大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究

大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究 大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究 每北磨业2010,19(4):47—50 ActaAgriculturaeBoreali—occidentalisSinica 大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究 只帅,席美丽,申进玲,杨保伟,王新,孟江洪 (西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌712100) 摘要:以实验室分离大肠埃希氏菌菌株El1—83(耐链霉素)和E6—203(耐萘啶酮酸)为供体及受体菌,研究 供体及受体菌的含量比,接合培养介质,氧气量,抗生素诱导,接合时间,温度等因素对接合率的影响.结果发 现,供体与受体菌比例为1:8时,接合率最高,为2.4×1O_..;有氧条件下膜接合率最高,为2.5×i0-..;添加 低质量浓度阿莫西林对于大肠埃希氏菌的接合率影响较小;培养16h接合率达到最高,为3.5×i0一;接合温 度27?时接合率最高,为3.1×10,. 关键词:大肠埃希氏菌;接合;影响因素 中图分类号:R117文献标识码:A文章编号:i004,1389(2010)040047—04 HorizontalTransferofAntibioticTolerance betweenEscherichiacoliIsolates ZHIShuai,XIMeili,SHENJinling,YANGBaowei, WANGXinandMENGJianghong (CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity.YanglingShaa nxi712100.China) Abstract:FactorsinvolvedinhorizontaltransferofantibioticresistancebetweenEschPrichi acoliiso— latesandconjugationfrequencywerestudiedinthisexperiment.E.colistrainsE11—83(resistantto streptomycin)andE6— 203(resistanttonalidixic)wereusedasdonorandrecipientstrainsrespectively tostudytheinfluencesofdonor/receptorratio,culturetime,temperature,culturemedium,an dantibi— oticfactorsonconjugationfrequency.Theresultsshowedthatthehighestconjugationfreque ncyof 2.4×10一 wasobservedatdonor/receptorratioof1:8;Membraneculturemethodunderaerobic conditionwasmosteffective,andbadaconjugationfrequencyof2.5×10 一:theconjugationfrequen— ciesofculturemethodaddedwithamoxicillinornotwere2.9×10一and2.4×10一 respectively.The highestconjugationratio3.5×10一 wasobservedafterculturefor16hours.At27.C,conjugationrati— Owas3.1×10一. Keywords:Escherichiacoli;Conjugation;Influencingfactors 由于抗生素广泛与大量使用,甚至滥用,使得 细菌耐药性呈现不断增强并迅速扩散的趋势.多 重耐药致病菌的出现,为临床上相关感染的治疗 带来极大挑战,已成为全球范围重要的公共卫生 问题之一r】].据报道,接合是导致耐药基因在细 菌间传播,多重耐药病原菌不断产生的重要原 因l_2].肠道菌群尤其是大肠埃希氏菌在温血动物 肠道内密度大,被认为是食源性肠道病原菌多重 耐药基因的主要储存库L3].携带耐药基因的大肠 埃希氏菌可与共生的沙门氏菌,致病性大肠埃希 氏菌及其他肠道病原菌通过可移动基因元件的转 移进行基因物质的交换_4剐,使各种药物敏感菌产 收稿日期:2009—07—10修回日期:200910—08 基金项目:长江学者讲座教授基金项目;西北农林科技大学留学回国人员基金项 目. 作者简介:只帅(1984一),男,在读硕士,研究方向为食品安全.E— mail:zhishuaionline@yahoo.corn.cn *通讯作者:席美丽(1971一),女,讲师,主要从事食源性病原微生物研究.E— mail:ximeili2003@126.eom 西北农业19卷 生耐药性,这种基因转移机制在耐药基因的传播 中发挥着重要作用.具有耐药性的大肠埃希氏 菌,可通过污染食品,水等途径在人群和畜禽之间 传播.研究大肠埃希氏菌耐药性水平传递主要影 响因素,对控制多重耐药病原菌的出现,播散和预 防具有重要意义. 1材料与方法 1.1供体菌和受体菌 均为实验室分离大肠埃希氏菌,供体菌El1— 83耐受链霉素(sTR),受体菌E6—203耐受萘啶 酮酸(NAL). 1.2试剂 萘啶酮酸,链霉素,阿莫西林均为分析纯,购 自sigma公司.LB肉汤,LB营养琼脂均购自北 京陆桥公司. 1.3仪器与设备 日本三洋MDF一3286S超低温冰箱;美国Nu— AireNU一425—400E生物安全柜;上海精宏GNP一 9080隔水式恒温培养箱;德国Eppendorfer微量 移液枪;上海博讯LAC一5080S高压灭菌锅;美国 Bio—rad核酸蛋白测定仪(型号为SmartSpace Plus);0.45m滤膜;细菌滤器;灭菌注射器. 1.4不同供受体比例的接合试验 (1)将菌株E6—203和E1183分别在含NAL (32t~g/mL)及STR(16/~g/mL)的LB平板上划 线并培养12h.之后分别接种到含有NAI(32 t~g/mI),STR(16tag/mL)抗生素的20mLLB 肉汤中,37.C,8Or/min培养3,5h,至菌液0D 值达到1.0左右. (2)将菌液3000r/min离心5min,去上清, 用灭菌LB肉汤重悬. (3)将含有E11-83的LB肉汤做10倍梯度 稀释,涂布在LB平板上,37?培养12h,菌落计 数. (4)将E6—203,E1183菌液按比例混合,用 无菌注射器吸取2mL混合后菌液,用0.45p.m 滤膜的滤器过滤,将滤膜放在LB琼脂培养基上, 37?培养12h.将E6—203,E11-83分别过滤进行 滤膜培养,作为阴性对照. (5)用4mL的灭菌生理盐水将滤膜上的菌 体洗下.1O倍梯度稀释,涂布在含有NAL(32 pg/mL)和STR(16t~g/mL)的双抗平板上. 37?培养12h后计数. 1.5不同培养介质及有氧和微氧条件下的供受 体接合试验 试验步骤同1.4.在第(4)步做膜培养的同 时,将供受体混合液进行液体培养.同时还需将 两种介质下的培养物置于CO培养盒中培养. 1.6抗生素诱导条件下的供受体接合试验 将培养E6—203,E11-83分别接种到含有阿莫 西林(8~g/mL)和NAL(32t~g/mL),阿莫西林(8 t*g/mL)和STR(16t~g/mL)的20mILB肉汤中. 37?,80r/min培养3,5h.以下步骤同1.4,在 第(4)步将滤膜放在含阿莫西林(8t*g/mL)的LB 营养琼脂上培养. 1.7不同温度下供受体接合试验 步骤同1.4,在第(4)步中,将滤膜放在17?, 27?,37?和45?下培养12h. 1.8不同时间下的供受体接合试验 步骤同1.4,在第(4)步中,将滤膜在27?分 别培养3,4,5,6,7,7.5,8,9,10,12,14,16,18, 20,24h. 2结果与分析 2.1不同供受体比例对接合的影响 在供受体菌液含量5.2×10cfu/mL,37.C 膜培养12h条件下,研究供受体比例对接合率的 影响.结果表明(图1),供受体菌比例对接合率 有着显着的影响,当E6203/E11-83接合比例为 1:8时,接合率最高,为2.3×1O一..此条件下供 受体菌可能具有较高的接触几率,利于接合发生, 故本试验选择1:8为最适混合比例. 2.2不同培养介质及微氧和有氧对接合的影响 在供受体含量7.2×10cfu/mL,比例1:8, 37?培养12h条件下,研究膜培养和液体培养在 微氧和有氧条件下的接合.结果表明(表1),膜 表1有氧和微氧条件下膜培养及 液体培养供受体菌接合率 Table1Conjugationfrequencyofmembrane andliquidcultureunderaerobic andmicrOaer0phiIicconditions 培养条件有氧条件微氧条件 CultureconditionAerobicMicroaerophmc 4期只帅等:大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究 培养时,有氧条件下接合率是微氧条件下的12.5 倍;液体培养时,微氧条件下接合率约是有氧条件 下的14倍.有氧条件下膜培养的接合率最高为 2.5×10,,略高于微氧条件下液体培养的2.2× 2.50X a 2_00× 瓣0 窖1.50×鲻 .2 1.OOX d 85_o0× lO一.有氧条件下的膜培养较无氧条件下的液体 培养相比,试验操作更加简便,故选择有氧条件下 的膜培养为最适条件. 1O:l8:14:12:1l:1l:21:41:6I:81:10 供受体菌比例Donor/Recipientratio Fc=T/R(Fc为接合率,T为接合菌株数量,R为受体菌数量[.) Fc—T/R;Fc.COugationfrequency;T.transferredstrains;R.recipientstrains 图1不同供受体比例下供受体菌接合率 Fig.1Relationshipbetweenthedonor/recipientratioandconjugationfrequency 2.3抗生素胁迫对接合的影响 E11-83与E6—203均耐受阿莫西林,在供受 体含量8.3×10cfu/mL,比例1:8,37?膜培养 12h条件下,研究抗生素对接合率的影响.试验 发现,在正常生长时,供受体菌株的接合率为2.9 ×10;存在低质量浓度阿莫西林胁迫时,接合率 为2.4×10一.可见低质量浓度阿莫西林(8g/ mI)的添加对于接合没有显着影响. 2.4培养时间对接合的影响 在供受体含量4.9×10cfu/mI比例1:8, 37?C有氧膜培养条件下,研究培养时间对接合率 的影响.结果发现(图2),在3,16h之间,接合 率随时间延长而增大,9,16h增大趋势明显,在 斛 ? 鲻 4.0O 接合时间/h ConJugationtime 图2培养时间对供受体菌接合率的影响 Fig.2EffectofincubationtimeOilconjugationfrequency betweendonorandrecipientstrains 培养16h左右达到最大,为3.5×10_",此后接合 率略有下降,并在小范围内波动. 2.5温度对接合的影响 在供受体含量6.4×10.cfu/mL,比例1:8, 膜培养16h条件下,研究温度对接合的影响.结 果发现,在27C时,产生接合菌株菌落数量最多, 接合率最高,为5.6×10,.37.C时接合率为1.7 ×10一.而17.C时没有接合菌株生长,在45? 时,仅产生很少量的接合菌株.因此选择27?为 最适接合温度. 3结论与讨论 接合是基因水平传递最常见的方式,在耐药 基因的播散中有重要作用.本研究通过检测不同 条件下的接合率,探索可能影响大肠埃希氏菌间 接合的因素.结果表明:供体与受体菌比例为 1:8,有氧条件下膜接合,接合温度27C,培养 16h为最适接合条件;低质量浓度阿莫西林(8 ~g/mL)对接合率无显着影响. 接合的发生依赖于菌体问的接触,Fernan— dez—Astorgal7等发现供受体比例对大肠埃希氏 菌间的接合率有显着影响.本研究表明当供体与 受体菌比例为1:8时接合率最高,这与blaiotta 等对乳酸球菌问的研究结果一致. Sasaki等研究显示,膜培养在pAMI31从 粪肠球菌到植物乳杆菌的转移中是最好的接合方 O0O0O 西北农业19卷 法.本试验结果表明,有氧条件下膜培养的接合 率高于微氧条件下液体培养,可能由于在该条件 下,供受体菌在滤膜上有较高的接触机会.接合 的发生依赖于质粒通过F菌毛从供体菌到受体 菌的传递,本试验中微氧条件下的液体培养具有 最高的接合率,可能是在微氧条件下,有利于F 菌毛生长l】,使接合频率提高;但微氧条件下的 膜培养低于其有氧条件下的接合率,原因可能是 在培养的初期氧气稀少使供受体菌生长缓慢,导 致可能发生接合的供受体菌株基数减少;而在微 氧液体培养时,由于液体具有溶氧功能,对菌株的 前期生长未产生过多抑制,当氧气被消耗后,微氧 环境又有利于F菌毛的生长,加之在液体中菌体 具有较好的移动性,增大了供受体菌发生接合概 率. 抗生素被认为能干扰微生物正常生长机制. TimF.Cooper_1等研究发现,在添加抗生素后 接合率降低了约104倍.而本研究认为低质量浓 度阿莫西林(8/~g/mL)的添加对于接合率影响不 大,原因可能是低质量浓度的阿莫西林并未影响 接合发生机制中所需酶的合成. 供受体接合率在培养16h左右时达到了最 大值,并在该区域呈小范围内波动,可能是受营养 条件影响,菌株生长受限,或是其他非接合菌株抑 制了接合菌株的继续产生. 温度对F菌毛的生长会产生影响.Single- ton等口]研究发现:在15?无接合菌株产生, 17.C有接合菌株的产生,但需要延长接合时间,在 37?时获得最多接合子,且明显高于27?的结 果.同时Novotny与Lavinl_】报道,接合最适温 度在37与42?之间.但在本试验中,27?下有 最高接合率,这可能是由于菌种间的差异所致. 参考文献 [1]WorldHealthOrganization.Overcomingantimicrobialre— sistance.WorldHealthOrganizationReportonInfectious Diseases[R].PublicationCode:WHO/CDS/2000.2,2000. 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