺氧加生理盐水组相比,缺氧加TMP组动 物呼吸抑制的时间明显推迟(P<0.01),动物存活 时间明显延长(P<0.01);单纯缺氧组与缺氧加生 理盐水组相比无显着差异(P>0.O5). 2.2TMP对缺氧大鼠脑干神经元尼氏体的影响 空气对照组大鼠脑干神经元形态正常,尼氏体 深染,着色均匀.单纯TMP对照组与空气对照组相 比,镜下观察无明显差别,以面神经核为例,两组的 灰度值分别为51.3?6.7和50.9?4.4,无显着差 异(P>0.O5).单纯缺氧组脑干神经元胞体轻度肿 JSiehuanUniv(MedSciEdi)Vol36No42005 TMP对??缺t$(1lmel/mln) EfctofTMPonIhech_n…otPlntyfr卅u,ncy inducedbyhypoxla(qlm~s/mln) 胀,尼氏体浅染,着色不均匀(图1).缺氧加TMP组 脑干神经元胞体未见肿胀.尼氏体浅染,但深于单纯 缺氧组.着色较均匀(图2).单纯缺氧组及缺氧加 TMP组面神经核灰度值分别为747士106和 591?8.0,均高于空气对照组(5O9士44)(P< 005),但缺氧加TMP组又低于单纯缺氧组< 005) 23TMP对缺氧大鼠脑干神经元FOS聋自表达 的影响 空气对照组和单纯TMP组在脑干无FOS阳 性神经元.单纯缺氧组和缺氧加TMP组均有FOS 的阳性表达如表2所示,阳性表达神经元主要出现 于孤束核,最后区,舌下神经棱,中缝苍白核,下橄榄 核,外侧阿状梭,面神经核,斜方体核,但在缺氧加 TMP组,上述神经核团的灰度值均高于单纯缺氧组 目I缺t?#.E400目2缺《TMPni#.e×400目3t ?#ros?自IHC—SP×400目4nTMPn??#FOSj自.IRCSpx400 FiglMlctog~phshowLng'h…一?且inthefIaI…le?Iheral0rhypoxlagroupNIssI',~talning×400Fig2Mlcrog~ph showingtheneur0nBInthefacialNucleusIntherat0FhypoxiaplusTMPgroupNlssl'staining ×400Fig3Thet^Drssi0?afFOS p~telnInihenuc[~uBoft~pezold,…e~pl~-InIher-?nrhypax[sgroupIHC—SP×400Fig4Then口r?lFOgp~l~ln Inthenucle~oftra~:d-uexample,Inlh~r?tsothypOxlaplusTMPgDpHtC—Sp×400 2TMp缺t??fFOS?自(i?) Tsble2EffectofTMPonthechg.ofIh~gydt.g~andthe…b…fFOgpositive…,l? somenucleiOfthebrAJ~temInducedhy 四川大学(医学版)2005年第36卷第4期 (P<0.05),阳性神经元的数目少于单纯缺氧组(P <0.05),见图3,4. 3讨论 本研究结果表明,TMP能使缺氧大鼠出现呼吸 抑制的时间明显推迟,存活时间明显延长,减弱缺氧 引起的脑干神经元内尼氏体的减少,因此,TMP对 缺氧引起的呼吸抑制和脑干神经元损伤有保护作 用.脑干严重缺氧时,有氧氧化过渡为无氧糖酵解, ATP供给不足,不能满足有氧代谢时高能量需求的 膜泵功能,导致钠,钾,钙等离子稳态失衡,引起兴奋 性氨基酸的释放,钙超载等病理性损害,而钙超载是 众多病理损害的中心环节,能激活蛋白溶解酶,磷脂 酶,核酸酶等,从而引起神经元骨架的降解,细胞内 膜系统的破坏,氧自由基的产生,导致神经元功能严 重受损[5].这可能是严重缺氧后大鼠呼吸抑制直至 呼吸停止的原因之一.而TMP具有钙拮抗的作 用L6],在一定程度上能阻止或减弱以上病理过程的 发生,从而对神经元起到保护作用.因此,TMP预 处理组的大鼠缺氧后呼吸受到抑制的时间及存活时 间都明显长于单纯缺氧组.尼氏体是广泛存在于神 经元内的一种嗜碱性物质,具有活跃合成蛋白质的 功能,其中包括复制细胞器和产生神经递质有关的 蛋白质和酶.尼氏体的数量,形状和分布可随神经元 的功能状况不同而有差异.在本实验中,缺氧后神经 元内尼氏体明显减少,因而神经元合成蛋白质的能 力下降,这可能是呼吸中枢神经元在缺氧后功能受 损导致呼吸抑制的原因之一.TMP能明显降低缺 氧后脑干神经元尼氏体数量的减少,进一步提示 TMP对脑干神经元的缺氧性损害具有保护作用. c—los原癌基因属即早基因,生理状态在成年动 物的脑干极少表达或不表达[7].在各种刺激或损 伤如缺氧,外伤,癫痫等情况下,c—los基因能很快被 激活,入胞浆合成FOS蛋白,之后FOS入胞核与 JUN蛋白形成FOS—JUN二聚体,构成AP一1 (activatorprotein一1)转录因子,然后结合于靶基因 的AP一1位点,进一步激活后期效应基因的表达,从 而导致对细胞存活具有重要作用的细胞内看家蛋白 (housekeepingprotein)的丢失及下调bcl一2tuRNA 水平以诱导细胞凋亡,把短暂的外界刺激或损伤信 号转变为持久的细胞内表达的信号以致细胞损 伤E].同时,FOS在刺激或伤害性信号传导通路的 众多水平都有表达,而且FOS阳性表达的神经元或 核团与神经束路追踪的方法得到的结果相似,因此, FOS的表达可作为神经元是否参与刺激或伤害性 信号传导的标志[9.缺氧后FOS在脑干诸核团的 表达提示缺氧后呼吸中枢神经网络之间复杂的投射 关系,同时也表明,上述神经核团已经受到一定程度 的损害.TMP明显减少缺氧后上述脑干神经核团 FOS的表达,提示川芎嗪对脑干神经元的保护作用 可能与FOS有关. 参考文献 1姜国辉.秦文娟.川芎嗪的药物代谢动力学.见t陈可冀主编.川 芎嗪的化学,药理与临床应用.第1版.北京t人民卫生出版社. 1999:19—52. 2王强,陈绍洋,熊利泽.川芎嗪防治缺血性脑损伤的机制研 究.陕西医学杂志.2001;30(4)t223. 3朱晓琴,张端莲.胡祁生.川芎嗪对实验性癫瘸大鼠大脑皮层神 经元内尼氏小体的定量分析.数理医药学杂志,2002;15(5). 399. 4王廷华,刘芬,张晓.部分背根切断对备用背根节NT一3表 达的影响.解剖,2003;34(6)t602. 5王迪浔.缺氧.见t金惠铭主编.病理生理学.第5版.北京.人民 卫生出版社.2000:78—93. 6张勇.陈金全,吴凯.单味川芎治疗脑缺血的研究进展.河 北中医,2003;25(6)l471. 7祝美珍,李志刚.脑缺血后c—los原癌基因表达.河北医科大学 ,2003,24(3)l173. 8TeppemaLJ,VeeningJG,KranenburgA.eta1.Expressionof c—fosintheratbrainstemafterexposuretohypoxiaandto normoxicandhyperoxichypercapnia.JCompNeurol,1997; 388(2)l169. 9BerquinP,BodineauL,GrosF.eta1.Brainstemand hypothalamicareasinvolvedinrespiratorychemoreflexesla Fosstudyinadultrats.BrainRes,2000;857(1—2)l30. 10KaminskaB,PyrzynskaB.CiechomskaI.eta1.Modulationof thecompositionofAP一1complexanditsimpacton transcriptionalactivity.ActaNeurobiolExp(wars),2000l60 (3)l395. iiElizabethB.Expressionofc—los—likeproteinasamarkerfor neuronalactivityfollowingnoxiousstimulationintherat.J CompNeurol,1990I296(4)l517. (2004—09—16收稿,2004—12—24修回) 编辑沈进