【精品 论文】人牙周膜成纤维细胞和牙龈成纤维细胞药物转运模型的

【精品 论文】人牙周膜成纤维细胞和牙龈成纤维细胞药物转运模型的 军医进修学院解放军总医院 博士学位论文人牙周膜成纤维细胞和牙龈成纤维细胞药物转运模型的建立及 相关机制的初步研究 姓名:余立强 申请学位级别:博士 专业:口腔临床医学 指导教师:刘洪臣 20090501 军医进修学院博:,:学位论文人牙周膜成纤维细胞和牙龈成纤维细胞药物转运模型的建立 及相关机制的初步研究 中文摘要 抗生素在口腔颌面部感染的治疗中发挥着重要作用。研究发现牙周致病菌可侵入牙龈上皮细胞和成纤维细胞内，以逃避宿主的防御机制;有些抗生素可在上述细胞内及龈沟液中积聚，其浓度高于相应血药浓度，而有些药物不能在细胞内积聚，胞内药物浓度相近或低于相应血药浓度，这使得抗生素在应用中益发复杂。研究细胞对不同抗生素摄取机制对指导临床用药及提高药效的发挥具有重要作用。牙周细胞对药物的摄取及跨细胞转运是人工种植牙给药系统以及牙根管给药系统理论的重要基础之一，本课题组前期研究已发现牙周组织细胞可选择性摄取部分常用抗生素，为进一步探讨这两种给药系统的可行,生及规律，本文对牙周细胞摄取抗生素的机制进行了初步研究，并建立和验证人牙周膜和牙龈戍纤维细胞药物转运模型。全文分两大部分。第一部分人牙周膜和牙龈成纤维细胞摄取抗生素机制的初步研究 实验一人牙周膜和牙龈成纤维细胞对甲硝唑及替硝唑摄取机制的研究 目的:研究人牙周膜成纤维细胞(,,,,,)及人牙龈成纤维细胞(,,,)对甲硝唑和替硝唑的摄取，探讨摄取的方式及通过牙根管给药的可行,生。材料与方法:采用高效液相色谱法研究,,,,,及,,,分别与甲硝唑及替硝唑孵育后不同时间细胞内药物的浓度，细胞内药物浓度与细胞外药物浓度的关系，以及温度、,,和转运抑制剂丙磺舒和腺嘌呤对细胞摄取甲硝唑和替硝唑的影响。结果:孵育,,,,后,,,,,及,,,胞内甲硝唑和替硝唑浓度即可达到细胞外水平;细胞内甲硝唑和替硝唑浓度随着细胞外甲硝唑和替硝唑浓度的增加而呈线陛增加;温度、,,和转运抑制剂对,,,,,及,,,摄取甲硝唑和替硝唑无明显影响。结论:,,,,,及,,,可快速摄取甲硝唑和替硝唑，证实了根管给药的可行性;甲硝唑及替硝唑通过简单扩散方式进入,,,,,及,,,细胞内;甲硝唑与替硝唑在进入,,,,,及,,,的动力学之间没有显著差别，同时,,,,,与,,,间在摄取甲硝唑及替硝唑时也没有差别。 实验二有机离子转运体,,,,在人牙龈成纤维细胞上的表达 目的: 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 有机阳离子转运家族及有机阴离子思易逶冢龋牵频谋泶铮?教制湓谌搜丽赋上宋赴鞫酥械淖饔茫椒ǎ翰捎茫遥裕校茫曳觳庥谢衾胱幼颂逵谢趵胱幼颂寮易宄稍钡模恚遥危猎冢龋牵粕系谋?, 军医进修学院博士学位论文达。结果:,,,有,,,,、,,,,、,,,,,及,,,,,, ,,,,的表达。结论:证实了,,,存在有机阳离子转运体及有机阴离子转运体的推测。第二部分人牙周膜及牙龈成纤维细胞药物转运模型的建立及对部分口腔常用抗生素的跨细胞转运 实验一人牙周膜及牙龈成纤维细胞药物,,,运(模型的建立与验证 目的:借鉴,,;,,,细胞模型，建立,,,,,及,,,药物转运模型，用以研究牙根管给药系统及人工种植体牙给药系统中牙周细胞对药物的转运。方法:将原代培养的,,,,,及,,,分别接种到,,,,,,,,,聚酯滤膜上，连续以光学显微镜观察细胞的生长排列情况，测定跨膜电阻，并以渗漏标志物荧光素钠等指标进行检测(结果:,,,,,及,,,接种,周后细胞基本汇合，到,周时细胞连接紧密且完整，细胞呈复层生长，跨膜电阻分别达,,(,,?,(,,及,,(,,?,(,,,?;,,，经荧光素钠孵育,,分钟检 测细胞旁渗漏小于,,。结论:所建模型在,周后细胞排列情况可模拟体内牙周膜和牙龈生理状态，且符合模型建立要求，可作为研究牙周细胞转运药物的体外模型。 实验二人牙周膜成纤维细胞及牙龈成纤维细胞药物转运模型对甲硝唑、替硝唑、米诺环素及头孢噻肟钠的转运 目的:利用,,,,,及,,,药物转运模型研究,,,,,及,,,对于部分，,,腔常用抗生素的跨细胞转运，探讨对不同药物的转运规律。方法:在建立的,,,,,及,,,药物转运模型，以高效液相色谱法测定,,,,,及,,,对甲硝唑等药物的跨细胞转运。结果:甲硝唑、替硝唑及米诺环素经,,,,,,即可完全被,,,,,及,,,跨细胞转运，头孢噻肟钠分别经,,及,,,,,左右即可完全被,,,,,及,,,跨细胞转运。结论:,,,,,,及,,,可跨细胞转运甲硝唑、替硝唑、米诺环素及头孢噻肟钠;进一步证实了人工种植牙给药系统以及牙根管给药的可行性。 关键词:人牙周膜成纤维细胞;人牙龈成纤维细胞;给药途径;摄取;跨细胞转运;高效液相色谱法;,,,,,,;有机阳离子转运体，有机阴离子转运体;甲硝唑;替硝唑;米诺环素;头孢噻肟钠。 , 军医进修学院博士学位论文 ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,;,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ;,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,;, ,,, ,,,,,, ,,曲,, ,,,,,, ,,,,, ;,,,, ,,,;,,,,, ,,,,, ,,, ,,西,百,,, ;,,,,;, ,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,?椋悖?;,,,,,?, ,, ,;;,,,,,,,, ,, ;,,,,(,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,;,,,,,, ,, ,,,,,,;,,,,,,, ,, ;,,,, ,,,, ,,,,,,, , ,,,,, ,, ;,,,,;,, ,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,; 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;,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ,,,;,,,;,, ,,,,,,,,;, ,,,,,);,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,;;,,,,,,,,, ,,,,,,,; , 军医进修学院博(,:学位论义 英文缩略词表缩略词 英文全称 中文全称,,,, ,;,,, ,,;,,,,,,,, ,,;,,,,,,,舀,西,,,,, 急性坏死性溃疡性 龈炎,,,, ,,,,,;;,?, ,,,,,,,, ,,,,,?, ,,,,,, 必需培养基 ,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,, 胎牛血清 ,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,;,,,,,, 异硫氰酸荧光素 ,,, ,,,,,,西,百,,, ,,,,,,,,,, 人牙龈成纤维细胞,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, 人牙周膜成纤维细 胞 ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;, ,,？,,, ;,,,,,,,,,,,,, 高效液相色谱 ,陋, ,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, 有机阴离子转运体 家族 ,,,, ,,,,,,; ;,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, 有机阳离子转运体 家族 ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, 磷酸盐缓冲液 ,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,;,,,, 多形核白细胞 ,,,， ,，, ,,,,,,,,,,一,一,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,;,,,,,,, ,，,(联脒(,(苯基吲哚 ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, 相对标准偏差,,—,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,—,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 逆转录一聚合酶链 式反应 ,,, ,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,, 溶质载体超家族 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 论文作者签名:。、萎卯‰日期:口罗(多(, 指导教师签名:多,:乞,乏日期:纱,、;(乙 , , 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)。 论文作者签名:宗‖浩 日期:呷(,(， 指导教师签名:毋,。多艮日期:,,,、„(, 军医进修学院博士学位论文 —,上?—,,( 刖『舌 刘洪臣近来提出了两种新的给药途径设计思路，即人工种植体给药系统和牙根管给药系纠心,。通过这两种植入型给药系统，将治疗局部或全身性疾病的药物，如抗生素、心脑血管药物、降糖药物、戒毒药物、精神疾患用药物经牙周膜、根尖周组织吸收，分布在口腔局部乃至全身，预期达到治疗口腔局部和全身疾病的目的。这样可避免对体内其他组织的副作用、胃肠降解、肝脏“首过效应”及血药浓度不易控制等缺点，能长时间稳定控制血药浓度。已有研究发现可控释的甲硝唑等药物置于根管中经根尖孔、侧副根管等结构可持续扩散到根周的液体环境中【孓,,，但这些研究是在离体牙上完成的，在体内甲硝唑等药物经根管给药后到达根周局部并作用于全身还需经过牙周膜、牙龈等牙周组织和细胞，本课题组前期研究表明,,,及人牙周膜成纤维细胞(,,,,, ,,,,,,,,,,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,,,)可摄取甲硝唑及替硝唑等药物【,(,】，而关于牙周细胞对药物的摄取和跨细胞转运的机制和规律尚需深入研究。 临床上发现，在牙周病的治疗中根面刮治辅以抗生素较单独应用根面刮治表现出更显著的疗效【,】，其原因在于以下两个方面:首先牙周病的主要致病菌，牙龈卟啉单胞菌(,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,)、伴放线放线杆菌(,,,,,,,,,,,;,,, ,;,,,,,,;,,,,;,,,,,,,，,,)等主要牙周致病菌可侵入牙龈上皮细胞〔,？,,和成纤维细胞内【,?,】。致病菌藏匿于宿主细胞内，可以躲避宿主的防御机制，并且可获得丰富的营养，不断增殖，最终可破坏宿主细胞，提供再次感染的病原菌，使感染在宿主细胞间传播;这些牙周致病菌导致的细胞内感染已成为牙周病发生、发展、复发的关键因素【,引。,,;,等【,,,发现表明有些常用抗生素，即使胞外浓度达到,,,倍最小抑菌浓度，也不能完全杀灭口腔上皮细胞内的牙周致病菌。故而单独使用根面刮治不能消灭侵入细胞内的致病菌。其次，某些药物如米诺环素及环丙沙星可被牙龈成纤维细胞和口腔粘膜上皮细胞主动摄取【,,。,,,，使细胞内药物浓度高于血药浓度，可有效消灭上述侵入细胞内的病原菌，故根面刮治辅以抗生素可显著提高牙 , 军医进修学院博:,学位论文周病的疗效。,,,, ，,,】等研究发现人牙龈成纤维细胞(,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,)可以主动摄取四环素类、氟喹诺酮类药物，并认为,,,起到了细胞 储药库的作用，当血药浓度增加或为位于峰值时，药物向细胞内流入占主导地位，当血药浓度下降时，药物从胞内外流，从而维持组织液中较高的浓度，可调控药物的分布，解释了全身使用四环素类、氟喹诺酮类抗生素后，其龈沟液、牙龈组织中的药物浓度显著性高于血药浓度的现象【,„卜埔】。另外一些药物在龈沟液、牙龈组织中的药物浓度相近或远低于相应的血药浓度，如甲硝哗和替硝哗在龈沟液中的浓度与血药浓度相近【,,之,,，头孢噻肟钠全身给药后牙龈组织中的浓度与血药浓度比约为,(,【,,,，这说明细胞对不同药物有不同摄取机制而产生这样的现象。 本研究为了进一步探讨经种植体,根管给药的可行性，对牙周细胞摄取抗生素的机制进行了初步研究。在此基础上，我们借鉴,,;,一,(,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,;,,;,,,,, ;,,, , ,,,,)细胞模型建立人牙周膜成纤维细胞及牙龈成纤维细胞药物转运模型，来研究牙周细胞对药物的跨细胞转运。 参考文献,(刘洪臣(人工种植牙全身给药系统的设计(口腔颌面修复学杂志， ,,,,，,(,):,,,—,,,(,(刘洪臣(牙根管全身给药假说(中华老年口腔医学杂志，,,,,，,(,):,,,(,(凌均启，樊明文，魏国贤等(新型药物控释根充尖用于牙髓尖周病治疗的 可行性研究(牙体牙髓牙周病学杂志，,,,,，,(,):,,,(,,,(,(李德懿，叶秀芹，张文生，俞兵(牙周炎和牙髓根尖周病甲硝唑控释药物 的研制(上海第二医科大学学报，,,,,，,,(,):,,,(,(高静，汪竹平，李晓光，王铎，张丽(甲硝哗缓释牙胶尖的制各及体外 释放实验(上海口腔医学，,,,,，,,(,):,,,—,,,(,(冷斌，刘洪臣，鄂玲玲，等(人牙龈成纤维细胞对甲硝唑的跨膜转运【,〕( 中华老年口腔医学杂志，,,,,，,(,):,,,(,,,,(刘宇，刘洪臣，吴霞，等(人牙周膜成纤维细胞对甲硝唑替硝唑的跨膜转 运(口腔颌面修复学杂志，,,,,，,(,):,,(,,( , 军医进修学院博士学位论文,(,,,,,,,, ,,，,,,,,,,,, ,,，,,,,,,,,, ,,(,,,,,,,; ,,,,—,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,(, ,,,,,,,,,; ,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,:, ,,—,,,(,(,,,,, ,(,,,,;,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ;,,,,: ,,,,,;,,,,, ,,, ,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,(, ,,,,,,,,,,,，,,,,，,,(,):,,—,,(,,(,,,,,, ,，,,,,,,, ,，,,,,,, ,,，,, ,,(，,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ，,,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,( ，,,,;, ，,,,,，,,,,，,,(,):,,,,,,,,,(,,,,, ,，,,,,,, ,，,,,,,, ,，,, ,,(，,,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,,, ,,,, ，,,,,,，,,,,，,(,):,,,,,(, ,(,,,,;,,, ,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,，,, ,,(，,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,(, ，,, ,;,, ,,,,,,,,,,,，,,,,，,(,):,,,, ,,(, ,(,,,,,, ,,，，,,,,, ,,，,,,,,,, ,,，,, ,,(,,,,,,,;,,;, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,;,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,( ,,,, ,,;,,,,,,，, ,,,，,(,):, , ,—,,,(, ,(,,;, ,，,,,,,,, ,(,,,,;,;, ,, ,,,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,; 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