综述：组织切片的体视学分析——二维平面到三维空间的定量形态计量术（可编辑）

综述：组织切片的体视学分析——二维平面到三维空间的定量形态计量术（可编辑） 综述:组织切片的体视学分析——二维平面到三维空间 的定量形态计量术 维普资讯 ??48?? 美中国际创伤杂志 2006年3月第 5卷第 1期 U(S(CIJT，March2006，Vo1(5，No1 ?? 综述?? 组织切片的体视学分析―― 二维平面到三维空间的定量形态计量术 王海强 韩一生 闰铭 王军 综述;李明全 审校 对器官、组织和细胞等结构进行切片，观察其 分析中，对于一随机的组织切片图象，随机的放置 一 显微和超微结构，是常用的组织学方法。而在显微 检测系统，此检测系统包含由一系列的点、线或 镜下计量组织或细胞的三维空间结构，则是一个较 平面组成的指针 probes ，通过指针和组织切片图象 棘手的问题，因为组织的部分空间结构信息在切片 间的相互作用而记录相应的事件结果。指针和组织 的过程中丧失。针对此问题，本文拟对体视学分析 切片图象间的相互作用而记录相应的事件包括:? 的产生、演变、近年来的发展及其应用做一方法学 落入所研究结 构的点的数 P ;? 线指针和穿过所 的综述。 研究结构的 线之间的截面间线 intersections 的数 目 I ;? 所用平 面指针中的结构的横截面的数目 Q ; 1 体视学 StereoJogy 的产生及演变 ? 所用的体积指针中三维结构的数目 N 。检测指 在六十年代，文献中散在的牵涉到现称为体视 针的参数为:PO 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 中点的总数 ，L0 线的总数 ，A0 学的领域技术和方法为人们注意而汇集起来，体视 总面积 ，vo 总体积 。于是，由检测指针中我们得 学因而在 1967年被提出„，其原始定义为，“体视学 到: Pp--P,PO 是一门将二维切片上获得的数据和对应的三维结 IL I,L0 构参数联系起来的数学方法”。此定义表明了体视 NA N,A0 学是显微镜下计量的基本方法。其基本思想在于由 NV N,V0 器官、组织和细胞获得的组织切片是相应结构的一 个样本，因此可借助于恰当的统计学方法通过对样 这些等式将指针中的记数和三维结构的几何性质 本 组织切片 的测量而得到总体f相应的器官、组织 结合起来，是体视学中的基础。而对于参数密度， 和细胞 的结构的参数。体视学的方法既是数学方 有: 法，其理论基础为几何概率或积分几何[2l。基本的方 Vv 1 法一经建立，近四十年来体视学取得了无可争议的 1,2Sv 2 1,2Lv 3 发 展 ， 并 行 成 了与 经 典 的 体 视 学 fClassical Nv 4 Stereology 相对应的新体视学 NewStereology1。 在这里，等式 1 即表示指针中点分数 Pp的期望值 2 体视学中常用的参数和符号 等于三维结构的体积分数，同样的意义适合于等式 在体视学中，结构可描述为体积 Volumes。v 、 2 、 3 和 4 。同样的，这些等式将指针中的记数同三 面积 Surfaces，S 、长度 Lengths，L 和数量 Numbers， 维结构的密度参数联系了起来，亦是体视学分析的 N ，而结构的浓度或密度 ，则以一参考体积单位来 基础。这样，通过对组织切片图象的记数，就可以得 衡量，表示为 V,V。S,V，L厂v，N,V 通常记为 Vv，Sv，Lv， 到相应的三维结构的参数了口1。 Nv 。这些参数又有其代表符号，Vv i,ref ，Sv i,ref ，Lv 3(2 经典的体视学分析的应用举例 经典的体视学分析，其基于上述基本的原理和 i,ref $13Nv i,ref 。其中i代表要研究的结构部分，ref 表示其参考体积单位_31。 等式的基础上的点记数，通常可由铅笔和纸即可胜 任，在估计体积和面积方面是简单、廉价和有效的[41， 3 经典的体视学 至今仍有应用，如 ShevtsovVI等_5j利用 Ilizarov模型 3(1 经典的体视学的基本原理 在典型的体视学 观察张应力对肌筋膜组织的血管新生的影响，对肌 肉的组织切片进行了体视学分析。通过采用由78 条线指针、156个点指针构成的短线晶格『31加于切片 作者单位:710032 西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所 维普资讯 美中国ff,ji~,J伤杂忠 2006年 3月第 5卷第 1期 U(S(CIJT，March2006，Vo1(5，No1 ‘49‘ fNorthpole1。所有的组织切片必须包含此方向，并可 上，在放大 480倍的光镜下检测了微血管的个数密 在所选的视野标记以记数，这样的一系列切片称为 度 Nv、体积密度 Vv、面积密度 sv和面积一体积比 垂直切片I1。在这方面，有两种切片程序可获得垂直 Sv,Nv，而得到了另人信服的结果。在电镜下，经典的 体视学分析亦可应用于超薄切片，只是其指针不同 切片，一种方法是利用定向器 Orientator ，其步骤为 而已【 。 在选定垂直方 向的器官中，系统切片得剑组织块， 随机的挑选两个方 向切片，再由第 个切片的视野 3(3 经典的体视学分析的偏倚 在体视学分析的早期，由于人们的注意力集中于 记数 :另一种方法则来源于对显微结构中的线性 立体关系的建立，对既有方法的扩充以及建立适当的 结构的长度密度的测量 ，切取一系列的垂直薄片， 技术提高其效率，而忽视了体视学应用中的统计学样 以投影显示薄片中线性结构的特征，投影仪上放置 一 直线指针而表示 薄片中的平面指针，一曲线指针 本问题18(91。具体而言，作者所选的组织切片对于相应 的结构而言，是总体中的样本，作者要求样本是各向 对应于将薄片突入曲线的部分取样为曲面状，再放 同性的、同一的、随机的样本 Isotropicuniform ran― 置一 环形线指针，则对应的每个薄片其取样面为拟 定的定向平面上的 正弦加权的平均。 domsamples，IUR样本 。以往所进行的组织切片的立 体分析都是在假设该切片随机的、同一得来源于相应 4(2 样本 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的体视学中的原则 的总体，因而具有代表性。然而，事实上的切片不一定 体视学分析属于定量的形态计量术 Quantita― tiveMorphometry 的分支，作为形态计量术，其中心 满足此假设，从而导致结果的严重偏倚以至失去意 原则为“所有实验中的问题、数据、和阐释必须与真 义。在十九世纪八十年代人们开始意识到这一点，并 开始着手满足于IUR样本的取样方法，而对这一点 实世界生物的三维空间紧密联系”[91。由此，在体视 学分析中作者应把握以下的原则。 的认识则标记着新的体视学分析的产生，称为样本设 计的体视学 Design―basedstereology Iq。 4(2(1 设计基础上取样 一个样本无偏倚指的是 结构中的所有部分 有相等的机率被取样，而解决 此问题最有效、最可靠的方法为随机性的引入，而 4 样本设计的体视学f新体视学 避免认为的随机性的主观臆断。以上所述的系统 4(1 样本设计的体视学取样方法 取样和垂直取样都是获取无偏倚的样本的可靠方 4(1(1 系统切片取样法 系统取样法是避免偏倚， 法 。 得到IUR样本的可靠而有效的方法l】1，其适用于不 4(2(2 严格的数 据处理 由二维的组织切片获取数 同水平的标本的取样过程。例如，对一器官而言，将 器官切为同一的、随机的薄片fSlices ，由薄片中系 据，这些数据包括待研究的结构中细胞的数量，体 积，以及相应的感兴趣的结构密度等。 统的挑选组织块 Blocks ，再由组织块切出平行的、 设定距离的组织切片fSections ，最后置指针于组织 5 体视学分析中的新工具 切片上进行分析。与独立的随机的取样切片相比， 近年来，由于数学统计方法和计算机技术的发 系统取样有其优点，它使得作者对各种生物组织结 展，推动了相关学科的发展，在体视分析领域，其工 构的分析成为可能，尤其对表现出各向异性的组织 具方面的进展可分为硬件f新思路下的检测系统 和 结构，如肌肉，血管，细胞等结构I“1。例如，对独立的 软件f相应的计算机应用软件 的建立。 随机的取样切片而言，要将其误差系数 coefficient 5(1 新的检测系统和方法 oferror1由 1(0降为 0(5，需将原切片量提高到四倍; 5(1(1 Cavalieri 方法 Cavalieri方法提供了所有生 而采用系统取样切片，其切片量只需提高到两倍”卜 ”】 物学结构的体积的估算法„ ，其方法为:对所研究 。 系统取样法有两个基本的要求:沿取样的轴线 的结构，由一随机的起始点开始取样，切为薄片 或 逐个薄片的依次收集数据，用特殊的统计方法计算 切片，视所研究的结构而定，若研究骨的体积为薄 误差系数„J。 片:若为血管或细胞，则为切片 ，脱水和包埋后，依 4(1(2 垂直切片取样法 垂直切片取样法 Vertical 次将一点记数的表格 Grid 放置于上，记数每个薄片 sectionS1是近年来发展的获得无偏倚的体视学估计 中的点数，于是，其体积为: 值的新方法。其原理为:由于用于体视学估计的检 V PxAxkxt 测指针的定向作用fOrientation ，在待研究的器官或 组织中选择一参考方向就十分必要了，特称此方向 其中，P为所有落入薄片中该结构的点数之和，A为 在放大的情况下一个测试点的面积，k是每次所选 为垂直方向，并以次作为所有需定向测量的北极 维普资讯 美中国际创伤杂志 2006年 3月第5卷第 1期 U(S(CIJT，March2006，Vo1(5，No1 了编辑栏 Tutorials 和工具栏 Toolkits ，其编辑栏中 的薄片的个数，t为每个薄片的厚度。Cavalieri方法 不仅适用于大体器官的体积估算，尚可用于可以系 包括了进行体视学分析的各个步骤，而工具栏中则 提供出了用于不同的分析 目的的工具 如Cavalieri 统切片取样的任何结构，包括血管，神经，细胞，细 胞器和分子。 方法，Disector，Fractionator 和适用于不同的组织检 5(1(2 Disector方法可直接记数细胞的数量 ll9】，此 测方法的选项 如免疫组织化学，原位杂交等 ，此应 用软件包 可用来提供对器官、组织、细胞和分子水 方法需要一光学显微镜，录象机，长度量规 Length 平的体视 学分析的最新检测方法和工具。其对硬件 gauge ，无偏倚的记数表和糖甲基丙烯酸树脂包埋 的切片f厚约40微米1。 的要求也较低，只需 IOM的硬盘和一彩色显示器， 在 MS― DOS下运行。 5(1(3 Fractionator其原理较为简单，一个结构系 统的逐渐分为小的部分 smallerandsmallerfrac― 除以上两种应用程序外，近年来尚有新的应用 tions ，直到最后得到一部分 finalfraction，f1，对此最 程序的开发与应用五，在这里不再一一赘述。 后部分作出估算进而返回该结构12Ol。例如估计一结 除对组织切片图象进行体视学分析外，体视学 构中细胞的个数，利用最后部分m和在其中记数的 尚可对其它二维图象进行分析，如MRI等领域。近 细胞数 Number，N ，有 年来 出现的新的仪器在某些领域对体视学分析的地 N 结构中的细胞 fxN f中的细胞 位提出了挑战，也大大丰富了作者的研究方法。如对 在这方面，Wirenfeldt等【21】利用此技术 opticalfrac― 松 质骨结构研究的金标准为在其组织切片上进行体 tionatortechnique ，通过 MAC一1免疫组化的方法 视学分析，Thomsen等[271通过对人胫骨内侧干骺端松 染色可视化，从而计数了小鼠枢椎中小胶质细胞的 质骨结构的研究，对比了三维 microCT与二维切片 的体视学 分析的方法，发现在骨结构的研究方面三 绝对数量，为研究成人中枢神经系统生理、创伤及 疾病状态下小胶质细胞群的动态变化奠定了基础。 维 microCT可替代二维切片的体视学分析的方法。 综上 所述，体视学作为一种形态定量法，是由 5(1(4 同焦显微镜与体视学的结合 1同焦显微镜 大大丰富了体视学分析的方法，并减少了分析中挑 二维结构到三维实体空间结构过渡的桥梁，也是作 者医学领 域中的一个有力的工具，它的产生和发 选合适图象的难度与强度，特别是在新分析软件的 辅助下，对小标本的体视学分析将更便利。Kubinova 展，必将 大大的丰富和推动组织形态学的发展。在 等 利用此技术研究了大鼠骨骼肌纤维中毛细血管 这方面，国外已有了较大的发展，其应用软件也已 网的三维结构，从而为进一步研究各类组织中的血 商品化，而国内则尚待学术界的重视与发展。 管新生 angiogenesisi 现象奠定了基础。 5(2 计算机软件的开发与应用 由组织切片的样 参考文献: [1]WeibelER，Elias H(Quantitative methods in morphometry( 本得来的数据的计算与处理，若由相应的计算机应 SpringerVerlag，Berlin，1967( 用程序来完成，则是高效而可靠的方法。现有的计 [2] KendallMG，MoranPAP(Geometricalprobability[M](Charles 算机技术使之成为现实。目前国外已研制开发出了 Griffin，L0ndon，l963( 这样的应用软件，有体视学工具盒1241和QM2000~91。 [3]WeibelER，KistlerGS， ScherleWF(Practicalstereologiealmeth― 5(2(1 体视学工具盒 StereologyToolbox 体视 odsformorphometriccytology[J](CellBiol，1966，30:23―38( [4] Criz-OriveLM，WeibelER(Samplingdesignsforstereology[J]( 学工具盒是 AppleMacintoshIISeries计算机支持 Microsc，l98l，122:235( 的应用程序，作为整体图象分析和记数系统的一部 [5] BolenderRP(Correlationofmorphometryandstereolog~with 分，它对计算机硬件的要求是，至少 2M的 RAM和 biochemical analysisofcellfractions fJ](IntRev Cytol， 40M的硬盘的 AppleMacintoshIISeries计算机， 1978， 55:247( 录象系统，扫描仪以及显微镜。体视学工具盒使用 [6] Bolenderput'，PaumgartnerD，LosaG，MuellenerD，WeibelER( Integrated stereologie and bioc hemical studies on hepatocytic PICT图象程序，而在 PICT图象程序中最直接的获 membranes: membrane recoveriesin subcellularfractions[J】( 取图象 Capturingimage 的方法为使用 IMAGE程 CellBiol， l978，77:565( 序，IMAGE程序是 Macintosh的公共应用程序，可 [7] IozzoRV，BolenderRP，WightTN(Proteoglycanchangesinthe 进行图象的获取，处理和分析。 intercellular matrix of human colon carcinoma: an integrated 5(2(2 QM2000QM2000开发的目的是使学者们 biochemical andstereologicanalysis[J](LabInves，1982，47f2 : l24-l38( 更方便的得到和使用定量形态分析技术的新工具， 下转第 58页 目前 QM2000已有第二版问世 Version2(0 ，它包含 维普资讯 ??58?? 美中国际创伤杂志2006年 3月第5卷第 1期 U(S(CIJT，March2006，Vo1(5。No1 ?(Trauma，1980，20 1 :71( 斜程度以防滑针的发生。石膏固定宜取前臂旋后 [2] 陆裕朴，胥少汀，葛宝丰，等(实用骨科学[M](第 1版(北京: 人 位，减轻骨块所受的拉力，增加骨折的稳定性。所有 民军医出版社，1998，587―590( 这些都是提高手术治疗效果不可忽视的因素。 [3] 王亦璁，孟继懋，郭子恒(骨与关节损伤[M】(第 3版(北京:人 民卫生 出版社，1995，387―391( 参考文献: [4] AH克伦肖，过邦辅，蔡体栋，等(坎贝尔骨科手术大全[M】(上 [1] EoffreyHorne(Supercondylarfractureofthehumersinadults 海:上海远东出版社，926―928( 业 上接第 50页 [19]GundersenHJG，BaggerP，BendtsonTF，eta1(Thenew stereo― logicaltools:disector，fractionatorand pointsampled intercepts [8]WeibelER(Measuringthroughthemicroscope: developmentand andtheiruseinpathologicalresearchanddiagnosis[J】_Acta evaluationofstereological methods[J](Microsc，1989， 155 Pt3 : PatholMicrobiollmmunolScand，l988，96:857―881( 393-403( [20]GundersenHJG(Stereology ofarbitraryparticles:areviewof [9] BolenderRP，HydeDM，DehoffRT(Lungmorphometry:anew unbiased numberand size estimators and the presentation 0f generation of tools and experiments for organ，tissue，cell，and somenew ones，inmemory ofWilliam R Thompson[J】_Mi― molecularbiology(Am [JJ(Physiol，1993，265:L521―548( crosc，l986，l43:3―45( [10]MayhewTM，GundemenJG(Ifyouassume，youcanmakean [21]WirenfeldtM，Dalmau 1，Finsen B( Estimationofabsolute assoutofu and me:a decade ofthedisectorforstereologi― microglialcellnumbersinmouse fascia dentata using unbiased cal coutingofparticlesin3D space[J](Anat，1996，188 Ptl1: and efficientstereologicalcellcountingprinciples fJJ(Glia， l―l5( 2003，44f2 :129―139( [11]GundersenHJG，JensenEB(Theefficiencyofsystematicsam- [22]HowellK，HopkinsN，Mcloughlin P(Combinedconfocal mi― piinginstereology anditspredictionfJJ(Microsc，1987，147: cmscopy and stereology: a highly efficient and unbiased ap― 229-263( proachtoquantitativestructuralmeasurementintissues[J](Exp [12]WestMJ，SlomiankaL，GundersonHJG(Unbiased stereological Physiol，2002，87f6 :747―756( estimation ofthe totalnumber ofneuronsin the subdivisions [23]KubinovaL，JanacekJ，RibaricS，eta1(Three-dimensional study 0frathippocampususingtheopticalfractionator[J](AnatRec， ofthecapillary supplyofskeletalmuscle fibres using confocal l99l，23l:482-497( microscopy叨(MuscleResCellMotil，2001，22 3 :217―227( [13]Cruz―OriveLM(On thepricisionofsystematicsampling: a [24]HydeDM，MaglianoDJ，ReusE，eta1(Computer―assistednor― review ofMatheronstransitivemethods[J](Microsc，1989，153: phometry: point，intersection，and profile countingand three-di― 3l5-333( mentional reconstructionfJJ(MicroscResTech，1992，21:262― [14]Mattfeldt―T，Mall―G，Gharehbaghi-H，Moiler-p(Estimationof 270( surface area and length with the orientator fJJ(Microsc， [25]XuYH，DraganYP，Campbell―HA，eta1(STEREO:aprogram 1990，159fPt3 :301-317( on a PC―Windows 95 platform for recording and evaluating [15]GundersenHJG，BendtsenTF，Korbo L，eta1(Somenew，simple quantitative stereologic investigations of multistage hepatocar- and efficientstereologicalmethods and theiruse in pathologi- cinogenesisinrodentsfJJ(Comput―Methods―Pmgrams-Biomed， calresearchanddiagnosis[J】(ActaPatholMicmbiollmmunol 1998，56 1 :49―63( Scand，l988，96:379―394( [26]GongQY，PhoenixJ，KempGJ，eta1( Estimationofbody [16]GokhaleAM(Unbiasedestimationofcurvelengthin3Dusing compositioninmusculardystrophybyMRIandstereologyfJJ( verticalslices[J](Microsc，1990，159:133―141( MagnResonImaging，2000，12 3 :467-475( [17]GokhaleAM(Estimationoflength densityLv from vertical [27]ThomsenJS，LaibA，KollerB，eta1(Stereologicalmeasuresof slicesofunknownthichness[J](Microsc，1992，167:1― 8( trabeeular bone structure: comparison of 3D micro computed 【18】MitchelRP，Cruz― OriveLM(ApplicationoftheCavalieriprinci― tomography with 2D histologicalsections in human proximal pie and verticalsectionsmethod to thelung: estimaton ofvol― tibialbonebiopsies[J](Microsc，2005，2l8 Pt2 :171―179( umeandpleuralsurfaceare43](Micmsc，1988， 150-117-136(