基因工程技术 笔记整理

基因工程技术 笔记整理 基因工程技术: 按照人们的愿望， 进行严密的设计， 通过体外 DNA 重组和转移等技术， 基因工程技术: 有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1-200kb 不等，为双链、共价闭合环状 质粒 DNA 分子 cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。 质粒在细胞内的复制一般有二种:紧密控制型(stringent control)和松弛控制型(relaxed control) 前者只在细胞周 期的一定阶段进行复制， 。 通常每个细胞内只含有一个或几个质 粒 分子;后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中 有许多拷贝。 质粒的不相容性:利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 质粒的不相容性 从细胞中分离质粒 DNA 的方法 的方法都包括 3 个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂 细胞中分离质粒 解细胞;分离和纯化质粒 DNA。 溶菌酶:破坏菌体细胞壁;SDS 和 Triton X-100:使细胞膜裂解。 溶菌酶 染色体 DNA 通常用于构建基因组文库和 Southern 杂交等。 基因组 DNA 的提取 提取:提取缓冲液(Tris.Cl― 保持 pH,EDTA,NaCl,SDS) ，氯仿/戊醇/ 植物基因组 DNA 提取 乙醇溶液―沉淀和抽提 DNA，异丙醇―沉淀 DNA(提染色体) ，TE(Tris.Cl,EDTA)--溶解 DNA，RNase―保存液，降解 RNA，NaAC―加盐，70%乙醇―漂洗。 提取: 细菌基因组 DNA 提取:SDS，蛋白酶 K，氯仿:异戊醇(24:1)-- 沉淀 DNA，苯酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1)-- 抽提，70%乙醇―漂洗，TE,NaCl―调节离子强度，RNase A， CTAB/NaCl 溶液―CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多 聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇―沉淀上清液。 总 RNA 制备 mRNA 的分子结构容易受到 RNA 酶的攻击反应而降解，加上 RNA 酶极为稳定而且广 泛存在，因此，在提取过程中应严格防止 RNA 酶的污染并设法抑制其活性 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败 防止 的关键。仪器―玻璃器皿:200?烘 2h，塑料器皿:DEPC 水液处理―所有器皿最后硅烷化 处理。 RNA 酶抑制剂:DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物;异硫氰酸胍 酶抑制剂: 异硫氰酸胍-异硫氰酸胍 最有效，使 RNA 酶失活;其他 RNA 酶蛋白抑制剂(RNasin)SDS, 尿素等。 其他-其他 制备方法:异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS 法、Trizol 法。 (均先将组织 细胞内总 RNA 制备方法 在液氮中研磨成粉末) 异硫氰酸胍热苯酚法:异硫氰酸胍(GIT)与β,巯基乙醇共同作用抑制 RNase 的活性， 异硫氰酸胍热苯酚法 GIT 与 十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS 法:用酚和 SDS 破碎细胞和去除蛋白质，用 LiCl 选择沉淀 RNA 以去除 DNA 和其它不纯物。 Trizol 法:Trizol 试剂(含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等) 。 mRNA 提取 原理: 分离的总 RNA 可利用 mRNA3’ 端含有 poly(A)的特点， oligo(dT) 用 制备 mRNA 原理: 纤维素柱分离，当 RNA 流经 oligo(dT)纤维素柱时，在高盐 高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异的 高盐 吸附在 低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA 被 吸附 oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐 低盐 洗下。然后经过两次 oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。纯化的 mRNA 在 70% 洗下 乙醇中-70?可保存一年以上。 (上样 buffer 和洗脱 buffer) 溶液中无盐时要沉淀 RNA，必 。溶液中无盐时要沉淀 ， 须加盐 NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA 凝胶电泳:琼脂糖 分离 DNA 片段大小范围广;聚丙烯酰胺 小片段，分辨力 凝胶电泳:琼脂糖-;聚丙烯酰胺-高。 琼脂糖凝胶电泳特性:1.DNA 分子大小:DNA 分子在一定琼脂糖浓度下的迁移率;2. 琼脂糖凝胶电泳特性 琼脂糖浓度:1.0-1.2%;3.DNA 分子构象:超螺旋 DNA 最快，线状双链最慢;4.电源电压: 不大于 5V/cm，负―正;5.染料:溴化乙锭(EB)--强诱变剂;6.离子强度:0.5*TBE(不 能过高，避免 buffer 发烫) 。 RNA 凝胶电泳:RNA 分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏 RNA 中的二 凝胶电泳: 级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的 mRNA 分子。 RNA 琼脂糖凝胶电泳方法有三种 琼脂糖凝胶电泳方法有三种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞(剧毒 剧毒) 剧毒 琼脂变性电泳。 DNA 限制性内切酶 制性内切酶: 限制性内切酶:限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链 DNA。 I 类酶:结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的 DNA;II 类酶:由二种酶分子 类酶: ; 类酶: 组成的二元系统(核酸酶―切割、甲基化酶―修饰) ，其识别位点和切割位点是同一位置; ; III 类酶:在识别位点之外切割 DNA 分子，然后从底物上解离。甲基化:保护 DNA 分子， 类酶: 越活跃的地方，甲基化程度越低。 切割性能: 切割性能:回文对称特异核苷酸序列、平末端 DNA 片段、粘性末端。 酶单位: 酶单位:在合适缓冲液和反应温度下，在 20ul 反应体积中一小时内完全降解 1mg DNA 所需要的量。 载体: 载体:把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁 殖和 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的工具。常见载体:质粒、λ 噬菌体、粘粒、BAC、YAC 等。 质粒载体的特性:分子量小、多拷贝、松弛控制型;具有多种常用的限制性内切酶的 质粒载体的特性 单切点;能插入较大的外源 DNA 片段;具有容易操作的检测表型。 pBR322、pUC18/19(分子量更小、α-互补原理―蓝白筛选、多克隆位点区 MCS) 、 pBluescript SK(+/-)(MCS) 。 乳糖操纵子: 互补原理: α-互补原理:lacZ(β-半乳糖苷酶基因)基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有 互补原理 ( ) 完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象。 蓝白斑筛选:X-gal-----IPTG(乳糖类似物―诱导剂)--------蓝色吲哚产物 蓝白斑筛选 (当外源片段插入后，失去 α-互补能力，因而不产生 β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的 乳糖，菌落呈白色) 。 λ 噬菌体 噬菌体:侵染细菌的病毒(裂解性侵染、溶源性侵染) 。 【碱性磷酸酶--活性好, 但较抗热和去污剂,在去磷酸化反应后很难去除】 细胞转化 转化( 细胞转化(transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性 ) 状的一种手段(E.coli) 。 【如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄