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首页 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立.doc

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立

你低頭微笑
2019-05-02 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立doc》,可适用于医药卫生领域

牛病毒性腹泻黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立摘要:采用辛酸硫酸铵法提取兔抗BVDV高免血清中的免疫球蛋白IgG,在混合硝酸纤维素膜上进行间接酶联免疫吸附试验,建立了检测BVDV抗原的斑点酶联免疫吸附检测法。结果显示,抗体最佳包被量为μgmL,酶标记羊抗兔IgG的最佳工作浓度是∶倍稀释,抗原最小检出量是μgmL。应用建立的检测方法对份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为经卡方(χ)检验分析,建立的间接DotELISA与AGP法相比较,阳性检出率差异显著。证实该方法敏感性高、简便快速,适合于基层兽医的检测诊断。关键词:牛病毒性腹泻黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附法检测中图分类号:S文献标识码:B文章编号:X()牛病毒性腹泻病毒病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻黏膜病毒(BovineViralDiarrheaMucosalDiseeaseVirus,BVDMDV)引起的,临床上以发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。年美国人Olafson首次发现并报道此病,目前已呈世界性分布。目前诊断该病的方法有病毒分离、琼脂扩散试验、中和试验、酶联免疫吸附试验等,但这些方法存在检出率低、检测时间长等缺点,尤其是对于免疫耐受和持续性感染的牛出现漏检。本研究旨在建立一种简便有效的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的斑点酶联免疫吸附法。材料与方法材料抗BVDV高免血清的制备以BVDVOregonCV标准毒株的MDBK细胞培养物作为免疫原按常规方法免疫健康家兔,,待效价达∶时,心脏采血,收集血清,℃保存备用。兔抗BVDVIgG的提取将兔抗BVDV高免血清以辛酸硫酸铵法提纯免疫球蛋白IgG。样品及处理待测样品为河北省不同地区采集的腹泻牛血样,℃保存。BVDV阳性血样和BVDV阳性粪样为自然感染腹泻奶牛血样与粪样,经电镜检查含有大量BVDV粒子。间接斑点酶联免疫吸附法检测BVDV抗原方法的建立间接DotELISA的操作程序操作流程:压迹―点样―洗涤―封闭―加抗体―加酶标羊抗兔―显色―终止反应―判定结果。结果判定标准:以在膜圆圈内出现明显棕红色斑点判定为阳性,无色为阴性。间接DotELISA试验条件的选择()抗体最佳工作浓度的筛选:用抗体稀释液将纯化IgG稀释成、、、、、、μgmL,包被膜片,浸洗次,封闭。将阳性抗原(BVDV病毒浓缩液)以抗原稀释液作∶倍稀释,酶标羊抗兔作∶、∶倍稀释,依次加入各孔,μL孔,置℃温箱h,洗涤。以出现斑点颜色最深、背景颜色最浅的IgG的量和酶标羊抗兔的稀释度作为本试验的工作浓度。()抗原最低检出量的确定:用抗体稀释液以工作浓度稀释抗体,将阳性抗原以抗原稀释液作∶、∶、∶、∶、∶、∶、∶、∶、∶倍稀释,然后加入最适浓度的酶标羊抗兔,以出现斑点颜色最深,背景颜色最浅时阳性抗原最大稀释倍数所对应的抗原浓度即为抗原最低检出量。间接DotELISA的特异性试验()特异性阻断试验:将BVDV浓缩液分别与标准阴性血清、正常兔血清、兔抗BVDV阳性血清、兔抗BVDVIgG和正常MDBK细胞液混合,置℃温箱h,然后进行间接DotELISA试验,根据结果出现斑点的情况确定试验的特异性。()交叉性试验:用建立的间接DotELISA法对BVDV细胞培养液、BVDV阳性血样、BVDV阳性粪样、轮状病毒、猪瘟兔化弱毒疫苗、健康牛血样、正常MDBK细胞液进行检测,观察结果。()重复性试验:将BVDV细胞培养液、BVDV阳性血样、正常MDBK细胞液、健康牛血样、BVDV阳性粪样按已建立的间接DotELISA法重复检测次,观察结果。DotELISA法的初步应用用建立的DotELISA法和AGP法分别对河北省不同地区采集的份腹泻奶牛血样进行检测。结果与分析抗体最佳工作浓度的筛选经方阵法测定,兔抗BVDVIgG的最佳工作浓度为μgmL,酶标羊抗兔的最佳稀释浓度是∶倍稀释(表)。抗原最低检出量的确定结果见表,由表可见,间接DotELISA法最低可检出倍稀释的病毒浓缩液,即μgmL。间接DotELISA的特异性试验阻断试验试验结果表明,兔抗BVDV阳性血清和兔抗BVDVIgG可阻断BVDV与酶标抗体之间的阳性反应,而标准阴性血清、正常兔血清和正常MDBK细胞液不能阻断BVDV与酶标抗体之间的阳性反应(表)。交叉性试验结果见表。由表可见,经间接DotELISA检测,BVDV细胞培养液、BVDV阳性血样、BVDV阳性粪样反应阳性,而与猪瘟兔化弱毒疫苗、正常MDBK细胞液、健康牛血样、轮状病毒无交叉反应。重复性试验从表可以看出,次重复试验结果差异不明显,说明这种方法重复性很好。DotELISA法的初步应用从河北省不同地区采集腹泻奶牛血样份,用AGP法和建立的DotELISA法进行检测,结果见表。DotELISA和AGP的BVDV阳性检出率分别为和。经卡方(χ)检验分析,这两种方法比较,χ=,差异显著(P<)。讨论目前临床上检测BVDV的常用的病毒分离法和中和试验需要细胞培养,费时费力,不适合大规模的病毒检测和流行病学调查琼扩试验准确性不高,检出率较低ELISA法需要酶标检测仪等贵重仪器,不利于基层使用。而DotELISA法操作简便,费用低,只需要~h即可得出结果且结果判断直观,而且能从样品中检出持续性感染的动物,适用于基层单位对BVDV的检测和流行病学调查。本试验应用DotELISA法和AGP法对例临床病例进行检测,结果显示,DotELISA法与AGP相比较,阳性率差异显著,该方法的阳性检出率明显高于AGP,表明DotELISA法具有高度敏感性,非常适用于临床诊断和检疫。参考文献:王新平,刘红,宣华,等绵羊感染牛病毒性腹泻粘膜病病毒的调查研究J兽医大学学报,,():OLAFSONP,MACCALLUMAD,FOXFHAnapparentlynewtransmissiblediseaseofcattleJCornellVet,,:殷震,刘景华动物病毒学(第二版)M北京:科学出版社,高存福牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立及E基因变异分析D保定:河北农业大学,,王世若,王兴龙,韩文瑜,等现代动物免疫学(第二版)M长春:吉林科学技术出版社,白丽,王晶应用辛酸硫酸铵法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体J大理医学院学报,,():

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