乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究

乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究 乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱 陈酿期的应用研究 创新与借鉴中国酿造2009年第3期 总第204期?105? 乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究 刘超兰,黄着,彭熙敏.,韩瑞枝,黄钧,周荣清 (1.四川大学轻纺与食品学院,四川成都610065;2.四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四 川成都610065) 摘要:耐盐乳酸菌和酵母菌接种到郫县豆瓣的酱醅中共培养,陈酿8个月后,试验组的总酯显 着增加,接近自然陈酿12个月的水平, 氨基酸态氮,总酸等理化指标无显着差异.通过HS.SPME耦联GC.MS技术检测4个月和8 个月陈酿酱醅挥发性组分的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明, 十四烷酸,十六碳酸,棕榈酸,亚油酸和15一甲基.十七(碳)酸的乙酯衍生物等酯香主体成分 成倍增加.Glu,Asp,Ser,Thr,Ala等对呈 味有显着影响的组分也有较大增幅.研究结果表明,乳酸菌和酵母菌的协同作用具有促进酯 化,呈味氨基酸形成及抑制杂菌的作用, 对其风味改善贡献显着. 关键词:豆瓣酱;酵母;乳酸菌;气质联用;风味物质;共培养 中图分类号:TS264.2文献标识码:A文章编号:0254—5071(2009)03—0105—04 ReductionofripeningperiodofPixianbeanchilipastesbycoculturingofsalt-toleranceLactobacillusandyeasts LIUChaolan,HUANGZhu,PENGXimin,HANRuizhi,HUANGJun,ZHOURongqing fi.CollegeofLightIndustry,Textile&FoodEngineering,SichuanUnive~i(y,Chengdu610065,China; 2.NationalEngineeringLaboratoryforCleanTechnologyofLeatherManufacture,SichuanUniversi~Chengdu610065,China) Abslraet:Bycoculturingofsalt-toleranceLactobacillusandyeastsinthePixianbeanchilipaste,totaleatersinthetestedsamplewereincreased significantlyafterbeingripenedfor8monthsandthecontentswereapproachedtothelevelofthecontrolsample,whichwasripenednaturallyfor12 months.Therewasnoremarkabledifferencebetweenotherphysicalandchemicalparameterssuchasaminoni~ogenandtotalacidcontent.The aromaconstituentsidentifiedbyGC—MScoupledwithHS—SPMEoftestedsamplesripenedfor4and8 monthsrespectivelywereincreasedtwice comparedwiththatofthecontrolsample,andtheethylestersoffattyacidsincludingmyristate,9-hexadecenoate,hexadecanoate, 9,12-octadecadienoateand15?methyl-margarateweremajorsubstancesthatcontributedtothewholeflavorofthechilipaste.Inaddition,the substancescontributedtotaste,suchasGlu,Asp,Ser,Thr)Ala,eta1.weregreatlyincreasedinthetestedsa mple.Theresultssuggestedthattheflavor andtastewereimprovedmarkedlybyasynergisticeffectofLactobacillusandyeasts,whichpromotedthe esterificationandtheformationofamino acidandinhibitionofbacteria. Keywords:beanchilipaste;yeasts;Lactobacillus;GC?MS;flavorcompounds;coculturing 郫县豆瓣是川菜中必需的调味品之一[u,堪称川菜之 魂.味辣香醇,红棕油亮,瓣粒酥脆,粘稠绒实,酱香浓郁 的产品特色是源于具有300多年的独特 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 和生产环境翻. 传统郫县豆瓣酱生产的原料是蚕豆瓣,面粉和本地优质 鲜椒.其工艺:蚕豆瓣经沸水漂烫,冷水降温,沥水等后, 与生面粉混合,自然接种,温度控制为25oC--40~C,培养5d 左右后成曲,与适量浓盐水(12.B6)均匀拌和,经1年以上 自然发酵成瓣醅,然后与盐渍4个月以上的椒醅按比例混合, 置于日晒夜露的环境中陈酿1年以上.独特之处是环境中 米曲霉在生料上繁殖,产生独特酶系和芳香组分;在瓣醅 酿造过程中,逐步形成了以耐盐乳酸菌和酵母菌为主的益 生菌系,同时其代谢产物和淀粉,蛋白质的各种水解产物 不仅是重要的呈香味物质,其协同地抑制杂菌及降解真菌 毒素的作用是产品安全的保障基础;盐渍椒醅既能排除非 耐盐性杂菌的影响,又能使辣椒碱被降解为二氢辣椒,消除 其辛辣味[3];在日晒夜露的环境中,通过酶促和非酶促作 用,生成特定的呈香,呈味和呈色物质.日晒夜露陈酿是 我国传统发酵调味品的共有特征.本试验对郫县豆瓣陈 酿过程中微生物区系变迁基本规律及应用乳酸菌和酵母 菌共培养技术缩短郫县豆瓣陈酿周期的研究,并促进其方 法在相关行业的应用. 1材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1材料 胰蛋白胨,酵母抽提物:OXOID公司;制霉菌素Nys. tatin:SIGMA公司;其他试剂均为分析纯. 1.2微生物菌种 耐盐乳酸菌SZ09和耐盐酵母sz一03菌株:本实验室保 藏菌株(从郫县豆瓣酱中分离,经形态观察以及生理生化 的初步鉴定). 1-3培养基 细菌检测培养基:加入50U/mL制霉菌素的牛肉膏蛋白 胨琼脂培养基. 霉菌检测培养基:加入40U/mL青霉素和链霉素的查 氏琼脂培养基. 收稿日期:2008.12.05 基金项目:四川省重点科技项目(07SG111-009) 作者简介:刘超兰(1985.),女,福建泉州人,硕士研究生,研究方向为现代发酵技术:周荣清?,教 授,通讯作者. 2009No.3 ?106?SerialNo.204ChinaBrewinglnnovati.nandKn.w1edgeTransfer 乳酸菌种子培养基:MRS培养基. 酵母菌种子培养基:生酱油培养基. 1.4主要仪器及设备 气相质谱联用仪:tracegcDSQI1,ThermoFisher;安 捷伦1100液相色谱;PHS.3C精密酸度计;DHP.9162电热 恒温培养箱;SPECTRUMLAB22PC可见分光光度计; SW.CJ一2FD型超净工作台. 1.5试验方法 1.5.1实验室规模的试验 盐渍椒醅和瓣醅以0.70:0.30的比例混和搅拌均匀,分 别以3x10cfu/g和1xl0cfu/g接种量加入乳酸菌和酵母菌, 装袋密封(试验组),未接种的酱醅作对照组,3袋(500g/袋) 为一组,置于(30?2)oC的培养箱中培养,定期观察其微生 物及主要理化指标的变化规律.随后进行360kg~模及不同 酱醅和椒醅陈酿4个月的试验,再扩大到7t~4:产试验. 1.5.2菌落计数 平板菌落计数法. 1.5_3水分,还原糖,总酸度,氨基酸态氮,盐分和总酯的测定 水分的测定:采用直接干燥法[5】;还原糖测定:采用 3,5.二硝基水杨酸(DNS)法测定;总酸度的测定:采用酸 度计法进行,以乳酸计总酸度网;氨基酸态氮的测定:采用 甲醛滴定法测定阿;盐分的测定:参见GB/T5009.2003E6];总酯 的测定:参见文献[7]. 1.5.4挥发性风味成分检测嗍 GC.MS条件:色谱柱为TR.5MSG0mx0.32mmx0.251xm 膜厚)石英毛细管柱;SPME(固相微萃仪)为Bellefonte,PA, USA;程序升温,初始温度40cC,保持2min后,以2~C/min升至 24a?,10min;进样口温度270?;柱流量为1.0mL/min;接口 温度为25O?;载气为高纯氦;质量扫描范围45amu~400amu; 电子能量70eV. HS.SPME:顶空进样瓶中装A5g研磨酱醅,(50~0.2)oC 平衡15min,插入萃取针,萃取45mirl』舌,耦联GC.MS进样分析. 通过检测质谱数据与标准谱库(NIST2005)对照进行 成分鉴定,当且仅当匹配度大于800(最大值为1000)的鉴 定结果才予以报道.某些具有多环或复杂结构的化合物, 仅作试验性的鉴定.使用Xcalibur软件系统对结果数据进 行处理,采用峰面积归一化法确定各化合物相对含量. 1.5.5氨基酸的检测凹 色谱条件:4.0x125mmCl8柱;柱温40?;流速1.00mL/min; 波长338nm,262nm(Pro);流动相A为20mmol醋酸钠液;流动 相B为20mmol醋酸钠液:甲醇乙腈为l:2:2(v/v). 2结果与讨论 2.1酱醅陈酿过程中微生物区系的变化趋势 在(30?2)?条件下,陈酿56d的过程中,微生物区系变 化的趋势见图1.对照组的菌落总数的变化趋势曲线表 明,陈酿初期,菌落总数微有波动,经过3周后,菌落总数未 见显着的变化.耐盐性菌落的总数则是呈现一个先增加, 随后趋于缓慢下降的趋势.试验组的菌落总数在陈酿初 期与对照组类似,但在第4周以后迅速下降,其耐盐菌落的 增加趋势比对照组提前,在开始1周就到达107cfu/g~108cfu/g 的水平,维持2周后迅速降低.霉菌数的变化规律表明,试 验组添加微生物在初期迅速形成了优势菌群,其代谢产物 也具有抑制霉菌,非耐盐微生物的作用?,所以经过8周的 陈酿后,未检测到霉菌,而对照组检测到还残存有10cfu/g. 一菌落总数(c) 一 耐盐凶落数(c) 一霉菌数(c) 一耐盐菌落数(T) 一 霉菌数(T) +菌落总数(T) 0l2345678 陈酿时间/周 T为试验组;C为对照组(下同) 图1陈酿过程中微生物区系的变化 Figure1.Changeofmicrofloarduringripeness 2.2酱醅陈酿过程中理化指标的变化规律 在陈酿过程中,酱醅的RS,总酸,FN和总酯的变化曲 线(图2)表明,2组的RS都一直都呈降低趋势,试验组加入 了微生物,生长繁殖及转化为醇类等物质的速率大,RS的 降低幅度较快.尤其在初始阶段,微生物生长速度快,消耗 糖的速率也大,因此RS下降的速率也快.陈酿时间延长, 微生物生长趋于稳定,逐渐减少,使得代谢物积累,消耗糖 的速率减缓,RS的降低速率也变缓. 一RS(T)一总酸(T)-.4-FN(T1.?- _..RS(c).’-总酸(c)+FN..- 20 嵴 H-15 帅 号lO ? 总酯(T) 总酯(C) 2O.0 O.O 臻 H_ ? 0 2 0.O H_ ? 0 2 Z o246 陈酿时间/周 图2陈酿过程中主要理化指标的变化 Figure2.Changeofthemainphysicalandchemicalparameters duringripeness 在起始阶段,频繁搅动,酱醅中溶氧相对较高,使得杂 菌繁殖较快,生酸量大,所以总酸含量增幅较大.随着陈 酿时间延长,微生物生长变缓而趋于平衡,耐盐性微生化作用速率较快…】所致,且变化幅度 较小.对照组则因在初 始阶段杂菌产酸较多,致使蛋白质降解等原因,使得FN的相 对增加较大,比试验组的含量高.陈酿时间延长,微生物消 长,是致使FN小幅波动的原因之一. 将不同企业椒醅与瓣醅按一定比例混合,分别以4.5× 106cfu/g,1.5x106cfu/g的接种量加入乳酸菌和酵母菌,经过 4个月陈酿后,酱醅主要理化指标的分析结果(表1)显示, 添加微生物,促进酯化作用显着.乳酸菌代谢产生的有机 酸增加了其总酸含量,代谢产物抑制了杂菌,使得杂酸量 低,酯化作用的增强促进了酸的消耗,所以未观察到2组的 总酸有显着差异.酵母的代谢产物醇类,虽其风味阈值较 高,风味的贡献度并不显着,但其醇类促进了酯化的作用, 不仅使试验组的总酯含量被显着提高,其闻香也有所增 强,同时杂菌被抑制,减少了FN的无效消耗,所以试验组 FN的含量相对较高. 表1主要理化指标的比较 Table1.Comparisonofthemainphysicalandchemicalparameters 注:”A.”为未经盐渍的干椒醅;”B:”为同企业的盐渍椒醅:”c,”为另一 企业的盐渍椒醅. 应用1.5.4所叙述的方法已鉴定出79种化合物(表2), 包括醇,酯,醛,酚,环状化合物等9类挥发性芳香成分.其 中醇类,酯类和酚类组分所占比例较高.代表酱类主要芳 香组分的酯类物质[12]的相对含量在试验组和对照组分别 是20.86%和12.28%,试验组的酯类组分显着增加,其中十 四烷酸,十六碳酸,棕榈酸,亚油酸和15.甲基一十七(碳)酸 的乙酯衍生物等酯香主体成分成倍增高,所以酯香味较 对照浓郁.试验组的酚类物质较对照降低.其挥发组分的 变化规律与研究自然陈酿过程中挥发性组分的变化规律 相同.由此可见,应用乳酸菌和酵母菌的共培养技术生产 的风味物质,不仅赋予其样品的醇香,酯化作用亦显着增 强[1.同时总酸所占挥发组分的比例与滴定酸度的结果是 一 致的,实验室规模的结果在中试规模得到了验证. 2-3应用结果的比较 应用1.5.4所叙述的方法得到结果见表3.生产规模的应 用试验结果证明,应用共培养技术缩短陈酿周期是非常 有效的.试验组不仅在酯类和醇类组分的相对比例比对照 组增加,而且挥发组分的各类组分与自然陈酿l2个月的样 品基本相同.试验组的亚油酸乙酯,棕榈酸乙酯和反式.4. 葵烯酸乙酯等赋予郫县豆瓣特殊酯香的组分显着增加,酚 类组分显着下降,4.乙基苯酚,4.乙基一2.甲氧基苯酚等组分 成倍降低.表明添加微生物具有加速亚油酸乙酯,棕榈酸乙 酯和反式.4.葵烯酸乙酯等特征酯类组分的形成,降解易于 氧化的酚类物质,使其趋于稳定,缩短陈酿周期作用明显. 表24个月陈酿样品中挥发性风昧物质比较 Table2.Comparisonofvolatileflavorcompoundsfor4monthsripeness 表3不同陈酿期酱醅挥发性风味物质的比较 Tabale3.Comparisonofvolatileflavorcompoundsinthedifferent ripenessperiods 注:”+”为鑫鸿望样品;”““为郫县豆瓣股份有限公司自然陈酿样品. 表4陈酿过程中主要理化指标的变化分析 Table4.Changesofmainphysicalandchemicalparametersduring npeness 注:”T”为试验;”C”为对照;”=lk”为鑫鸿望样品;”??”为郫县豆瓣股份有 限公司自然陈酿样品.(下同) 一一一一 ,一一一 一 试一 对 2009No.3 ?108?SerialNo.204ChinaBrewingInn.vati.nandKn.w1edgeTransfer 从表4的分析检测数据表明,不同陈酿期试验组所含 氨基酸(AA),氨基酸态氮及总酯不仅较其相同陈酿期的 对照组高,而且反映发酵酱特征的总酯,氨基酸态氮等主 要组分的含量接近采用传统工艺生产样品的相应指标. 表5陈酿周期过程中各种氨基酸的变化规律的比较 Table5?c.mparis.n0fami.acIdchagesduringripeness 10Og样品 注:”T”为试验;…C为对照;”“为鑫鸿望样品;”??”为郫县豆瓣股份有限公司自然陈酿样品 从表5看出,接种微生物的酱醅的Asp,Ser,Thr,Gly和 Ala的含量较对照增多,而自然陈酿的酱醅相应的组分均降 低.Asp在酱醅的贡献主要是赋予其甜鲜,而Ser,Thr,Gly~1] Ala对其风味的贡献主要赋予其酸鲜.所以应用Friedman 排序检验法评价陈酿品排序结果为:18个月(C)>10个月 (T)>8个月(T)>12个月(C)>24个月(C)>8个月(C)的样 品,即试验组的理化指标和品尝结果表明,l0个月的试验 产品与自然陈酿12,18个月的产品类似. 3结论 应用酵母菌和乳酸菌的共培养技术缩短郫县豆瓣 陈酿周期的研究结果表明,抑制杂菌和促进酯化作用的 效果显着.中试4个月陈酿期的结果不仅验证了小试的 规律,同时还表明,该方法适合不同瓣醅和椒醅,具有 可被广泛应用的特点,且FN较对照组有不同程度的提高. 生产规模8个月陈酿的试验组和自然陈酿12个月,18个 月的产品的主要理化和感官指标类似,缩短陈酿期的效 果显着. 采用HS.SPME和GC.MS耦联技术检测中试和生产规 模产品挥发性组分的结果表明,在鉴定出醇,酯,醛,酚,环 状化合物9类共计79种物质中,代表酱类主要芳香组分的酯类 物质的相对含量比对照组显着提高,其中十四烷酸,十六 碳酸,棕榈酸,亚油酸和15.甲基.十七(碳)酸的乙酯衍生 物等酯香主体成分成倍高出,且与自然陈酿12个月和18个 月的产品类似,Glu,Asp,Ser,Thr,Ala等对呈味影响较大 氨基酸组分的含量增加显着,与应用Friedman~序检验法 评价陈酿品排序结果一致. 参考文献: [1】李幼筠.”郫县豆瓣”剖析【J】_中国酿造,2008(11):83—86. 【2】高岭.四川豆瓣的加工工艺及发酵机理初探明.中国调味品,1998(6): 22.23. 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Single—factorandoflhogonalexperimentwereappliedtoinvestigatetheabsorptionandpropagationof yeastcellsinthecarrier.Theresultsindicated thatadsorbingfor20minandcontinuousculturingforfourhoursinthereactorbothat14?.Inaddition.the kineticmodelsofadsorbingyeastcellsin thefoamceramicwereobtainedrespectivelyatthreedifferenttemperatures.Theapplicationoftheproce ssingmentionedabovenotonlyobtaineda perfecteffectofimmobilizingbutalsobenefitedforsimplifyingprocessingofcontinuousbeerfermentat ion. Keywords:foamceramic;immobilization;Saccharomycescerevisiae;kineticmodel 固定化细胞技术应用于啤酒生产,最大的优势在于可 实现连续发酵,缩短发酵周期,提高设备利用率和生产效 率【-2];而且还能节约能源,减少酒损及发酵罐清洗用水,从 而减少污水排放[3】.固定化酵母细胞应用于啤酒的连续发 酵还远未达到工业化规模的推广和应用.创造性的研发 新型的载体材料,并简化固定化技术方法,是实现该工艺 技术工业化应用的主要途径之一. 泡沫陶瓷为无机非金属材料,理化性质稳定,耐高温, 耐酸碱,并具有一定的机械强度,特别是比表面积极大,非 常适合用作酵母细胞的吸附固定化载体.通过对泡沫陶 瓷吸附酵母细胞以及固定化酵母细胞培养增殖的试验研 究,探索固定化酵母细胞生物催化剂制各较佳的工艺条件, 为后续连续发酵试验作必要的前期准备. 1材料和方法 1.1试验材料 泡沫陶瓷:由景德镇陶瓷研究所提供;酵母泥:酵母菌 数为1.5x10个,浙江钱江啤酒厂提供;麦汁:1lop啤酒生 产用麦汁,浙江钱江啤酒厂提供. 1.2主要仪器 收稿日期:2008—10—30 作者简介:程江峰(1972一),男,副教授,研究方向为生化工程. 普通光学显微镜,血球计数板,电子天平,振荡器,生 化培养箱等. 1.3试验方法 1-3.1分析方法 酵母菌数:显微计数法旧. 载体吸附细胞密度的测定:已知质量的泡沫陶瓷吸附 酵母或培养增殖结束后沥干,并用吹风机吹干后置于塑料 管中,加入30mL蒸馏水,振荡5min,而后倾出蒸馏水,测定 蒸馏水中的酵母菌数;再于试管中加入30mL蒸馏水,重复 操作3,5次,至载体吸附的酵母细胞几乎全部洗出.把每 次测得的酵母菌数相加再除以载体质量,可得载体吸附酵 母细胞密度. 数据处理:在微机上,使用DPS统计分析软件进行数 据处理与分析同. 1.3.2泡沫陶瓷对酵母细胞的吸附 载体预处理:泡沫陶瓷经清水浸泡,冲洗后于烘箱200~C 干热灭菌,而后称重. 酵母菌悬液的制备:用蒸馏水将酵母泥配成酵母菌悬 液,其酵母细胞浓度为1.74x10.个/mL. soy-sauceprocesses[J].TrendsinFoodScience&Technology,2001,12: 322—327. 【12】YAMABES,KANEKOK,INOUEH,eta1.Maturationoffermented rice—kojimisocanbemonitoredbyanincreaseinfattyacidethylester [J].Biosci.Biotoclmo1.Biochem,2004,68(1):250—252. 【13]WACHEY,HUSSONF,FERONG,eta1.Yeastasanefficientbiocata- lystfortheproductionoflipid-derivedflavoursandfragrances[J].An- tonievanLoouwonhoeI【,2o06,89:405—416.