叶绿体色素的提取、分离，测定叶绿素a、b含量
ab
刘家富（40508014） 05生科（一）
1.脂溶性叶绿体色素提取：
可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离：
（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各
种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度
不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各
物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。
（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱
起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶
绿素与类胡萝卜素分开。
3.叶绿素a、b含量的测定：
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度
L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数)因此，根据叶绿体色素提取液对可见
光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用
公式
小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载
即
可计算出提取液中各色素含量。
测定663nm和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、
b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。其校正过的公式为：
C＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/L a
C＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/L b
CT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L
剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试
管、毛细管、平底大试管、石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水
硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液、天平、研钵、滤纸
1. 叶绿体色素的提取
取去中脉叶片（2g左右），剪碎后加入少量石英砂、碳酸钙、纯丙酮5ml后
放入研钵研磨成匀浆成深绿色提取液，之后用漏斗过滤。
2.叶绿体色素的分离（纸层析法）
?制备：
长条滤纸(宽2*20cm)，将其一端剪去两侧，中间留一0.5*1.5cm的窄条。
?点样：
用毛细滴管吸取叶绿素溶液在窄条的上方点样(少量多次), 在平底试管中
加推动剂3-5mL(四氯化碳+少量无水硫酸钠)，把长条滤纸一端挂在橡胶塞
下的大头针上，调节长度使纸条下端的窄条浸入推动剂中，注意色素点不
可浸入。
?观察：
等到推动剂扩散至滤纸条上沿约2cm时,取出滤纸，铅笔标明推动剂边缘，
观察分离后色素带的分布。
3.叶绿素的理化性质
?荧光现象观察
取上述色素丙酮提取液少许于试管中，观察在反射光和透射光一侧提取
液的颜色有无不同。
?铜代反应
取上述色素丙酮提取液少许于试管中，逐滴加入浓盐酸，直至溶液出现
褐绿色；此时再加入醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液。
仔细观察，记录实验现象并解释原因。
4.叶绿素和类胡萝卜素的分离（皂化作用
取色素提取液（约10ml）放入加了10ml乙醚分液漏斗中，再加入20ml
蒸馏水摇动。静置一会，溶液分两层，上层为色素＋乙醚（用蒸馏水冲
洗1~2次），下层为丙酮＋水（弃去）。然后再加入5ml 30%KOH甲醇溶
液用力摇动静置10分钟后加入5ml蒸馏水摇动静置分离，溶液分为两层。
5. 叶绿素ａ和ｂ含量的测定（分光光度法）
?称取新鲜叶片（避开叶脉）0.5g，加纯丙酮3ml和少许碳酸钙、石英沙
研磨成匀浆，转入离心管，用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，
离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至10ml。
?取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml，混匀后转入比色皿，以80%
丙酮为参比，分别测定663nm、645nm处的光密度值。 6.照公式计算色素提取液中叶绿素a/b以及a+b的浓度；再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。
波长 吸光度 Ca＝12.7A663－2.69A645
Cb＝22.9A645－4.68A663
645nm A645=? CT＝Ca + Cb
＝8.02A663+20.21A645
663nm A663=?
叶绿素含量（mg/g） =（ CT ×提取液体积×稀释倍数）?样品鲜重或干重
1.层析时应尽量不使滤纸条边缘贴壁
2.液漏斗的正规操作
3.机溶剂的使用必须注意安全！
4.光光度计的正规操作
（1）纸层析法的结果
（2）叶绿体的荧光现象
（3）铜代反应
1
2
3 （4）皂化反应
:
1
2-KOH
35mL
4+
（5）叶绿素a、b含量的测定
645 A645=0.119 663 A663=0.344
Ca=12.7A663-2.69A645=4.05469mg/L
Cb=22.9A645-4.68A663=1.1083 mg/L
CTCa + Cb
8.02A663+20.21A645
=5.163 mg/L
mg/L=C
=0.5163mg/g
1.
2.ab
3
讨论：
（1） 纸层析法的问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
：
失败分析：1.在实验过程中2g的菠菜加入了15mL的丙酮，这样的色素浓度不
高；
2．在浓度不高的前提下，层析法又只是在滤纸片上点上一点，重
复多次，显然该点所具有的色素很少；
3.在剪纸方面相成的“凸”形，这样无形的给推动剂设置了一道不
可逾越的“坎”，使得ccl4的推动能力下降，多个小组的ccl4均不
能到达上沿1.5—2.0cm处；
4.滤纸过长，推动剂推动上去很困难。
修改
意见
文理分科指导河道管理范围浙江建筑工程概算定额教材专家评审意见党员教师互相批评意见
：针对浓度低，可以在第二次加入5ml丙酮；针对点一点太少。可以
划一条线（该线需直）；针对有“坎”，可以将“凸”改为三角形的
缺口，只是顶端不是完全尖状；针对滤纸过长，可以将20cm换为
15cm。（参考高中人教版生物教材）
(2) 怀疑：经过实验，证明了色素的荧光现象，铜代反应，叶绿素的皂化反应。
但是本实验根本不能证明荧光现象是叶绿素的，铜代反应也是叶绿
素的，因为我们使用的丙酮提取液，其包括类胡萝卜素。 补充意见：皂化反应实现了叶绿素和类胡萝卜素的分离，故可以补充如下：
将皂化反应得到的上层黄色层（乙醚+类胡萝卜素）用来重复本实
验的“荧光现象观察”，“铜代反应”步骤。
若没有观察到“荧光现象”，“铜代反应”，方可证明本实验的结果是叶
绿素的作用现象，而不是类胡萝卜素的现象。
浙公网安备 33021202002483