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小鼠染色体的制备、观察、染色.doc

小鼠染色体的制备、观察、染色

贾于虑
2017-12-03 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《小鼠染色体的制备、观察、染色doc》,可适用于高等教育领域

小鼠染色体的制备、观察、染色生命科学学院LifeScienceCollege姓名:柳伟雄班级:级生科一班学号:同组者:曾玮璠山东大学实验报告年月日姓名,柳伟雄系年级,生科一班级同组者,曾玮璠科目,细胞生物学实验题目,小鼠染色体的制备、染色、观察一、目的和要求初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法了解各操作步骤的原理。了解常用实验动物染色体的数目及特点。认识不同生物染色体的特征学会做染色体组形图。二、原理凡处于活跃增殖状态的细胞或者经过各种处理后任何动物组织的细胞就可进入分裂均可用于染色体分析。在正常动物体内精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期然后采用常规空气干燥法制备染色体即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠不需要经体外培养和无菌操作易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方面精巢又比骨髓要简易一些故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作一般包括以下几个要点:用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处用低渗法使细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。Giemsa染色是最常用的染色方法之一适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色胞浆染成粉红色在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。三、试剂和器材试剂:秋水仙素、生理盐水(的NaCl溶液)、KCl低渗溶液、固定液(甲醇:冰醋酸=:)、Giemsa染液Giemsa染液的配制:吉姆萨粉(Giemsastain)甘油(AR)甲醇(AR)将Giemsa粉放入研钵中先加入少量甘油研磨至无颗粒为止然后再分批加入甘油放温箱中h后分批加入甲醇将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于~保存)。使用前将母液用PBS稀释后使用。器具:解剖盘、镊子、眼科剪、小烧杯(×)、吸管、玻璃刻度离心管、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等材料:小白鼠四、实验步骤制片取雄性小鼠以每克体重μg注射秋水仙素经,小时后断头法杀死小鼠取出睾丸用生理盐水(的NaCl溶液)洗去血污。将睾丸放入装有mlKCl低渗溶液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。用铜网过滤到玻璃刻度离心管中再加KCl缓冲溶液至ml。静置min进行低渗处理。以,rmin的转速离心min。取出离心管弃去上清液加入ml固定液(甲醇:冰醋酸=:)并用吸管至管底吹气轻轻打散细胞固定min。再以,rmin转速离心min。弃上清加入ml固定液再制成细胞悬液固定min。取洁净的低温预冷载片距载片,cm高度滴下,滴细胞悬液从载片一边向另一边轻轻吹气同时轻轻敲打载片以使细胞均匀分布和促使染色体展开。用滤纸擦去载片上多余液体空气干燥或成文火干燥。染色用Giemsa染色,min细水冲洗玻片背面去多余染液气干。本实验染色采用倒置染色法具体方法如下:在玻璃板上用废旧载玻片作支架使标本载玻片的标本面向下放置到支架上在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液目的一可以节省染料二可以避免染液快速挥发三可以防止染液颗粒沉淀影响观察。在操作时应注意多个样品同时染色应摆放紧密不要有间隙滴染液时应尽量慢不要有气泡以免部分染色体不被着色。镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。五、实验结果本实验采用的是小鼠的精巢部分细胞处于减数第一次分裂中期这样的细胞是二倍体应有条染色体有些处于减数第二次分裂中期这样的细胞是单倍体应有条染色体。还有一些细胞处于分裂期但不是中期这类细胞染色体的凝集程度不是很高。经过仔细查找最终找到处于减数分裂中期的染色体。如图处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体(、对染色体为亚端部)呈“V”字形或“U”字形。由于重叠较多数目难以数清。六、注意事项断头法处死小鼠后血液要冲洗干净以免影响之后的实验的进行。从开始加入KCl低渗溶液至恒温水浴低渗处理结束时间控制在min以内。两次离心的转速控制在,转分不要太高以免破碎细胞。滴片时使滴管与载玻片间的距离尽量远这样细胞才能被“摔碎”使眼睛、滴管、载玻片竖直成一条直线保证细胞悬液能被滴在载玻片上。滴完片之后将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打使未破碎的细胞破碎。多个样品同时进行染色时载玻片应摆放紧密不要有间隙滴染液时应尽量慢不要有气泡以免部分染色体不被着色。七、结果分析实验中发现细胞分散比较均匀但是染色体展开并不完全这说明低渗这一步骤可能没有做好使得染色体不能完全展开。

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