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研究复习参考基于固相载体可逆化固定法(SPRI)提取质粒DNA的机理.doc

研究复习参考基于固相载体可逆化固定法(SPRI)提取质粒DNA…

再纯de牛奶也会过期
2019-05-30 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《研究复习参考基于固相载体可逆化固定法(SPRI)提取质粒DNA的机理doc》,可适用于综合领域

民族神话鸿蒙未辟宇宙洪荒亿万斯年四极不张基于固相载体可逆化固定法(SPRI)提取质粒DNA的机理研究生物科学 级 余泓漾指导教师 杨婉身 教授单 志 助教(硕士)摘要:本文就质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面的可逆化吸附行为做了相应的试验研究和理论探讨。分别考察了不同PEG浓度梯度对SPRI法和PEG静置沉降法提取质粒DNA的影响。通过比较发现质粒DNA在纳米磁性粒子表面的吸附受PEG浓度的影响很大当PEG浓度高于时质粒DNA在粒子表面大量吸附而对于PEG静置沉降法此临界浓度为说明质粒DNA在羧基粒子表面的可逆化吸附行为与DNA脱水有关,并受表面羧基的影响。羧基与带负电荷的DNA之间可能通过Na形成静电桥而相互吸引使得质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面大量吸附。关键词:SPRI,PEG,质粒DNA,固相载体,静置沉降法 TheMechanismStudyofPlasmidDNAabstractionbasedonSPRI YUHongyang BiologicalScience,GradeDirectedby YANGWanshen(ProfPhD)Abstract:Inthisarticle,westudiedthemechanismofplasmidDNAreversibleadsorptiononthesurfaceofcarboxylgroupfunctionalizedmagneticnanoparticlesTheeffectofPEGconcentrationonbothSPRImethodandprecipitationmethodwascomparedandwefoundthatthePEGconcentrationhaveastronginfluenceontheadsorptionofplasmidDNAonthemagneticnanoparticlesThecriticalpointofPEGconcentrationfortheprecipitationmethodwas,otherwise,thevalidconcentrationforSPRIwasThisimplyedthatthereversibleadsorptionofplasmidDNAtothesurfaceofmagneticnanoparticlerelyedonDNAdehydrationandaffectedbythepresenceofthecarboxygroupsurfaceApossibleexplanationwasNawhichinducedthestaticattractionbetweencarboxylgroupandnegativelychargedplasmidDNA Keywords:SPRI,PEG,PlasmidDNA,Solidphase,Precipitationmethod细胞及各种生命大分子如核酸、蛋白质和多肽等的分离纯化是生命科学各研究领域必不可少的环节。分离纯化技术的高低对整个生物科学的发展有着举足轻重的作用。细胞裂解后经离心所得到的质粒DNA粗提液一般来说不能直接供分析使用而需要经过一定的纯化步骤以得到相对较纯的质粒DNA。传统的DNA纯化方法多基于层析和离心沉降特别是当今众多的商业化DNA提取试剂盒将该特点发挥到了极至。但传统的方法需要层析柱、有毒试剂(如苯酚)和昂贵的离心机费力、费时投入大而且不利于简化操作。利用磁性载体分离纯化质粒DNA近几年来得到各国科研人员的重视。与传统方法相比磁性载体法具有很大优势:首先对离心机依赖程度大大降低甚至可以免去离心其次操作简单有时可集所有操作于一只离心管中完成中间只涉及到几种试剂的添加第三可实现微量分析要求且得到的质粒DNA可不经洗脱而直接用于PCR。此外磁分离法操作缓和有利于保证DNA完整性。 由于磁性载体的表面性质不同其分离纯化原理也不一样。其中基于固相载体可逆化固定(solidphasereversibleimmobilizationSPRI)的分离纯化方法得到了广泛的研究和应用(如dynal和agencourt公司的DNA磁性粒子HGP测序任务的三分之一都是借助agencourt的产品完成的)。在一定浓度的PEG和盐离子环境中DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁性微球的表面该吸附过程是可逆的在适当的条件下结合的DNA分子可以被洗脱回收。然而羧基高分子表面结合DNA的原理至今还不甚清楚关于这方面研究也鲜见文献报道。本研究通过设置一系列的PEG浓度梯度以研究质粒DNA在羧基化纳米磁性粒子表面的吸附状况。吸附多少以质粒DNA的产量来表示。作为对照在不添加该磁性粒子的条件下研究了不同PEG浓度梯度下静置沉降法对质粒DNA提取量的影响。并对静置沉降法和SPRI法中PEG的浓度变化对质粒DNA回收的影响做了比较和理论探讨。材料与方法试剂与仪器 大肠杆菌JM(携带pETb质粒大小bp)LB液体培养基(蛋白胨酵母提取物NaClpH高温灭菌后补加氨卞青霉素到ugml)LB固体培养基(蛋白胨酵母抽提物琼脂NaClpH高温灭菌后补加氨卞青霉素到ugml制成斜面)SolutionA(pH):mMTrisHCl(pH)mMEDTA (pH)ugmlRNase℃保存SolutionBmMNaClSDSSolutionC(pH)MkOAc℃保存结合液(多种浓度PEG和NaCl的混合溶液NaCl浓度为MPEG浓度梯度分别为、、、、、、、(WV))mgml羧基磁性纳米粒子分散液(自制悬浮于pHTE溶液中)×TBE(Trisg硼酸gEDTANa·HOg加ddHO至ml高压湿热灭菌℃保存备用)×loadingbuffer(溴酚蓝。二甲苯氰FF(WV)蔗糖水溶液)乙醇pHTE(mMTrisHClmMEDTA)pHTE(mMTrisHClmMEDTA)GoldviewDNA分子量标准(markerⅣ)琼脂糖。蛋白核酸检测仪(BR)DYYⅢB稳压稳流电泳仪DYC型水平电泳槽GelDocTMXR凝胶成像系统(BIORAD)HMB磁分离架BSS电子天平HZQF全温震荡培养箱SWCJFD洁净工作台MicroliteRF高速冷冻离心机(Thermoelectron)TGLG台式离心机YXA手提式不锈钢蒸汽消毒器制冰机碎冰机Finnpipette移液器(ulululml)各种常用玻璃器皿如三角瓶、量筒、容量瓶、烧杯、培养皿、玻璃棒、EP管等分子生物学耗材。菌种活化挑选一环冷冻保存的JM菌种接种于含ugml氨卞青霉素的LB固体平板上℃培养过夜。挑取活化以后的单菌落接种于含ugml氨卞青霉素的LB固体斜面上过夜培养并冷冻保存。细菌增殖从斜面上挑取一环细菌加入到含ugml的氨卞青霉素的LB液体培养基中于℃rpm摇床中培养小时。菌体裂解取ml培养液于一无菌离心管中室温下rpm离心min弃上清。将细菌沉淀重悬于ul预冷的SolutionA中移液枪吹打使菌体分散。再加入ul新鲜配制的SolutionB枪头缓和搅动周混匀随后冰浴分钟溶液变黏稠。随后加入ul预冷的SolutionC枪头缓和搅动数周混匀直到见白色絮状沉淀并冰浴min。接下来rpm冷冻离心分钟。将离心所得的粗提液(共管。每管约~ul)转移到一ml离心管中混合混匀。静置沉降法最适条件的优化静置时间质粒DNA产量的影响在mlEP管中加入ul粗提液和ulPEG()NaCl(M)溶液℃孵育。孵育时间分别为min、h、h、h、h、h、h。(每组管取平均值)待孵育完成将EP管置于冷冻离心机中rpm(℃)离心min得到质粒DNA沉淀。小心用枪头吸掉上清液。加入ul乙醇洗涤min小心吸出乙醇室温放置min待乙醇挥发完毕。加入ulTE溶解质粒DNA。取部分样品分别做电泳和吸光度鉴定。离心时间对质粒DNA产量的影响在mlEP管中加入ul粗提液和ulPEG()NaCl(M)溶液℃孵育。孵育完成后rpm冷冻离心离心时间分别为、、、、和min(每组管取平均值)。离心完毕用枪头小心吸出上清液再加入乙醇ul洗涤min并吸出乙醇。室温放置min。待乙醇完全挥发后加入ulTE溶解质粒DNA。取部分样品作琼脂糖凝胶电泳和吸光度检定。PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响在mlEP管中加入粗提液ul和ulPEGNaCl溶液(NaCl浓度为MPEG浓度梯度为、、、、、、、(WV))在℃冰箱中孵育。孵育完成后rpm冷冻离心得到质粒DNA沉淀。小心用枪头吸出上清液再加入乙醇ul洗涤min小心吸出乙醇室温放置min待乙醇挥发完全。加ulTE溶解质粒DNA。取部分样品作琼脂糖凝胶电泳和吸光度检验。PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响在mlEP管中加入粗提液ul和ulPEGNaCl溶液(浓度梯度与静置沉降法相同)以及体积(ul)的纳米磁性粒子分散液(每组管取平均值以减小试验误差)混匀。在室温下孵育min后磁分离吸掉离心管中的上清液。此时DNA纳米粒子复合物紧贴在管壁上。用ul乙醇清洗min磁分离后吸出乙醇溶液。室温下放置min待乙醇挥发完毕后在该EP管中加入ulTE(pH)溶液在室温下洗脱min此时DNA溶解到TE溶液中。磁分离将DNA溶液转移到另一洁净离心管中取部分样品分别做电泳和吸光度鉴定。不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响方法同PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响一样只不过提取过程中不添加自制的羧基纳米磁性粒子。琼脂糖凝胶电泳和吸光度测定取ul样品做电泳检测胶的质量分数为缓冲液为×TBE。吸光度在蛋白核酸检测仪上测定分别测定样品在nm和nm下的吸光度并计算AA比值。.结果与分析静置时间对沉降法提取质粒DNA产量的影响沉降时间在很大程度上决定了DNA沉淀情况。研究表明要使DNA沉淀量达到%以上一般至少需要h。为了尽可能用较短的时间达到较大的DNA沉淀量我们考察了不同沉降时间下的质粒DNA产量。从图中可以看出电泳条带的亮度随孵育时间的增加而变亮表明质粒DNA的回收率随孵育时间的增加而提高。较长的时间有利于获得较高的DNA沉淀量但当孵育时间达到小时DNA沉淀量已基本接近最大值孵育时间在小时到小时之内DNA产量变化不大。为节约时间起见选定小时为后期研究的静置孵育时间。图不同沉降时间对质粒DNA回收量的影响Figure EffectofdifferentprecipitationtimeonrecoveryofplasmidDNA(从marker起每个泳道一个实验因素道之间是平行关系、泳道为min、泳道为h,、泳道为h,、泳道为h,、泳道为h,、泳道为h,、泳道为h)离心时间对静置沉降法提取质粒DNA产量的影响离心时间对静置沉降法提取质粒DNA产量的影响如图和表所示。从中可以看出离心时间在min到min之间质粒DNA的回收率随离心时间的增加而提高在离心时间为min之时DNA回收率最高。但当离心时间超过min后回收率反而有所下降其具体原因有待进一步研究。因此为提高效率和质粒DNA收率起见选定min为后期研究的离心时间。图静置沉降法提取质粒DNA不同离心时间回收DNA的电泳图Figure RecoveryofDNAunderdifferentcentrifugaltimebasedontheprecipitationmethod(marker两边为一组平行实验从号泳道至号泳道离心时间分别为minminminminminmin)表静置沉降法提取质粒DNA不同离心时间回收DNA的分光光度结果Table spectrophotometricanalysisofpurifiedDNAunderdifferentcentrifugaltimebasedontheprecipitationmethod离心时间(min)AAAA    .PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响在上述选定的最适条件下(沉降时间h离心时间min)我们考察了PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA的影响其结果如图所示。从图可以看出在给定的PEG浓度范围内()质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大在PEG浓度和之间的变化尤其明显PEG下的回收率远远高于PEG下的回收率也就是说质粒DNA沉淀量在%时出现了一个跃迁。其后随着PEG浓度的增高DNA产量趋于恒定。图在不同PEG浓度下由静置沉降法提取质粒DNA电泳图Figure ElectrophoresisofpurifiedDNAunderdifferentPEGconcentrationsbasedontheprecipitationmethod(marker两边为一组平行实验从号泳道至号泳道PEG浓度分别为、、、、、、、(WV)).PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响为了探究SPRI法中质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面可逆化吸附的驱动力进一考察了PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响。结果如图和表所示。从中可以看出在到的PEG浓度范围内质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大在和的PEG浓度之间变化尤其明显PEG下的回收率远远高于PEG下的回收率即DNA产量在PEG浓度为%出现了一个跃迁。但PEG浓度超过%后伴随着PEG浓度的增高DNA产量反而有所下降。紫外分光光度结果也支持此结论。A从跃迁到充分说明了这两个浓度之间存在着DNA收率跃迁。图PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收DNA后的电泳图Figure ElectrophoresisofpurifiedDNAunderdifferentPEGconcentrationsbasedonSPRImethod(marker两边为一组平行实验从号泳道至号泳道PEG浓度分别为、、、、、、、(WV))表在不同PEG浓度下静置沉降法提取质粒DNA分光光度结果Table spectrophotometricanalysisofpurifiedDNAunderdifferentPEGconcentrationsbasedonSPRImethodPEG浓度(WV)AAAA    不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响图PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收DNA后的电泳图Figure ElectrophoresisofpurifiedDNAunderdifferentPEGconcentrationsbasedonSPRImethodwithoutintroductionofmagneticnanoparticles为了确定SPRI法提取质粒DNA时DNA是否吸附到EP管壁上特设计不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响实验。结果如图所示。从电泳图中可以看出在给定的PEG浓度范围内没有条带存在说明质粒DNA不能吸附到EP管表面而被回收。.讨论.静置沉降法中孵育时间和离心时间的确定关于静置沉降法JohnTLis等的研究结果表明DNA的分子量大小和浓度、PEG浓度、盐离子浓度、以及孵育时间和离心时间对DNA的回收都具有重要影响其中PEG浓度是决定性因素。其它条件满足时对于一定分子量的DNA来说只有当PEG浓度达到某一定值(沉淀临界点)以上DNA才能显著沉淀。DNA浓度越高、孵育时间和离心时间越长则DNA沉淀量越大。高离液序列盐如NaCl、MgCl、盐酸胍等有利于促成DNA沉淀。如Na具有很强的水化能力在DNA溶液里面Na能竞争跟水结合破坏DNA表面的水化层中和其电荷使DNA的胶体学稳定性遭到破坏。考虑到本实验质粒DNA均来自同一菌种并用同样的方法裂解粗提大小和浓度相同为了获得较大的DNA回收量应当首先确定合适的孵育时间和离心时间最后再确定PEG浓度对该质粒DNA回收的影响(为减小工作量本文所用Na离子浓度定为一较高浓度值M)。由于PEG溶液具有相当的粘稠度所以与DNA粗提液的充分混合及作用需要一定的时间过程。从实验结果看出对于Kb的质粒DNA来说小时的孵育时间足以沉淀大部分DNA延长时间无益于提高DNA回收率。不同的片段大小的DNA其离心时所受到的离心力不同较充分的沉淀DNA所需要的时间需要由实验进一步确定。经过长时间的孵育处理DNA物理性质改变而易于沉降。较强的离心力场有利于DNA在粘稠的PEG溶液里沉淀聚集。实验结果表明此最佳条件为g的离心力场下离心min。.PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响及机理本实验为避免NaCl的干扰采用较高的NaCl浓度(M)。PEG浓度对DNA回收的影响如图所示。在PEG浓度范围内质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大,但在PEG浓度-之间出现了一个跃迁PEG浓度为下的回收率远远高于下的回收率说明DNA收率在PEG浓度%时出现一个临界值。静止沉降法临界点的出现是DNA在PEG影响下沉淀状态的反应。在溶液中DNA的存在状态与PEG的浓度存在一定关系。在低盐和低PEG混合溶液中DNA分子构象为B型以无规则卷曲存在但当PEG浓度达到一定临界值时DNA分子突然压缩流体力学性质发生改变而易于在离心力场下沉淀。.PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响及机理PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA和静置沉降法的影响基本一致也出现一相似的规律。从电泳图中可以看出在到的浓度范围内SPRI法提取质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大在PEG浓度时DNA收率明显出现一个突越即PEG是影响DNA收率的临界点。这说明在SPRI法提取质粒DNA时PEG对DNA在溶液中存在状态的影响是相同的即:在低盐和低PEG混合溶液中DNA分子呈伸展的链状存在但当条件改变时DNA会折叠成紧凑的螺旋状结构。VVVasilevskaya研究表明当PEG浓度达到某一临界值是会发生DNA构象非连续的突变发生凝聚。DNA构象的改变能使整个DNA水溶液系统的能量处于最低从而达到稳定状态。GerdKleideiter等研究表明DNA的电荷量DNA的弯曲以及溶液中相关正离子的变动是引起DNA构象变化的主要原因。当DNA上所带的电荷有被中和时这种非连续性的构象变化会突然发生流体力学性质也因此发生改变而这种变化与PEG和NaCl的浓度有关。但PEG浓度对两种提取方法的影响存在两个异同点。首先临界点的出现SPRI法中不再是而是有所降低为%其次在的PEG浓度下DNA的回收量有所降低。DNA的回收量降低的原因很容易得到解释:其一随着PEG浓度增加溶液黏性增强粒子扩散受阻在较短的时间内造成吸附不充分其二PEG黏性的增强也导致在磁场下粒子的回收率有所下降而降低DNA产量。关于临界点的改变我们认为与体系中纳米磁性粒子的存在有关磁性粒子的存在是导致PEG临界点降低的主要原因。在高离液序列盐的存在下DNA分子可特异性吸附到Silica膜(主要成分为SiO)上当今众多的商业化DNA提取试剂盒就是基于这一原理设计的。SiO经活化后可在表面产生大量的羟基这些功能基团对DNA分子特异性吸附是必不可少的。目前普遍认为带正电荷的Na或Mg等离子在带负电荷的DNA和表面羟基之间充当了“电桥”角色使DNA在表面特异吸附而得以分离纯化。高分子表面的羧基与Silica膜羟基表面具有类似性质在一定条件下都带负电荷。因此基于SPRI法中PEG临界点变小和DNA只能在羧基磁性粒子表面吸附而不能在EP管吸附这两点出发我们认为羧基高分子表面吸附DNA原理同Silica相似:较高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去胶体学稳定性破坏构象也随之改变带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面带负电荷的磷酸基团通过Na与羧基形成“电桥”使得DNA被特异吸附到羧基高分子表面其示意图如图所。Cationbridge图 羧基高分子表面与DNA结合示意图FigureschematicdiagramfortheadsorptionofDNAonthecarboxylatedsurface羧基修饰的高分子磁性微球表面对DNA特异吸附是可逆的当高浓度的PEG和高离液序列盐除去后DNA构象及其它物理学性质又得以回复因而使得DNA洗脱成为可能。当然羧基高分子表面结合DNA的原理还需要其它试验进一步证实因为DNA在溶液里面不仅要与PEG和盐离子发生作用还要同羧基高分子表面发生作用具有相当的复杂性。比如调整溶液的pH以调节羧基的电离状态使羧基的带电量发生变化来研究其吸附DNA能力变化情况。参考文献:DeggerdalA,LarsenFRapidisolutionofPCRreadyDNAfromblood,bonemarrowandculturedcells,basedonparamagneticbeadsJBiotechniques,,():HawkinsTL,O’ConnerMorin,RoyAetalDNAPurificationandisolationusingasolidphaseJNucleicAcidRes,,,PartI张志超袁翠等磁性二氧化硅微球的表面修饰及其在植物基因组核酸纯化中的应用J分析化学研究报告年月卷李文兵,周蓬蓬,余龙江等生物相容Fe磁性纳米颗粒的合成及应用J现代化工,年月,第卷增刊单志,杨婉身张旭等正交实验法优化羧基纳米磁性粒子的合成条件J绵阳师范学院报():  GerdKleideiter,EckhardNordmeierPoly(ethyleneglycol)inducedDNAcondensationinaqueousmethanolcontaininglowmolecularweightelectrolytesolutionsJTheoreticalconsiderations()–VictorABloomfieldDNACondensationbyMultivalentCationsJNucleicAcidScience,SubmittedSeptember,JanaKˇr′ˇzov′aa,AlenaˇSpanov′aa,BohuslavRitticha,etalMagnetichydrophilicmethacrylatebasedpolymermicrospheresforgenomicDNAisolationJJournalofChromatographyA,()–JohnTLisFractionationofDNAFragmentsbyPolyethyleneGlycolInducedPrecipitationJMethodsinenzymology,VOL,,,陈晓东陶志华王忠永等PEG沉淀提取法在提取HBVDNA中的应用J《临床检验杂志》,年第期:VVVasilevskayaaCollapseofsingleDNAmoleculeinpolyethyleneglycolsolutionsJTheoreticalconsiderations()单志羧基功能化纳米磁性粒子的合成、表征及在质粒DNA纯化中的应用学位论文四川雅安四川农业大学钟文涛,洪美亚,龚兴国大分子拥挤对DNA结构的影响J细胞生物学杂志,:霍家佳DNA结构的分析及其应用的探讨J《信息安全与通信保密》,年第期:李彦明,张映,关志刚遗传的物质基础DNA结构的多态性J《生物学通报》年第期:致谢:本文是在导师杨婉身教授和单志老师的悉心指导下完成的。两位老师在繁忙的教学和科研工作中抽出许多宝贵的时间和精力对实验的选题、实验设计以及论文写作等许多细节均进行了细致的指导在此忠心地向他们表示感谢。特别感谢单志老师在实验过程中的严格要求和无微不至的关怀及指导。感谢生化实验室的师兄师姐以及一起完成毕业实习的同学们在实验中给予的帮助。最后感谢我的父母及亲人他门对我的学业和理想给予了无私的奉献和最大的理解、支持。四年的学习生活让我难忘也让我真正的成长懂事。在未来的学习生活里我会在热爱的生物领域中一如既往坚持不懈地努力。

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