【doc】“京亚”葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗性的研究

【doc】“京亚”葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗性的研究 “京亚”葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗 性的研究 第25卷第1期 2008年2月 新疆大学(自然科学版) JournalofXinjiangUniversity(NaturalScienceEdition) Vo1.25.NO.1 Feb.,2008 "京亚''葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗性的研究 王起才,王艳,马纪,叶峰 (新疆大学生命科学与技术学院.新疆生物资源基因工程重点实验室.新疆-g~Iav齐830046) 摘要:探讨了不同消毒条件下"京亚"葡萄种子在培养瓶中萌发的情况.获得"京亚"葡萄种子最佳消毒条件是 70乙醇15S.0.1升汞5min;通过对"京亚"葡萄种子进行不同浓度GA浸种,不同浸种时间,不同培养基质 和不同光照条件处理.得到优化的"京亚"葡萄种子萌发条件是GAs4000mg/L浸种48h,置于l/2MS培养基中 暗光培养,萌发率为79.4%;对"京亚"葡萄种子抗卡那霉索特性的研究得到"京亚"种子抗卡那霉索的临界浓度 为40n,g/I 关键词:"京亚"葡萄;赤霉索;种子萌发;卡那霉素抗性 中图分类号:Q943.2文献标识码:A文章编号:1000-2839(2008)01-0092-04 StudiesonGerminationCharacteristicsand KanamycinResistanceof'Jingya'Grapevine WANGQi—cai,WANGYah,MAJi,YEFeng (C'ollegeofLifeScienceandTechnology.XinfiangUniversity. XinjiangKeyLabo~'atoryf)JBiologicalResout'cesandGeneticEngineering.UrumqiXinjiang830046China) Abstract.DifferentsterilizedconditionsweretestedtooptimizethebeststerilizingconditionsforwildJingya grapeseedsforseeding.Theoptimizedsterilizedconditionswas70%ethanolfor15S,0.1~HgCI2for5min.L 9— 3orthogonalexperimentwassetuptooptimizegerminationconditions,includingillumination,timelength fordippinginGA3,concentrationsofGA3andincubatingsubstances.Theoptimumconditionwasobtainedwith seedsgrownin1/2MSmediumindarkaftertheywereimmersedin4000mg/LGA3for48h.Thecritical Kanamycinconcentrationwildtype'Jingya'seedswasabout40mg/I. Keywords:'Jingya'grapevine;GA3;seedgermination;kanamycinresistance 葡萄是世界上最重要的经济水果之一.在我国,葡萄生产是农业生产的一个重要组 成部分.用基因 工程手段进行品种改良不仅可以有针对性地改变植物性状,而且与常规育种相比, 具有投资少,见效快 以及可以充分利用远缘基因资源等优势.花序浸染转化法是近年发展起来的一种 简便,快速,高效,重复 性好,稳定性高的非组织培养转基因方法.其优点是可以直接获得转化的种子,从 而为一些不易建立遗 传再生体系的植物提供基因遗传转化的新途径[1].由于花序浸染转化法具有以上 优点,因而本实验室拟 开展葡萄的花序浸染遗传转化工作.所用实验材料为"京亚"葡萄,"京亚"葡萄为巨 峰系葡萄品种,亲本 为黑奥林(臣峰×巨鲸)实生.四倍体葡萄品种,植物学特征与巨峰相似[2],具有穗大, 粒大,味甜多汁,早 熟抗病等优点,在我国南北方都有大面积的种植. 大量的研究结果表明赤霉素对种子萌发和种子活力有重要影响L3].使用赤霉素浸种可以打破种子 休眠,增强种子活力,从而促进种子萌发.本研究除了分析不同光照条件和不同培养基质对"京亚"葡萄 种子萌发的影响,还着重探讨r不同GA.浸种浓度对"京亚"葡萄种子的萌发效应,并对"京亚"葡萄的卡 那霉素抗性进行了研究,为进一步开展"京亚"葡萄花序浸染法进行遗传转化工作奠定基础. 收稿日期:2007—06—12 基金项目:科技部重大基础研究前期研究专项(2003CCA0100O)项目资助 作者简介:王起才(1979一)男.硕士研究生.研究方向为生物技术. 通讯作者:马纪(1962一),女,教授,硕士生导师. 第1期王起才,王艳,马纪,叶峰:"京亚"葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗性的研究93 1材料和方法 1.1实验材料 新疆昌吉回族自治州昌吉城郊西域种子公司葡萄园内种植的"京亚"葡萄."京亚"葡萄成熟后收集 种子,清洗晾干备用. 1.2实验方法 1.2.1"京亚"种子的消毒条件 将"京亚"葡萄种子在无菌工作台内辅以乙醇15S,3OS,0.2升汞处理5min,8min的不同处理,无 菌水清洗5遍,然后培养在以两层滤纸(加入蒸馏水没过滤纸)或琼脂为基质的培养瓶中培养,培养温度 25?,相对湿度6O,光照时问16h/d,光照度2000Lx.以胚根突破种皮2min为萌发,15d后观察,计数 直至萌发完全(霉烂的记为无活力种子),统计最终种子萌发率和污染率. 萌发率一萌发的种子数目/处理种子数目×100 污染率一染菌的种子数目/处理种子数目×100 1.2.2不同因素对"京亚"葡萄种子萌发的影响 以GA.浸种浓度,GA.浸种时间,培养基质,培养光照条件为因素,建立L9—3'正交试验以期提高"京 亚"葡萄种子萌发率.GA.浸种的浓度选择200mg/I400mg/I800mg/I;GA.浸种时间选择24h,48 h,72hj培养基质选择分别为:1/2MS固体培养基,无任何营养元素的琼脂培养基,双层滤纸基质(加入 蒸馏水没过滤纸).培养光照条件水平为:24h全暗光,16h光/8h暗,24h全亮光. 按照正交试验的标准使用GA.浸种"京亚"葡萄种子,然后转入无菌工作台中15S7O乙醇+5min 0.2升汞无菌处理种子,清洗5遍,接种至不同基质的培养瓶中按条件培养,培养温度25?,相对湿度 6O.每组处理3O粒种子,15d后统计萌发率. 1.2.3不同浓度GA.浸种对"京亚"种子萌发的影响 以不同浓度的GA.浸泡"京亚"种子48h,转入无菌工作台中,15S7O乙醇+5min0.2%升汞无菌 处理清洗5遍后培养至1/2MS培养基中暗光培养,培养温度25?,相对湿度6O,15d后统计萌发率. 1.2.4"京亚"葡萄种子抗卡那霉素实验 使用GA.4000mg/L浸种48h,转入无菌工作台中15S7O乙醇+5min0.2升汞无菌处理种子 清洗5遍后培养至1/2MS培养基中暗光培养,培养温度25C,相对湿度6O,待种子萌发出胚根,长出种 皮2mm,3mm时将其接入含有不同浓度卡那霉素的1/2MS基本培养基中,培养温度25?,相对湿度 60%,光照时间16h/d,光照度2000Lx,观察其生长情况,每个梯度3O个萌发的种 子.15d后统计死 亡率. 死亡率oA一死亡的芽数/培养芽数×100oA 2结果与分析 2.1"京亚"葡萄种子萌发结果 2.1.1不同消毒条件对"京亚"葡萄种子的污染控制 在所研究的8组不同处理中仅有一组发生1粒种子的霉菌污染,该组处理是琼脂基质培养基以7O 乙醇15S+0.2oA升汞5min,其余7个处理均未出现染菌现象,但是在全部8组处理的15d内均无一粒 种子萌发. 2.1.2"京亚"葡萄种子萌发的影响因素 鉴于上述试验结果,我们建立了L9—3正交萌发试验,以期找到影响"京亚"葡萄种子萌发的因素.实 验结果见表1,效应曲线见图1.由图1可以看出随着GA.浸种浓度的增加,"京亚"葡萄种子的萌发率也逐 渐提高;浸种时间条件以GA.浸种48h为宜,达到72h后萌发率开始下降;另外,从曲线上可以看出将 "京亚"葡萄种子置于暗光条件中培养可以获得更高的萌芽率,24h光照条件培养获得的萌发率最低j在 培养基质方面,使用1/2MS,双层滤纸基质(加入蒸馏水没过滤纸)均可得到较高的萌芽率,琼脂基质萌 94新疆大学(自然科学版)2008越 发率明显地低于以上两种培养基质,极差为10.45,说明不含营养元素的琼脂基质不利于"京亚"葡萄 种子的萌发.根据以上实验结果我们确定了种子萌发条件为:GA.浸种48h,在1/2MS培养基质上暗光 培养. 表1不同条件对"京亚"种子萌发的影晌 2.2GA浸种浓度对"京亚"葡萄种子萌发的影响 由于随着GA.处理浓度的增加,"京亚"葡萄种子萌发呈上升趋势,为了获得更高的萌发率,同时为 了研究GA.浓度对"京亚"葡萄种子的影响,将"京亚"种子以800,2000,4000,6000mg/IGA.浸种48h 后在1/2MS培养基中暗光培养15d,得到图2结果,种子萌发率分别为31.0,67.8,79.4,81.8.从萌发 趋势图上可以看出,随着GA.浓度的增加"京亚"葡萄种子的萌发率仍在逐渐提高,但增幅逐渐趋于平 缓,GA.6000mg/I相对于GA.4000mg/L萌发率仅提高了2.4. 【 l—— 图1不同正交处理条件对"京亚"种子萌发的的效应曲线图图2GA3浸种浓度对"京亚"葡萄种子萌发的影响 2.3"京亚"葡萄种子萌发的卡那霉素临界浓度 使用GA.4000mg/I浸种48}1,灭菌后在1/2MS培养基中培养,待种子萌发出胚根并伸出种皮2 rain,3mn1时,将其接入含有10mg/I,8Omg/I卡那霉素的1/2MS基本培养基中.观察发现,在胚根 的生长早期所有梯度的葡萄幼根均可以正常生长,但培养3,4天且胚根接触并伸人培养基后,60mg/I 以上浓度卡那霉素的培养基中所有的胚均不能正常生长出胚芽;而40mg/I卡那霉素中胚可以正常出 芽,但是幼苗形态不健康,出芽15d后逐渐白化死亡,死亡率为96.7(表2),由此确定"京亚"葡萄种子 萌发的卡那霉素临界浓度为40mg/I. 表2京亚葡萄种子卡那霉素抗性 3讨论 使用花序浸染法对基因进行遗传转化需要预先对该转化受体种子的萌发特性,卡那霉素耐受能力 第1期王起才,王艳,马纪,叶峰:"京亚"葡萄种子萌发特性及其卡那霉素抗性的研究95 进行研究.本研究是花序浸染法转化"京亚"葡萄的前期工作.葡萄的实生育种工作一般是直接在土中萌 发,本实验将种子放置在培养基中萌发,与在土中实生育种萌发方式相比,该方法可以在较短的时间内 使用组织培养快繁技术获得更多同一株系的葡萄苗,为遗传转化株系开展分子检测和生理生化指标检 测提供更多的材料,加快检测和繁育进程. 实验中未经浸种处理的"京亚"葡萄萌发率均为零,表明"京亚"葡萄种子采后不加预处理直接消毒 后培养不能直接萌发.陈光仪等研究表明在葡萄种子中含有抑制萌发物质,导致种子处于休眠状态,葡 萄种子坚硬的种皮可能是抑制物集中的器官【9]. 赤霉素是促进种子萌发的主要内源激素,是解除休眠的主要因子.使用赤霉素处理葡萄种子可以 有效地打破未层积种子的休眠状态,显着提高萌发率_1.在本研究中,随着GA.浸种浓度的增加"京亚" 葡萄种子的萌发率也逐渐增加.GAs浓度为4000mg/I时"京亚"葡萄种子的萌发率为79.i,而再次提 高GAs浓度,"京亚"葡萄种子萌发率的增加显得并不明显,因此认为4000mg/I是GA.浸种的最优 浓度. GAs浸种时间以4811为宜,浸种时间过短达不到浸种效果;浸种时间过长也会影响"京亚"葡萄萌发 率,这与种子萌发需要有氧呼吸有关,过长的浸种时间阻碍了种子萌动有氧呼吸的 进行,可导致种子萌 发率下降. 一 些需光种子萌发需要一定的光照条件,光照条件下萌发率较高,暗中不萌发;而有些植物种子光 照对其萌发影响不大[3].在本实验中"京亚"葡萄种子暗光条件可以获得最高的萌芽率,24h光照培养获 得的萌发率最低,表明"京亚"葡萄种子在萌发的早期不需要光照的参与.在培养基基质方面使用1/2MS 培养基和双层滤纸为基质萌发"京亚"葡萄种子均可获到较高的萌芽率,使用1/2MS培养基质萌发率略 高于双层滤纸基质;但琼脂基质不利于"京亚"种子的萌发,种子萌发率较低,这与木那格种子的萌发结 果相似. 实验获得了"京亚"葡萄萌芽苗抗卡那霉素的临界浓度为40mg/I,在此条件下培养一段时间后3. 3的胚根可以正常生长,其余都白化死亡. 参考文献: [1]韦献雅,付绍红.牛应泽.农杆菌介导floral—dip转基因方法研究进展[J].中国油料作物.2006,22(3):362—367. [2]李怀福.巨峰系葡萄品种演化及分类的研究lJ].园艺,2003,30(2):l31—134. 1-33田美华.唐安军,宋松泉.沿阶草种子萌发特性的研究f-J].种子,2006,25(4):8-10. 1-43贺军民.李发荣,余小平.光,赤霉素和乙烯利对贯叶连翘种子萌发的影响[J].中草药,2002,33(9):840—843. E53PanllaisN.Osmoticprimingoftruepotatoseed:EffectsofseedageEJ].PotatoResearch, 1989,32(2):235—244. [6]ShiniiroYamaguchi,Yuii.Kamiya.GPl}berel,linsandLight—Btimu~atedSeedGermination.[J].JournMofP~ant GrowthRegu[ation,2004,20(4):369-376. 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