嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究 嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究 1978中国1生检验杂志2007年l1月第l7卷第ll期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17Noll 【论着】 嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究 张政,朱水荣,徐宝祥 (浙江省疾病预防控制中心,杭州310009) [摘要]目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景.方法:40株分离株分别经血清学凝集 试验,胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5SrRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基 因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术 对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumericsVersion4.0软件进行聚类分析.结果:所有的菌株均带有属 特异性5SrRNA基冈及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异.结论:所有菌株 经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株 存在遗传多样性. [关键词]嗜肺军团菌;脉冲场凝胶电泳;聚合酶链式反应;荧光定量PCR;基因分型 [中图分类号]R378[文献标识码]A[文章编号]1004—8685(2007)11—1978一o3 Studyongenedetectionand. molecularcharacteristicsofLegionellapneumophila ZhangZheng,ZhuShui—rong.地Bao—x/ang (ZhejiangCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310009,China) [Abstract]Objective:ToinvestigatethegeneticcharacteristicsandhereditybackgroundofL P1Legionellastrainsisolatedfrom environmentalwater,Methods:F0nyisolateswereconfirmedtobeLP1Legionellabyserologicalandlatexagglutina— tion.Polymerasechainreaction(PCR)wasusedfor5SrRNAgeneandmiptoxicgenedetection.Furthermore,fluorescencequart— titativePCR(FQ— PCR)wasusedformipgenedetection.Pulsefieldgelelectronphoresis(PFGE)wasappliedforchromosomal genetyping,andBioNumericssoftwarewasappliedforclusteranalysis.Results:Allofthestrainscarriedboth5SrRNAgeneand miptoxicgene.TheclusteranalysisresultsofPFGEmaDsshowedthatmostofthestrainsdifieredingeneticsimilarity.Condu— sion:CharacterizedgenesaredetectedpositiveinallofthestrainswithPCRandFQ— PCR.Accordingtotheclusteranalysisre— suhsofPFGEmaps,geneticdiversityexistsinLP1LegionellastrainsisolatedfromenvironmentalwaterinZhejiangProvince. [KeywordslLegioneUapneumophila;Polymerasechainreaction(PCR);FluorecencequantitativePCR(FQ—PCR);Pulse fieldgelelectrophoresis(PFGE);Genetyping 军团菌能引起严重的呼吸道感染疾病,其中嗜肺军团菌 是最普遍致病的0.90%以上的军团菌肺炎都是由嗜肺军 叫菌引起的.军团菌普遍存在于许多天然或人工的水环境 中,随着城市经济的繁荣,大型建筑的兴建及随之而来大型空 调设备的增加,可能导致军团菌病的发生和流行J.作为新 发传染病之一,军团菌病已成为世界各国普遍关注的公共丁J 生问题. 作者从2002年起开展了外环境中军团菌污染状况的监测 研究,自水中,特别是城市中央空凋冷却塔水或冷凝水中分离 培养了一定数量的军团菌菌株,并经过了血清学凝集试验和 胶乳凝集试验确认.为了解浙江省军团菌基因特征和遗传背 [作者简介]张政(1966一),男,学士,主任技师,主要从事病原 微生物检验研究. 景,运用分子生物学技术,对保存的部分LPI型嗜肺军团菌作 _r基因检测和分子特征研究,现将结果报告如下: 1材料与方法 1.1菌株来源 40株嗜肺军团菌均为本省在历年外环境中军团菌污染状 况监测中检得,并经血清学凝集试验和胶乳凝集试验鉴定为 LP1型嗜肺军团菌;菌株来源于7个不同的场所和三类水体, 详见表I;实验菌株地区分布为舟山11株,湖州10株,台州8 株,嘉兴5株,杭州2株,宁波2株,金华2株;作为PFGE实验 分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 对照的布伦敦卢普(Braenderup)沙门菌H9812菌 株,由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供. 中国卫生检验杂志2007年11月第l7卷第11期 ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology.Nov2007:Vol17No111979 表1实验菌株来源场所及水体分布 1.2主要试剂 军团菌诊断血清购自日本生研会社及上海市CDC,均在 有效期内使用;BCYE基础及GVPC选择培养基,胶乳凝集试 剂盒购自广州乐通泰试剂有限公司;引物及探针由TAKARA 大连宝生物工程有限公司合成,PCR系列试剂及限制性内切 酶I,XbaI亦由该公司提供;蛋白酶K购自Merck公司; SeaKemGoldAgarose购自Bio—Rad公司. 1.3主要仪器 梯度PCR仪(EppendorfMastercycler),荧光定量PCR仪 (STRATAGNEMX30OOP),脉冲场凝胶电泳仪(Bio—Rad CHEFMapper),凝胶成像仪,水浴摇床,二氧化碳培养箱等. 1.4细菌DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 制备 挑取单个菌落于100裂解液中,放入IO0~C热裂解仪 中10min后,立即放入一20?的冰箱中15min,12000r/min 离心5min,放入4?冰箱保存,备用. 1.5PCR扩增体系和反应条件 总反应体系为25l,包括Taq酶(5U/1)0.2txl,10× buffer2.5l,Mgz1.5txl,dNTP2txl,上,下游引物各0.5txl, 模板2l,用ddH2O补足至25l.反应条件:94?5rain, 94?35S,55?35S,72?75S,35个循环,72?3min,2%的 琼脂糖凝胶电泳,照相.5SrRNA基因扩增片段大小为 104bp,mip基因扩增片段大小为440bp. 1.6实时荧光PCR扩增体系和反应条件 总反应体系为25l,包括premixEXTaq12.5txl,L游引 物0.25txl,下游引物0.25l,探针0.5l,模板DNA2txl, ROXReferenceDyel10.5l,用ddH2O补足至25l.反应 条件:95?预变性10S后,采用二步法进行反应:95?5S, 60?20s,40个循环.在60?设定荧光检测点.每个循环结 束后采集数据,反应结束后根据扩增曲线判定结果,ct值< 35,且反应曲线良好判为阳性. 1.7脉冲场凝胶电泳 挑取单个菌落接种于BCYE平板,在CO培养箱37?培 养2d.用棉签刮取适量细菌,均匀悬浊于细菌悬浮液Cs8 中,使其浓度为4.0个麦氏单位.取400txl细菌悬浊液于 1.5ml离心管巾,加入20l蛋白酶K(20mg/m1),再与 400汕l的1%SeskemGold琼脂糖:1%SDS混合均匀,将混合 物注入模具.胶块凝固后,放人5ml含有25l蛋白酶K (20mg/m1)的细胞裂解液CLB中,54?摇床中孵育2h,转速 约170r/min.然后用50?15mJ灭菌水洗胶块2次,再用 50?15mlTE洗胶块4次,每次15min.用片切下2mm 宽的胶块放入1.5ml离心管中,用50u的sI于50?酶切 4h.将胶块贴于梳齿包埋于l%SeskemGold琼脂糖,待胶凝 后,将胶小心放入含2500ml0.5XTBE缓冲液电泳槽中,电 泳21.5h,电泳起始转换时问5.3s,最后转换时fnJ49.9S,电 压6V/em,电场夹角120.,电流控制存155mA左右,温度 14?.电泳结束后用EB染色,去离子水脱色后用在凝胶成像 仪上照相. 1.8聚类分析 采用BioNumerics软件对实验菌株全染色体DNA酶切图 谱进行聚类分析. 2结果 2.15SrRNA基因PCR检测结果 40株实验菌株军团菡属特异性5SrRNA基冈及嗜肺军团 菌主要毒力基因mip检测均为阳性,见图1. M12345678910l112 图15SrRNA基因PCR检测结果 1,10:部分实验菌株,11:阳性对照,l2:阴性对照,M:50bpMarker 2.2mip基因实时荧光PCR检测结果 实时荧光PCR检测实验菌株Mip肇因,结果均为阳性, 图2. 0 0 已 ?0 0 2 呈o _山0 4812162O242832364U Cycles 图2mip基因实时荧光PCR检测结果 2.3电泳及聚类分析结果 对40株实验菌株,制备令染色体基因组DNA,以限制性 内切酶sfiI消化,进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),并对分型结 果以生物分析软件进行聚类分析,电泳及聚类分析结果见图 3,图4. 图3实验菌株PFGE分型图谱 】,J】:为部分实验菌株,M:Marker(/-19812) 1980中国卫生检验杂志2007年11月第l7卷第11期 ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17No11 65707580859095100 图440株LP1型嗜肺军团茵PFGE结果聚类图 3讨论 5SrRNA基因高度保守,基因中有些序列在长期的进化过 程中非常稳定,针对军团菌属5SrRNA基因设计特异引物.可 对军团菌属细菌进行检测鉴定;巨.噬细胞感染增强蛋白(mi. crophageinfectivitypotentiator,mip),是军团菌的主要毒力因子 之一,在嗜肺军团菌抵抗宿主细胞内杀灭机制中发挥重要作 用.编码mip蛋白的基因为mip毒力基因,为嗜肺军团菌 种所特有J,利用PCR技术能特异性的扩增嗜肺军团菌mip 毒力基因,借此还可以与其它非嗜肺军团菌进行区别并加以 鉴定.我们应用PCR对分离保存的嗜肺军团菌菌株作属特异 性5SrRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因检测,并同时用荧 光定量PCR检测mip毒力基因,结果显示所有实验菌株均携 带5SrRNA基因和mip毒力基因,也从分子生物学角度对菌株 进行了确认. 脉冲场凝胶电泳(PFGE)是近十年来发展起来的一门新 的基因分型技术,该法具有高分辨力且稳定性好,目前已作 为分子指纹图谱的"金标准"在国际上广为应用].本次对 40株LP1型嗜肺军团菌菌株,在传统分型的基础上采用PFGE 进行基因分型,结果用BioNumuerics软件进行聚类分析,根据 PFGE聚类分析结果中相似性系数值的大小对菌株进行同源 性分析.按相似性系数100%分型,结果显示所有菌株可分成 27种PFGE型,其中有19株菌株分属6种PFGE型,而另21 株菌株则分属21种PFGE型,相似性系数则从60%95%不 等;按相似性系数95%分型,结果显示所有菌株可分成18种 不同PFGE型,其中有16株菌株属3种PFGE型,而另24株菌 株则分属15种PFGE型;按相似性系数90%分型,结果显示所 有菌株被分成9种不同PFGE型,其中有21株菌株属1种PF- GE型,而另19株菌株则分属8种PFGE型.同一地区菌株按 相似性系数100%分型,其PFGE型也有不同,如舟山11株菌 分为8种PFGE型,湖州10株菌分为7种PFGE型;当然,不同 地区部分菌株也有相同PFGE型菌株,如1株舟山株与1株湖 州株及1株宁波株有100%相似性,3株湖州株与1株嘉兴株 也有100%相似性.如按照相似性系数大于95%进行统计,湖 州,舟山,台州,宁波,嘉兴地区分别有部分菌株亲缘关系较 近.试验证明相同血清型的嗜肺军团菌菌株可经PFGE试验 分为多个基因型,可见PFGE能将菌株作进一步基因分型. 鉴于不同地区分离菌株中,仅少部分有相同酶切图谱,大 部分菌株问其相似性系数差异仍较明显,可见菌株问其亲缘 关系较远,应属于多个克隆系,提示浙江省散在水系LP1型军 团菌分离株存在广泛的遗传多样性.LP1型菌株具有高致病 性,该菌已在世界范围内引起多起军团菌病暴发或流行.通 过近几年外环境水的监测表明,LP1型菌株在浙江省普遍存 在,且普遍携带mip毒力基因,其潜在危险性不可忽视,故今 后仍应加强该类菌株的监测检验工作,以防军团菌病发生或 流行. 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