利用ITS核酸序列分析鉴定海洋青霉菌

利用ITS核酸序列分析鉴定海洋青霉菌 , 安徽农业科学,JournalofAnhuiAgd.Sci.2009,37(32):15741—15742,15751责任编辑 陈秀晨责任校对卢瑶 利用ITS核酸序列分析鉴定海洋青霉菌 曲凌云,田黎,荆,修勤(国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061) 摘要[目的]利用ITS核酸序列对6株根据形态学特征初步鉴定为青霉菌的海洋真 菌进行鉴定.[方法]采用分子生物学技术,对6株 样品的ITS序列进行克隆,并利用ClustalX1.83软件对结果进行系统发育分析.[结 果]通过PCR克隆获得了6株样品的ITS序列,将结 果与GenBank中已登陆的其他序列进行系统发育分析,确定了6株菌株均属于青 霉菌属.[结论]该6株菌株均属于青霉菌属. 关键词海洋青霉菌;ITS序列;系统发育分析 中图分类号S188文献标识码A文章编号0517—6611(2009)32—15741—02 AnalysisandIdentificationofMarinePenicilliumBasedonITSSequencesofrDNA QULing-yunetal(FirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao,Shandong266061) Abstract[Objective]Theaimwastoidenti~sixmarinepenieilliumspecieswhichwereidentifiedprimarilybasedonmorphologicalcharac— teristiesbyanalyzingITSnucleotidesequence.[Method]TheITSregionsof6specieswereclonedbymoleculebiologymethodandphyloge? neticanalyzedbyusingsoftwareClustalX1.83.[Result]TheITSregionsof6speciesweresequenced,andphylogeneticanalysisbetweenthe yieldsequencesandtheITSsequencesassessedinGenBankshowedthat6strainsbelongedtoPenicillium.[Conclusion]6strainsallbelonged tonicillium. KeywordsMarinepenicillium;ITSsequence;Phylogeneticanalysis 随着从海洋真菌发现新化合物速率不断增加,人们希望 通过对海洋真菌的研究开发,获得人类所需要的更多的新型 生物活性物质..而对海洋真菌的采集和鉴定是研究开 发海洋真菌的基础.目前,在对海洋真菌的分离鉴定中沿用 了传统的分类鉴定方法,即依赖纯培养物,通过表型特征和 细胞形态学的观察,对真菌生理生化反应和细胞组成成分结 构进行比较分析来实现分类鉴定..随着生物化学,遗传 学以及分子生物学,生物信息学等相关学科的发展,同时,也 是海洋真菌分类学自身发展的客观要求,分子生物学鉴定方 法被引人海洋真菌的菌种鉴定中,使菌种的鉴定在以形态特 征和生理生化特征为基础的鉴定上更加准确,可靠.核 酸序列分析就是通过测定核酸一级结构中核苷酸序列的组 成来比较同源分子之间相关性的方法,它能为物种提供最直 接,最有价值,最为准确的信息,利用它不仅可直接研究物 种间的亲缘关系,而且对了解基因及其产物的结构,基因表 达以及分子进化等方面具有重要意义. 笔者多年来从事海洋微生物的开发和利用,从不同海洋 基质中采集获得了6株具有产生抑菌抑肿瘤活性次生代谢 产物能力的海洋真菌,根据形态学特征初步鉴定为青霉菌, 笔者采用ITS区序列分析法对该6株青霉菌进行了鉴定. 1材料与方法 1.1菌株试验鉴定的青霉菌由海洋一所分离保存(表1). 1.2培养基固体培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Pota— todextroseagar,PDA),马铃薯浸汁1000ml,葡萄糖20g,琼 脂20g. 液体培养基:为该实验室改良,马铃薯浸汁200ml,蛋白 胨2g,酵母粉1g,葡萄糖15g,NaC130g,MgCl2?6H2O2.0 g,KC10.4g,FePO0.01g,蒸馏水1000ml. 基金项目近海海洋微生物资源的标准化整理整合与共享(2004DKA一 30640). 作者简介曲凌云(1975一),女,山东荣成人,博士,副研究员,从事海 洋微生物研究. 收稿日期2009-07-06 表1供试青霉菌的编号及来源 Table1Numberandoriginsofthetestedpenidllim 1.3菌种培养及全基因组DNA提取将试验菌株接种于 PDA培养基上,20qC培养10d后用牙签挑取少许孢子接种 于100ml液体培养基的转接一次PDA培养基的菌株中,于 20?,200r/min摇床振荡培养5,7d,然后用双层纱布过滤 收集菌丝体.取菌丝体100mg,加入液氮充分研磨后,采用 TIANGEN公司的离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒 (DP305)进行真菌DNA的提取. 1.4rDNA?S区段PCR扩增ITS区段的扩增采用引物 ITS1:5一TCCGTAGGTGAACCTGCGG.3和ITS4:5一TCC TCCGCTrrATTGATATGC-3(引物由上海生工合成).扩 增反应在UnoiI196孔PCR扩增仪(德国BIOMETRA公司产 品)上进行.反应体系为50l,其中,包含1×bufferPCR缓 冲液,0.1mmoL/LdNTPs,0.2p~mol/L引物,5uDNA聚 合酶(TAKARA公司),扩增程序为94oCDNA双链预变性5 min,94?变性50S,58oC退火30S,72oC延伸40S,共30个 循环,最后,72?延伸10min.PCR扩增产物经0.8%琼脂 糖凝胶电泳检测后,紫外灯下切下含所需DNA片段的凝胶 条.用TAKARAPCR产物回收试剂盒进行回收. 1.5T/A克隆,转化与测序克隆体系含PMD18一Tvector1 l,纯化过的PCR产物2l,连接缓冲液5l,总体系为10 l.16?连接过夜,转化感受态细胞(CaC1:法制备感受态 细胞),然后涂布到含Amp(50g/m1)的IJB琼脂平板培养基 上,37?培养10,14h,形成单菌落.从上述LB平板上随机 挑取10个菌落,转移到10支装有LB液体培养基(含Amp 50g/m1)的试管中,37?振荡培养5,6h,做菌落PCR,反 15742安徽农业科学2009燕 应条件同"1.4"(模板为lL培养菌液),0.7%琼脂糖凝胶电 泳检测产物.挑选阳性克隆,取lrnl菌液交测序公司测序 (上海博亚生物技术有限公司). 1.6DNA序列数据分析获得测序结果后,用BLAsT软件 对基因序列的同源性进行分析.同时,利用ClustalX1.83 软件对测得的序列与从GenBank中通过Blast检索获得的参 考序列进行多重对位排列(Multiplealignments),用MEGA 3.1软件以邻位相连法构建系统发育树. 2结果与分析 该研究测得的6株真菌的ITS片段长度分别为MD309 576bpT16585bp2A4一Z15586bpQJ-9584bp,NHS35-04 586bp,ZHS051-04553bp.该研究获得的序列均已在Gen— Bank中登录,其序列长度,GC含量和序列登录号见表2. 表2青霉菌rDNAITS的序列长度,GC含量及GenBank登录号 Table2ITSsequencelength.GCcontentandGenBankaccession numberofpenicilliumrDNA 将该研究获得的序列分别与GenBank中的核酸序列进 行同源性比较,发现MD309的序列与登陆号为AY373933的 小刺青霉(PeniciUiumspinulosum,标准株FRR1750)的同源 性为100%;T16的序列与登陆号分别为FJ5494391, EU862195与EU833212的3株产黄青霉(Penicilliumchrysoge一 舢m,标准株SL302,CTSPF15,P11.7)的同源性均为100%; 2A4-Z15的序列与登陆号为AY373907的皮壳青霉(Penicilli— amcru~tosum,标准株FRR1669)的同源性为100%;QJ一9的序 列与登陆号分别为DQ339557的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum,标准株NRRL5256)与DQ339570(Penicilliumdi— podomyicola,标准株NRRL35583)的2种青霉菌的同源性为 100%;NHS35-04的序列与登陆号为EU664481的卡门培尔 青霉(Penicilliumcamembeai,标准株095827)的同源性为 100%;ZHS051—04的序列与登陆号为EU664458的橘青霉 (Penicilliumcitrinum,标准株093503)的同源性为100%.该 研究对6株菌ITS片段进行的分析验证了应用形态特征对6 株菌的初步鉴定. 从GeneBank中下载与该6株菌的ITS序列相似性最高 的标准株的ITS序列,进行聚类分析和系统发育树分析,结 果见图l. 3结论与讨论 真菌核糖体基因由小的亚单元(18s),1TS1区,5.8S区, ITS2区和大的亚单元(28s)构成,头尾串联形成重复序列,一 个基因组内有60,200个拷贝.1TS1和ITS2常被合称为 ITS,并且5.8sRNA基因也被包括在ITS之内.真菌ITS 区域长度一般在650—750bpl141.由于ITS区不加入成熟核 420 Nucleo~ideSubstitutions【×1O0】 图1基于青霉属ITSrDNA基因序列构件的系统发育树 Fig.1PhylogenetictreebasedonITSrDNAsequencesofPeni- cilliam 糖体,所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常 小,因此,能容忍更多的变异.在绝大多数的真核生物中表 现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的 2个种都能在ITS序列上表现出差异,显示最近的进化特征. 研究表明,ITS片段的进化速率是18srDNA的10倍,这就是 ITS序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础.所 获得的ITS序列信息可以提交到GeneBank,采用BLAST和 RDP与已知序列进行相似性分析,然后进行系统发育分析. 目前,序列分析方法在青霉的分类鉴定中应用较多.JansoJ E对P.dravuni首先进行形态观察,认为P.dravuni与P.tur. batum很相似,再进行ITSrDNA序列分析,并提交到Gene— Bank与已知序列进行相似性分析后,认为dravuni是一新 种.Dombrink—Ku~zmanMA对12种不同青霉菌株的28s rDNA,5.8srDNA序列进行分析,从而确定了它们在系统发 育上的联系,并且认为对rDNA序列进行分析很适合研究青 霉的分类…j.DupontJ应用ITSrDNA等3种分子标记方法 对青霉P.nagl~eme和Pd~odomyis进行分类鉴定,并确认 了它们在遗传上的联系. 该研究利用ITS序列分析方法,通过对海洋青霉的序列 进行分析,确认了根据形态初步鉴定的结果,该6株均属于 青霉菌.由上述结果可以看出,ITS序列分析是针对基因组 的一部分序列进行分析,而不是在全基因组的水平上分析, 具有一定的局限性,如QJ-9的序列与登陆号分别为 DQ339557的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum,标准株NR. RL5256)与DQ339570(Penicilliumdipodomyicola,标准株NR— RL35583)的2种青霉菌的同源性为100%.即单纯使用ITS 序列分析不能明确对青霉进行种的鉴定. 随着分子生物学和相关技术的发展,分子标记技术以其 快速,灵敏的优点逐渐成为真菌分类鉴定的主要手段.尽管如 此,目前还没有一种分子标记技术能单独胜任对真菌的鉴定, 只有各种方法结合起来进行比较研究,尤其是将传统方法与分 子生物学方法结合起来对微生物进行分类鉴定才会得到比较 满意的结果.该研究认为,在对海洋青霉的鉴定过程中,首先 ,在ITS序列分析结果的基础上,重点 对其进行ITS序列分析 对与待鉴菌株遗传相似度较高的几种青霉的特征性表型特 征进行辨别区分,将有利于快速准确地鉴定海洋青霉. 参考文献 [1]张决,郑忠辉,黄耀坚,等.海藻真菌抗肿瘤活幽初步研究[J].厦门 大学:自然科学版,2004,43(4):551—556. (下转第15751页) 37卷32期如晓丹等CBF转录因子在提高植物抗逆性中的作用15751 ducibledownstreamgenesoftheArabidopsisDREB1A/CBF3transcription. alfactorusingtwomicroarraysystems[J].rn1ePlantJoumal,2004,38(6): 982—993. [7]Q1NF,SAKUMAY,LIJ,eta1.Cloningandfunctionalanalysisofanovel DREB1/CBFtranscriptionfactorinvolvedincold.responsivegeneexpres— 1052. sioninZeamaysL.[J].PIantCellPhysiol,2004,45(8):l042— {8lGA0MJ,ALLARDG,BYASSL,eta1.Regulationandcharacterizationof fourCBFtranscriptionfactorsfromBrassicanapus【J1.P1antMolBio1. 20o2.49:459—471. 【9【XUEGP,LOVERIDGECW.HvDRFlisinvolvedinabscisicacidmediat. edgemeregulationinbarleyandproducestwoformsofAP2transcriptional activators,interactingpreferablewithaCT-richelement[J].PlantJ,2oo4, 37:326—339. IlOlJAGL0KR,KIJFFFS,AMUNDSENKL,eta1.ComponentsoftheArabi. dopsisCrepeat/dehydration—responsiveelementbindingfactorcold—I?—e— sponsepathwayareconservedinBrassicanapusandotherplantspecies lJ^.P1antPhysiol,2001,l27:910—917. Il1IGILMOURSJ,SEBOI|TAM,SAI.AZARMP,eta1.Overexpressionof theArabidopsisCBF3transcriptionalactivatormimicsmultiplebiochemi— catchangesassociatedwithcoldacclimation[J].PlantPhysiol,23OO,124: 1854一l865. 【12IJAGJ一SENKR,GILMOURSJ,ZARKADG,eta1.Arabidopsis CBF1overexpressioninducescorgenesandenhancesfreezingtolerance 【J.Seience,l998,280:104—106. [13]rH0MAsH0wsY,uuQ,DuB0uzETJG,eta1.DNA?Bindingspeci. ficityoftheE1/AP2domainofArabidopsisDREBs.transcriptionfactors involvedindehydration2andcold—inducibegeneexpressionlJ].Biochem BiophResCommun,2oO2.29o:998一loo9. 』14IVISWANAT}1ANC,MASARNO,ZHUJK,eta1.ICE:Aregulatorofcold— inducedtranscriptomeandfreezingtoleranceinArabidopsis『J].Gene andDevelopment,2oo3,l4:1043一l054. Il5jGILMOURSJ.F0WLERSG,TH0MASHOWMF.Arabidopsistranscrip. tionalactivatorCBF1.CBF2.andCBF3havematchingfunctionalactivities 【JI.PlantMolecularBiology,2OO4,54:767—781. 1l6IKUMES,K0BAYASHIF,ISmBASHIM,eta1.Direntialandcoordina. tedexpressionofCbfandCo#Leagenesduringlong—termcoldacclima- tionintwowheatcultivarsshowingdistinctlevelsoffreezingtolerance JI.GenesGenetSyst.20Q5.8o:185—197. [17]唐先兵,赵恢武,林忠平.值物耐旱基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究进展[J].首都师范 ? +"+"+"++一+"+ (上接第15742页) 一 +一+一+"+"+++ i2I?MSBUGNI,CHRISMIREL,ND.Marine.derivedfungi:achemically andbiologicallydiversegroupofmicroorganisms[J].NatProdRep,2O04, 21:143—163. [3]王军,林永成,吴雄字,等.从南海红树内生NO.2533分离出新的异香 豆素[J].中i大学:自然科学版,2001,40(1):127—128. [4]崔丽霞,李君剑.青霉分类方法的研究进展[J].山西化工,2OO7,27(6): 3l一34 [5]PI1TrJI.AnappraisalofidentificationmethodsforPenicilliumspecies: noveltaxonomiccriteriabasedontemperatureandwaterrelations『J1.My— cologia,1973(65):11342—1157. [6]PI1TrJ1.Alaboratoryguideconanonpenicilliumspecies[M].NorthRyde: DivisionofFoodProcessing,1988. 『7]FRISVADJC.Physiologicalcriteriaandmycotoxinproductionasaidsini. dentificationofcommonasymmetricPenicilliaIJ1.ApplEnvironMicrobi— ol,1981,41(3):568—579. [8]KONGHZ.AnewpenicilliumspeciesisolatedfromGuizhou[J].Myco- systema,2OO0,19(1):l一2. [9]WANGL,KONGHZ.ThreenewrecordsofPenicilliuminChina[J].Myc. 大学,20O2,23(3):47—51. [18]刘强,赵南明,YAMAGUCH-SHINOZAKIK,等.DREB转录因子在提高 植物抗逆性中的作用[J].科学通报,2OOO,45(1):ll一16. [19]KASuGAM,LIUQ,MIURAs,eta1.Improvingplantdrought,salt,and— freezingtolerancebygenetransferofasinglestressinducibletranscription factorlJI.NatBiotechnol,1999,17:287—292. I20lSTOCKINGEREJ,GILMOURSJ,THOMASHOWMF.Arabidopsis thalianaC8nencodesanAP2domain,containingtranscriptionalactiva. torthatbindstotheC-re~VDRE,acis—actingDNAregulatoryelement thatstimulatestranscriptioninresponsetolowtemperatureandwaterdef- icit1JI.ProcNatlAcadSciUSA.1997.94:1035—1040. [21]甄伟,陈溪,孙思洋,等.冷诱导基因的转录因子CBF1转化油菜和烟 草及抗寒眭鉴定[J].自然科学进展,2OOO,10(12):l104—1108. [22]吴琰,董静,郭宝林,等.转CBF1基因地被石竹的抗寒性评价[J].中 国农学通报,2OO7,23(5):59—62. [23]刘燕,胡鸢蕾,董静,等.转基因草莓向栽培草莓中转移CBF1基因的 研究[J].分子植物育种,2O07,5(3):309—313. [24]梁慧敏,夏阳,王太明.植物抗寒,抗旱,耐盐基因工程的研究进展[J]. 草业,21113,12(3):l一7. [25]HSIEHTH,LEEJT,CHARNGYY,eta1.Tomatoplantsectopieally— pressingArabidopsisCBF1showenhancedresistancetowaterdeficitstress fJ1.PlantPhysio1.20O2.130:618—626. [26]KANGJY,CHOIH,IMMY,eta1.Arabidopsisbasicleucinezipperpro- teinsthatmediatestree—responsiveABAsignalinglJ1.P1antCell,20O2, 14:343—357. [27lSHENYG,YANGQ,ZHANGWK,eta1.NovelhalophyteEREBP/AP2 一 TvoeDNAbindingproteinimpmvessalttoleranceintransgenictobacco fJ.ActaBotSin.2o03,45:82—87. I28】n'0Y.KATsURAK.MARUYAMAK,eta1.Functionalanalysisofrice DREB1/CBFtypetranscriptionfactorsinvolvedincold.responsivegene expressionintransgenicfleeIJ】.PlantCellPhysiol,2O06,47(1):141— 153. [29]林茂,闰海霞,fl豇日琶,等.埴物CBF转录因子及其在基因工程中的应 用[J].广西农业科学,2OO8,39(1):21—24. 『30]KASUGAM.MIURAS.SHINOZAKIK.eta1.AcombinationoftheArabi- dopsisDREB1Ageneandstress.inducibleApromoterimpmved drought..andlow..temperaturestresstoleranceintobaccobygenetransfer IJ1.PlantCellPhysio1.2OO4,45:346—350. osystema,2OO2,21(1):127—130. 『10]JANSOJE,BEMANVS,GREENSTEINM,eta1.Penicilliumdravuni,a newmarinederivedspeciesfromanalgainFiji[J].Mycologia,2OO5,97 (2):444—453. 『11]DOMBRINK—KURTZMANMA.Thesequenceoftheisoepoxydondehy. dmgenasegeneofthepatulinbiosyntheticpathwayinPenicilliumspecies Jj.AntonieVanLeeuwenhcek,2O07,91(2):179—189. 『12]DUt~NTJ,MAGNINS,MARTIA,eta1.Moleculartoolsforidentification ofPenicilliumstarterculturesusedinthefoodindustry[J].JFoodMi- crobiol,1999,49(3):109—1墙. [13]林晓民,李振岐,王少先.真菌rDNA的特点及在外生菌根菌鉴定中的 应用[J].西北农业,2005,14(2):120—125. [14]赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西 农业科学,2OO4(4):35—37. [15]陈剑山,关阴艮丛.rrs序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农 业科学,2007,35(13):3785—3786. 『l6]JANS0JE,BERNANvS,CREENSTEINM,eta1.PeniciUiumdr丑,,llI1i,a new珊ne—dvedspeciesImanalgainFiji[J].Myc0l0舀a,2,97 (2):444—453.