斑马鱼尾鳍再生及小鼠大脑、心脏与棕色脂肪组织的节律性研究

斑马鱼尾鳍再生及小鼠大脑、心脏与棕色脂肪组织的节律性研究 斑马鱼尾鳍再生及小鼠大脑、心脏与棕色脂肪组织的节 律性研究 南开大学 博士学位论文 斑马鱼尾鳍再生及小鼠大脑、心脏与棕色脂肪组织的节律性研 究 姓名:邵金平 申请学位级别:博士 专业:神经生物学 指导教师:李雷 2012-05摘要 摘要 哺乳动物组织和器官的再生能力随着重复受伤或年龄的增长而逐渐减弱。 近年来斑马鱼成为新的脊椎动物模式生物被用来研究组织和器官的再生。斑 马 鱼的许多组织都具有很强的再生能力,如视网膜、脊髓、肾、心脏和鳍。本 研 究检测了连续损伤尾鳍对再生的影响以及不同年龄斑马鱼尾鳍的再生情况。 通 过原位杂交和比较不同再生阶段的标记基因,,在新 生组织中的表达,发现在重复多次切断尾鳍的斑马鱼中,基因表达量与第一次 切断尾鳍相比没有显著性差异,表明重复损伤对尾鳍的再生能力没有影响。在 再生初期 .,不同年龄组斑马鱼断尾后组织外长和相 关再生标记基因的表达无显著差异,表明尾鳍再生与年龄无关。总之, 通过形态学和基因表达的分析,表明斑马鱼尾鳍具有无限再生能力。 正常条件下,哺乳动物的许多生理进程显示出每日的变化。当这些日变化 模式在相同条件下恒定持续存在,即定义为昼夜节律一 。昼夜节律由 内源性生物钟驱动。研究发现糖皮质激素,对外周组织生 .物钟的调节在体内和体外均具有重要影响。昼夜节律在心脏组织无论是分子水 平还是功能层面上都明显存在。先前的研究显示在一天的某个特定时间糖皮质 激素受体激动剂地塞米松会影响心脏生物钟基因的表达。鉴于生物钟 基因对的敏感性研究,本实验研究了对心房组织的影响。通过对和 .转基因小鼠体外心房组织培养,检测了处理对心房生物钟的 影响。据报道对视交叉上核中表达节律没有影响,但会改变肝 脏表达的节律相位,因此本研究对和肝脏也进行了研究。结果发现不 同时间点培养会影响心房生物钟的相位变化。结合培养液处理后观察到的相位 转移,表明心房生物钟对操作处理存在时间依赖的敏感性,这与组织每天的机 械活动变化如心脏的伸展和收缩运动高度相关。也引起心房组织生物钟的 相位转移,这种相位转移与肝脏处的显著不同,二者显示了距处理前最后一峰 值的处理中除.夕所有时间点组织的特定反应。此外,心房组织中 .的表达没有节律性,但却能诱导出节律,而.有节律性摘要 并且在生理周期的特定时间有很强的振幅反应。这些数据表明心房生物钟在体 外具有生物钟特点并对糖皮质激素存在明确的敏感度。 正电子发射断层扫描技术 是一种非 侵入的定量原子能成像技术,被广泛应用于临床诊断和临床前的实验。通 常利用.氟代脱氧葡萄糖作为示踪剂成像。这种成像技术提供了检测 对葡萄糖高需求组织如心脏、大脑和各种癌症组织等的功能信息。本实验利用 成像技术检测了/小鼠活体内大脑、心脏和肩胛间棕色脂肪组织 在光照.黑暗周期内对的摄取变化。数据显示整个大 脑对的摄取具有显著的高振幅节律性,在周期的黑暗中间阶段达到高 峰,此时正是夜行性小鼠活跃的阶段。此外,所检测的大部分大脑区域对 的摄取也均表现出‘的变化模式,包括在先前研究中报道的个别对葡萄糖利 用没有差别的区域。相同条件下,相同小鼠的心脏对的摄取在一天中不随 时间改变,但存在生物学的波动。本研究表明在临床和临床前必需控制对大 脑 摄取的扫描时刻,同时表明在一天的不同时间测量的波形需 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化。 的神经和内分泌调控具有明显的昼夜变化。本实验结果显示对 的摄取具有很强的变化分布,峰值大约在光照阶段的第。对 摄取的昼夜节律观察使得该组织成为代谢和节律系统之间相互作用的候选 位点。此外,通过对个体内和个体间在一天的不同时间摄取的检测,显示 了内小鼠对摄取模式的生物学和技术方面的可重复性。 关键词:斑马鱼,再生能力,昼夜节律,地塞米松,埔一氟代脱氧葡萄糖,正电 子发射断层扫描技术 /./ ., .,., ,, . .,. ., . ,. , . ,. . . , ,., , . . , ? , . . .州, . , 哲.甜 . . 姆 , , ? , / . , . , , . 。., ? ., .. ,.. ? ,, . :, ,,, ”, 南开大学学位论文使用授权书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用 管理办法 关于高温津贴发放的管理办法稽核管理办法下载并购贷款管理办法下载商业信用卡管理办法下载处方管理办法word下载 》,我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 。南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权,即:学位获得者必须按规定提交学位论文包 括纸质印刷本及电子版,学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文, 并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》;为教学和科研目的,学校可以将公开 的学位论文作为 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 在图书馆等场所提供校内师生阅读,在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务;根据教育部有关规定,南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文;学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及其万方 数据电子出版社和中国学术期刊光盘电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并 收入相应学位论文数据库,通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发 表论文的权利。 非公开学位论文,保密期限内不向外提交和提供服务,解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站:://...:/.。 本人承诺:本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品,并已通过论文答辩; 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致,如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份,由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字: 邵金壬 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目 斑马鱼尾鳍再生以及小鼠大脑、心脏和棕色脂肪组织的节律性研 究 姓 名 邵金平 学号 答辩日期 年月日 博士? 高校教师口 论文类别 学历硕士口 硕士专业学位口 同等学力硕士口 , 防系/所 医学院 专业 神经生物学 . 通信地址邮编:天津市南开区卫津路号南开大学医学院 备注: 否 是否批准为非公开论文 注:本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式 两份签字后交校图书 馆,非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。符 号说明 符号说明 缩略词 英文名称 中文名称 切断后小时尖端表皮帽外胚层嵴尖极性活动区成纤维细胞生长因子~ 骨形态发生蛋白 ’ 视交叉上核 核定位信号核输出序列 鹤 生物钟调控基因节律时间授时时间地塞米松 下丘脑一垂体一肾上腺 碱性亮氨酸拉链 光照一黑暗 光照一光照黑暗一黑暗 糖皮质激素 糖皮质激素受体促肾上腺皮质激素 相位反应曲线正电子发射断层扫描.射 线计算机断层扫描.氟代脱氧葡萄糖 ?. . .脱氧..葡萄糖 白色脂肪组织 棕色脂肪组织 标准摄取值 第一章综述?斑马鱼尾鳍再生 第一部分成年斑马鱼尾鳍再生能力的研究 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 斑马鱼作为模式脊椎动物吸引了全世界大批实验室和科学家围绕其展开了 各方面的研究,尤其是生长和发育的研究。这与斑马鱼的优点是离不开的: 成年斑马鱼个体小,易于饲养。成年个体长度仅为.,因此在有限的空间内 可大规模养殖,较适于大样本的研究。发育快速、性成熟周期短。受精后 室温培养约 即可完成第一次有丝分裂,之后大约每隔便分裂一次; 发育至相当于人类的胚胎,此时主要的器官原基均已形成,许多器官 清晰可见,因此只需在较短的时间内即可观察到胚胎发育的全过程。性成熟 早,繁殖能力强。月龄斑马鱼便性成熟,即可开始生产后代。繁殖周期约., 可进行连续多次交配繁殖,且产卵数量大,雌鱼每次可产卵上百枚。体外 受精和发育,便于操作和观察。斑马鱼行体外受精,胚胎在母体外进行发育。 受精卵直径约,易于观察和显微操作。发育初期,色素未发育,整个斑马 鱼个体是透明的,可以较直观地观察和跟踪器官发育的过程,包括内脏器官的 形成和细胞的迁移运动。也可根据实验需求人为加入相应的药物短暂抑制从而 推迟色素发育,延长透明时间。较完善的胚胎和遗传学操作技术,例如细 胞标记和移植以及细胞谱系跟踪等技术。此外,单倍体和多倍体的成功培育。 对于基因功能方面的研究,众多技术得以发展和成熟,如通过显微注射过量表 达基因的技术,利用吗啉代沉默基因表达的技术,荧光蛋白转基因技术。随机 及定向诱变的技术等。最为重要的是遗传突变方法多且简单,容易操作,适合 高通量筛选突变体。斑马鱼基因组与人类基因组相似度高。其相似度可高 达%,现己完成对斑马鱼基因组的测序。另一方面,斑马鱼的心血管系统、 神经系统、消化系统、肾脏以及视觉系统与人类的对应系统也有较高的相似度。 因此可充分利用斑马鱼从基因水平研究推动人类相关疾病的研究和治疗。 为了阐明调节所有肢体生长和形态发育的信号通路,己在许多模式生物中 做了大量基因表达、转录和组织移除以及基因敲除的实验。这些研究提供了巨第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 大的信息揭示调节肢体轴形成、生长和图式形成的分子机制。最近,鉴于斑马 鱼的尾鳍具有很强的再生能力,尾鳍切除手术操作简单,再生过程生长速度是 发育中的.倍,越来越多的研究者把损伤和再生与斑马鱼的尾鳍联系起来, 利用斑马鱼尾鳍研究再生过程中相关的分子机制。研究表明再生过程中和发育 过程中相关基因的表达模式非常相似,表明再生过程中和发育过程中调节细胞 增殖和分化的机制是可以比较的【.】。因此,尾鳍再生的机制可以代表个体发育 中的情况。利用斑马鱼尾鳍,通过遗传学的、细胞生物学的和分子生物学的方 法研究正常尾鳍生长和尾鳍突变的斑马鱼尾鳍发育和生长的作用机制,对肢体 发育和生长的分子机制的阐明具有重要的推动作用。 第一节斑马鱼尾鳍的基本结构与再生过程 ..斑马鱼尾鳍的基本结构 斑马鱼的鳍可分为偶数鳍和奇数鳍。其中,偶数鳍包括胸鳍和腹鳍;奇数 鳍包括背鳍、尾鳍和臀鳍。尽管这些鳍数量、长度和颜色等表型不尽相同, 但 它们都是由相同的骨骼成分构成。骨骼可分为外骨骼和内骨骼。外骨骼突出可 见,由起源于真皮的骨质构成。内骨骼则由软骨发育而来。通常内骨骼位于身 体内,是不可见的,并且切除内骨骼后,不能再生。 外骨骼具有再生能力,由骨质的鳞质鳍条和未矿化的角质 鳍条组成。鳞质鳍条由多节骨质片段简称骨节相连而成。 每个骨节又由对称的两个半片相对形成,两半片内部中空,含有神经、血管、 成纤维细胞和结缔组织等请引来艄引用氟。磷脂鳍条间则由间质组织相连接【。一般 而言,尾鳍由.根鳞质鳍条组成,除最外侧的两根鳍条外,中间的每根鳍条 在末端会形成分叉结构图.。斑马鱼的鳍条生长是通过增加骨节而延长,并 非通过延长每个骨节的长度,并且鳍条的生长贯穿其整个一生【】。角质鳍条位于 磷质鳍条最末端,属于一种特殊类型的胶原【。尽管角质鳍条与鳞质鳍条有相似 的特点,但其发育特征始终不清楚。 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 厂 宁吣 .垩 弋 ‘;: 黼习 藿 ? 喜 ??一。暴 力 ? 图.斑马鱼尾鳍结构 左图,斑马鱼尾鳍经钙黄绿素染色后骨质鳍条清晰可见。尾鳍一般由.根鳞质 鳍条 组成,除最外侧的两根鳍条外,其余鳍条在末端会形成分叉结构。右图为其中 一根鳍条组 成的示意图。每根鳍条都是由鳞质鳍条和角质鳍条两部分 组成。鳞质鳍条由两个半片相对组成的骨节一一相连而成。骨节内部中空, 含有神经、血 管、成纤维细胞和结缔组织等。 ..斑马鱼尾鳍的再生过程 鳍再生是一个非常迅速的过程。图.显示了尾鳍磷质鳍条再生过程中发生 的早期事件,在?尾鳍再生可分为个阶段.】。第一阶段. .,伤口愈合。切断鳍条后,伤口附近的表皮细胞迁移并 重排,覆盖伤口,形成尖端表皮帽。第二阶段大约. ,芽基 形成。位于伤口下大约个骨节处的结缔组织以及位于鳍条间的成纤维细胞和 成骨细胞变松散,细胞发生紊乱并重新组织,呈现纵向梯度,向伤口表皮迁移, 形成芽基组织【。芽基由一群位于伤口表皮和切断面之间的间质细胞组成,是 细胞增殖形成的一种暂时结构。芽基的形成是切割处再生所必需的,但哺乳动 物再生组织缺乏芽基结构。这可能是蜥蜴、蝾螈和斑马鱼具有较强的再生能力 与哺乳动物具有有限的再生能力的区别之处。第三阶段完成再生,再 生组织外长。在不成熟的芽基细胞中增殖事件进行地非常缓慢,细胞周期期 持续之久。随着再生的进一步发展,在切断尾鳍后,芽基细胞在形态学 上分为不很明显的两部分锻蝽蹦引胍’。远端芽基为最远处内的细胞。这些 细胞的增殖非常缓慢,决定着生长的方向。近端芽基位于远端下内,该 区域芽基增殖迅速,分裂的细胞迁移到新的位点最终分化形成切断的组织【】。第一章综述~斑马鱼尾鳍再生 在此期间,鳍的生长速率约每天平均生长个骨节长约。 新再生出来的鳍与原长一致,表明在发育和再生过程中存在着一种机制来 调节鳍的长度。然而,再生的鳍并非是原来鳍完全的拷贝,因为在再生的鳍巾 磷质鳍条第一个分叉会被重新定位。一般而言,切断面与第一个分叉间大约有 .骨节。这个特性是鳍所特有的,因为在再生的肢体中,缺失的部分被完全和 功能性的代替。只有外源性的类视黄素能通过视黄酸受体亚基的特异性表达 引 发肢体再生节段的缺陷和差异【】。 . 缸 ’、 ?. 一 % ~ 、一 、 ,?.. 图.斑马鱼尾鳍再生过程 第二节斑马鱼尾鳍再生过程中的信号通路 蜥蜴、蝾螈、鸡、小鼠和斑马鱼中的研究表明许多信号通路参与调节肢体 的发育和生长。、和家族的成员诱导的形态发生素能够参与细胞内 信号传导事件。这些信号通路在肢体发育中都有着重要的作用,并且这些信 号 通路之间经常存在着密切的联系,既所谓的.。 研究尾鳍再生的肢体生长模型的目的是研究参与调节该事件所必需的信号 通路,特别确定在芽基分化、近端芽基增殖、细胞分化中起重要作用的分子。 在脊椎动物肢体发育过程中,首要的第一步是位于肢芽处信号中心的建立。 通 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 过分泌信号分子如、、、和等,调节断处组织的生长 及图式形成。在斑马鱼中,对基因的研究已经表明这些分子及其他信号分子 在 再生过程中的调节作用【。这些分析结合基因在再生中定位的研究将促进对 再 生外长过程中必需的信号通路之间联系的理解和研究。 ..远端芽基和基底上皮的信号 成纤维细胞生长因子是一类短多肽大家族成员,通过一系列的酪 氨酸激酶受体即成纤维生长因子受体发挥作用。其中个成 员已在脊椎动物中得到证明【引。当受体与结合后,会形成二聚体并自动磷 酸化,进而导致激酶活化。从而激发一系列的细胞内信号级联反应,激活细胞 核内的靶基因。信号参与哺乳动物伤口愈合和肿瘤血管生成,同时在胚胎 发育中也发挥许多作用【,,包括前后轴的图式发育】、诱导中胚层【、血管 生成【、轴突延伸【】和副肢形成【】等器官发生过程中的诱导和图式发育 等。 通路的异常会导致肿瘤发生和干细胞紊乱团】。尽管对诱导的信号传导机制 已经被广泛研究【,但其下游靶基因依然知之甚少。 在两栖类动物肢体和鱼类鳍再生过程中,信号相关因子是芽基形成的必 需调节因子。非洲爪蟾蜍中,肢体发育晚期肢体已经丧失再生能力,.的 积累能够重新激活再生【。鸡和蝾螈中,.也能刺激肢体再生【矧。在斑马 鱼鳍再生过程中,的受体和配体在芽基形成和再生外长阶段均有表达【引, 斑马鱼的在芽基形成期表达于前芽基间质细胞,在再生外长时期表达于芽 基的亚群细胞和表皮细胞【。有研究表明在尾鳍再生过程中调节芽基细胞 的增殖。此外,在斑马鱼/无义突变体中,上皮形成变得异常,芽 基形成受到抑制,最终导致尾鳍无法再生蝴嘛找刊引脯。。正常情况下,在断 尾后开始表达于表皮和间质交接处以及芽基细胞,在达至最高水平,随 后开始下降?。研究证明表皮细胞中对心脏切割处的再生是必需的【】。在 斑马鱼尾鳍再生过程中信号通路参与调节位置依赖性的再生速率【。等 提出减少鸾瞒号的传输会减弱甚至停止再生。因此,信号通路转导是启动 芽基形成和外长所必需的,的表达水平在生物体内也是被严格调控参与调节 再生进程。研究表明信号通路参与调节的表达,而 会激活 通路的下游转录因子如储误未找到引用源。。因此,湘信号通路共 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 同参与再生的启动过程并相互调节。 在尾鳍再生过程中参与再生早期所必需的两个信号中心的建立,这两 个信号中心分别是远端芽基和侧面基底上皮层【。其中远端芽基是调节近端 芽基细胞增殖的信号中心。该中心根据的表达划分【。抑制的功 能会阻止第二个信号中心即侧面基底上皮层的形成【】。这个中心是骨细胞 分化 和尾鳍生长所必需的,其代表基因是。这两个中心阳性的细胞是非增 殖的图.。 抑制..信号也会阻止早期远端芽基和侧面基底上皮层的特定分 化【】。研究发现抑制..信号通路,的靶基因不能表达。表明 ..信号通过发挥作用【。另一方面,..似乎在 的下游发挥作用,因为的一个活化基因突变体不能表达..的 靶基因错误未找到引用源。。因此,酉和..信号通路也共同 作用于再生过程中两个信号中心的形成。 ..远端芽基信号中心是细胞增殖所必需的 任何扰乱表达的处理都会阻止近端芽基细胞的增殖,进而阻止尾鳍的 再生外长【,’刁】,表明不仅是远端芽基的标记基因,也是功能标记基因。 研究发现敲除会阻止细胞增殖和尾鳍生长,证实直接或间接调节芽 基近端细胞的分裂【引。 除了..和信号通路,还存在至少一种不依赖的机制参 与调节的表达,调节再生外长。是信号通路的抑制因子。 其异位表达会导致表达的减少和细胞增殖的减少【引,表明信号通路 也是尾鳍再生所必需的。然而,只有在远端芽基表达【】,推测它可能是调 节表达的一个候选分子。总之,..、和信号通路是远端 芽基发挥其功能所必需的,也是后续细胞增殖和尾鳍再生外长所必需的。它 们 之间的相互关系如图. 。 第一章综述?斑马鱼尾鳍再生 国 : .? : 只 避~ ‘ ‖玲曲 『蛔 》 . 疆。 她: .? :: . ,嚣曲 ‘妄燃:.嘣黜 ; ? 上 // ’ 丫 聊 . 赢磊如’ 拍叭 . . 千 剥 ;喇 . ‘旨嬲徽? , 仃?蚴 洲 ,’ 山 ./’ 上 妁诗卜 ’?鲥 讲:. 。姬 图.再生过程信号中心的建立和再生外长的启动 ,鳍条再生纵切面卡通图。,远端芽基和侧面基底上皮层信号中心建立、细胞 增殖 和再生外长所需的信号通路。,图中相关分子修饰后对基因表达和再生外长 的影响。 .. 信号通路调节图式发育和增殖 在尾鳍再生过程中,围绕新骨发育的地方在侧面基底上皮层基因表达上 调。表达细胞下部的基底上皮层细胞和间质细胞中都有下游基因的表达。 研究表明,下游靶基天的异位表达会导致早期成骨细胞转录因子和其他 成骨细胞分化必需基因的上调表达【。或者在鳍条间的异位表达均会导 致异位骨骼的形成,表明这两个基因都是骨骼发育所必需的【刊】。因此,可 能直接调节的活性图.。 利用信号通路的抑制剂环杷明阻断的功能不能干扰再 生过程中骨骼的形成【。这表明在尾鳍再生过程中信号通路可能替代 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 信号通路调节骨骼的形成。一种可能性是存在依赖和不依赖两种 方式调节一个或多个基因的表达。研究证明介导的信号通路的 抑制会阻止与成骨细胞分化和成熟相关基因的表达【。 巨 : 。 : .. :. :;缸 : . . 妇。 / 甲;;:篙勰郴 。训?舻?删?州?勰麓一 : . 州.。。......。。..一~一~一 图.再生尾鳍中骨骼的图式发育 ,再生鳍条纵切面卡通图。,骨形成和图式发育需要的信号通路。,图中相关 分 子修饰后对基因表达和再生外长的影响。 阻断的功能会导致表达的下调和细胞增殖的减少【 ,表明维持基 底上皮层也是维持远端芽基必需的。由调节的分子通路现在还是未知的。一 种可能是基底上皮的和远端芽基的绝之间的信号是相互关联的。因此, 阻断的活性可能同时导致生长阶段表达的减少和维持细胞增殖能力的 丧失【】。这种机制可能参与协调再生外长和相关的图式发育。第一章综述 一斑马鱼尾鳍再生 第三节 脊椎动物和非脊椎动物肢体再生的相似性 在小鼠和鸡肢体发育中,细胞的突起物即所谓肢芽的形成,是肢体发育的 起始。肢芽由中胚层衍生的细胞形成,外有一层表皮包裹。外胚层嵴尖 是肢芽最远端形态学上不连续的上皮区域,它是肢体近端一远端连续生长所 必需 的,也是中胚层后期第二信号中心建立需要的。发挥正常功能是确保 前后轴图式发育所必需的,通过的活性介导前后轴图式发育。肢体发 育早期,..信号是形成时信号通路的上游信号【删,这与在斑 马鱼尾鳍中..在早期的功能相似。信号通路是中表达必 需的,同样对于骨骼的图式发育也起着非常重要的作用【?。因此,在尾鳍中 尉 的活性对以为基础的信号中心的建立有促进作用。同时,信号通路也是 和细胞增殖以及肢体生长时维持信号通路活性所必需的【。尽管在斑 马鱼中远端芽基和基底上皮层之间相互关联的信号通路还很缺乏,但是这两 个 区域的信号通路对增殖和生长都是必需的。 分子介导小鼠、鸡、果蝇【】和斑马鱼肢体的前后图式发育和生长。前面 提到在斑马鱼尾鳍再生过程中,是的上游基因,这两个基因可诱导异 位骨的形成。同样地,在小鼠和鸡中,的异位表达会诱导的表达【搿】。 然而,在小鼠和鸡肢体发育中这种相互作用可能是间接的。因为研究发现, 在 前肢芽异位表达会导致骨骼成分的镜像对称复制体的形成,不表达会导 致平截样肢体的产生。相反地,的异位表达不能诱导镜像对称复制体的形 成,表明没有直接调节的功能。 在果蝇中,表达于腿和翅膀成虫盘的后部,会激活前后交界细胞中的。 在小鼠或鸡的肢体中前部的异位表达会导致镜像对称复制体的产生,功能 的丧失也会导致平截样肢体的产生。与小鼠和鸡中的情况相反,在前部异 位表达或缺失能够模拟出异位表达或缺失的表型,表凋直接介导信号的 传导【。斑马鱼中能够诱导异位骨,这与异位表达结果相似。因此, 小鼠中调节的图式发育可能更相似于果蝇中的情况图.。总之,三者最 相似之处是连续的活性是细胞增殖和生长所必需的。 第一章综述一斑马鱼尾鳍再生 节. 余。印 图.不同模式生物肢体生长的分子机制 ,小鼠或鸡;,斑马鱼;,果蝇。 第四节尾鳍再生未来的研究方向 与肢体自身生长相关的大量分子信息相比,肢体生长的终止机制还未阐明。 在小鼠和鸡中,和之间相互作用的信号通路是持续生长所必需的。因 此,一种可能性是或信号的终止导致再生组织生长的终止【。另一种 可能性是随着远端肢体部分的完成诱导了活性更强的机制抑制再生生长【。现 在对斑马鱼尾鳍的研究也致力于最终大小是怎样完成的。 斑马鱼身体和尾鳍的生长贯穿生命整个过程。然而,当尾鳍被切断后,尾 鳍会以非常快的速度生长,直到完成切断前的大小,然后再恢复到正常个体发 育的生长速度。研究发现尾鳍再生所需的时间与切断尾鳍的长短无关。换言之, 切断不同长度的尾鳍,完成再生所需的时间是相同的,表明再生的速度取决于 断端的前后水平【 。细胞的增殖速度在较近的断端比较快,推测残余的组织含 有生长多长才能完成其原有大小的信息。 前面已经说到在尾鳍再生过程中信号通路的重要性,通过检测龟丘靶基 因的表达水平,发现与尾鳍再生远端相比,近端西的三个靶基因都上调表 达,并且这些基因表达于较大的区域范卧”】。利用:转基因鱼通过 减少的表达检测龟丹的表达水平对生长速度的调节作用。结果表明,抑制 琶仔会限制其靶基因的表达,最终导致细胞不能增殖和尾鳍再生障碍,并且这 种抑制作用属于剂量依赖型。因此,龟行信号通路参与调节尾鳍的生长速度。 第一章综述?斑马鱼尾鳍再生 此外,研究发现在这种转基因鱼中抑制留信号通路会阻止祖细胞向再生组织的 聚集,从而导致心脏停止再生【。因此,推测薛在尾鳍再生中也起着类似的 作用,艮的活性直接调节增殖的祖细胞数量。随着对心脏和尾鳍的进一步 研究将会更好的阐明与活性相关的机制。 第五节结束语 斑马鱼尾鳍代表着一种方便有效的再生模式系统,通过对尾鳍再生的研究 可以揭示控制正常生长细胞的分子机制。与已完成的其他物种肢体发育和生长 的结果相结合,将更有助于揭示普遍的和物种特异的肢体生长原理。此外,斑 马鱼具有很好的优势来研究控制生长的机制,包括最终大小的完成和疾病表型 的阐明。 参考文献 错误未找到引用源。第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 第一节前言 哺乳动物组织和器官的再生能力在经历多次受伤或者随着年龄的增长会逐 渐减弱。这可能与祖细胞的增殖和分化能力的衰减有关错误未找到引用源。。 一直以来两栖类动物作为重要模式生物被用来研究组织和器官的再生【.】。近年 来斑马鱼成为新的脊椎动物模式生物被用来研究组织和器官的再生。和两栖类 动物一样,斑马鱼展示了很强的成熟组织再生能力。这些组织包括视网膜、脊 髓、肾、心脏和鳍错误未找到引用源。。鳍作为再生研究模型对于研究组织 再生尤为有效。尽管鳍可能在表型上存在差异,如长度、颜色等,但是它们都 是由相同的骨骼成分构建错误未找到引用源。。受伤后斑马鱼的鳍会迅速再 生恢复。例如,切断尾鳍后数小时内表皮细胞向伤口迁移并积聚,间质细胞重 组并开始增殖,新的骨节逐渐增加到再生鳍条的末端,直到达到最初的长度完 成再生错误未找到引用源。。 与斑马鱼鳍再生相关的基因和信号通路早已开始研究错误未找到引用 源。。例如,基因是编码成纤维生长因子家族的一员。等错误 未找到引用源。曾报道的表达在再生的起始阶段发挥着重要作用。 表达的减少会抑制再生。错误未找到引用源。等和和 错误未找到引用源。揭示也是鳍再生过程芽基形成所必需的。 编码转录抑制子,该因子一般出现于增殖细胞中。在再生过程中, 既表达于增埴细胞也表达于非增殖的芽基细胞。抑制的表达会导致鳍外长 的减弱错误未找到引用源。。 现在斑马鱼鳍再生的细胞事件和分子机制已经得到很好的阐述,但是鳍再 生的潜能需要被进一步研究如多次受伤后的再生能力以及老年动物的再生 情 况。在这篇研究中,我们检测了不同年龄斑马鱼尾鳍连续多次切断尾鳍后的 再生情况。通过测量和比较在不同再生阶段尾鳍外长的长度和再生标志基因 的 表达,结果证明斑马鱼尾鳍具有无限的再生能力。 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 第二节材料与方法 ..仪器与软件 ...主要仪器 全自动斑马鱼养殖架 北京爱生公司 帅 体视荧光显微镜 普通体视显微镜 ? 琼脂糖凝胶电泳仪 北京市六一仪器厂 . 凝胶成像仪 普通仪 . 定量仪 小型台式离心机 台式冷冻离心机 .微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂 分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司 恒温恒湿箱 上海博迅实业有限公司 杂交炉 恒温水浴锅 北京永光明医疗设备 计 ...软件 显微镜数码相机软件 使用奥林帕斯. 该软件具有图像查看、获取、测量、处理以及控制照相机等功能。其中, 图像测量包括长度、面积、周长和角度等,而图像处理包括单色荧光图片叠 加, 拼合等。 光学检测系统软件. 斌 . 软件能高效采集数据和分析数据;同一个反应管中可同时检测至多个靶 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 基因;不需要标准曲线进行相对定量;可设定温度梯度;等位基因分析模块灵 活;检测结果可由多种模式进行查看等。 ..斑马鱼的饲养和实验材料的收集 ...斑马鱼的饲养 本实验所用的斑马鱼均为成年野生型品系。饲养于自动循环水养殖架 中,给予光照黑暗的周期。该体系实时监控并自动调节海盐水的酸 碱度和盐离子浓度,使其分别维持在酸碱度..,盐离子浓度约. /的水平。水温控制在.?左右。 ...实验材料的收集 将斑马鱼置于.%乙基米一氨基海盐水溶液配制的麻醉剂内 。待其充分麻醉后,用男子剃须刀片于尾鳍/处切断。第一次切断,记为 .。切断尾鳍后的斑马鱼放置?恒温箱使其再生 恢复。切下的组织若用于原位杂交,直接加%固定,。保存待用;若用 于的提取,加,匀浆后.?保存待用。 ..斑马鱼尾鳍再生长度的测量与分析 将斑马鱼麻醉后,断鳍前照相。于/处切断后,再次照相,置于?恒 温箱使其再生。 分别在,,,和时照相。 用奥林帕斯.软件测量每个尾鳍背侧和腹侧第二根鳍条的长度, 二者的平均值即为再生的相对长度。 ..利用扩增标记基因的特异性片段 ...材料与试剂 菌株第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 ’’气 / 上海生工 ?/,溶于二甲基甲酰胺 口% 上海生工 液体培养基:. 一 一 加..至,值调至.,高压灭菌。 固体培养基: 加..至,值调至.,高压灭菌。 ...不同再生时期斑马鱼尾鳍的提取与纯化 裂解液,用移液器反复吹打,至组织完全裂解。 将切下的组织加 加/体积氯仿,剧烈振荡。 ,离心。 转移上层水相于一新.离心管,加等体积异丙醇,颠倒数次混匀, ?静止。 ,?离心,弃上清,收集沉淀。 离心, 加冰预冷的%乙醇?配制, 洗涤。 弃上清,敞口空气干燥.,使残留乙醇挥发干净。 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 加 .,移液器轻轻吸打溶解。 . 加此 ,轻轻吸打混匀,? 和 孵育,消化残留。 力与管内等体积的酚:氯仿:异戊醇::,颠倒混匀,离心。 转移上清至新离心管,加等体积氯仿:异戊醇:,颠倒混匀,普通 离心,。 转移上清至新离心管,加.体积醋酸钠,.,.体积无水乙 醇,.?静止。 ,离心,弃上清,收集沉淀。 离心, 加冰预冷的%乙醇配制, 洗涤必。 弃上清,敞口空气干燥.,使残留乙醇挥发干净。 加. .,移液器轻轻吸打溶解,.保存。 ... 引物序列如下: ’. .’ ’.’ ’’ ’.旧.’ . :’.’ :’一.’ 第一链的合成 取“ 于管内,孵育,迅速置冰上。 反应体系: 试剂 反应体系 “?第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 . . ? 轻微离心,置仪,?,?。 取出置冰上。 加稀释到 ,.保存。 以第一链为模板进行: 反应体系: 反应条件: 罕 匿蛋 复性温度: ? ? 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 琼脂糖凝胶电泳检测 制胶:称. .微波炉高火加热置溶解,稍微冷 琼脂糖溶于 。 却,加/,倒入已插好梳子的胶盒内,冷却 ,混匀后,加样。 上样:山反应产物加肛 电泳:,。 照相:凝胶电泳成像仪照相。 ... 产物的纯化 本实验不同基因的产物使用不同的试剂盒。 使用 ,按说明操作: 加 .于产物中,混匀。 将.置于 离心管中,将中的混合液移入. 。 中,, 离心 已加入无水乙醇, 弃滤出液,于. 中加入 ’ 。 , 离心 重复。 将 置于新的.离心管中,,离心。 将. 置于新的.离心管中,于. 加入 ,室温静置后,,离心。 电泳检测并回收的产物,并估算其浓度。进行纯化,操作如下: 使用 在紫外灯下,切下含有目的基因片断的琼脂糖凝胶,用纸巾将凝胶表面液 体吸干净后,切碎。转入.离心管中称重,计算凝胶重量,把该重量 作为一个凝胶体积,如肛体积。 加入个凝胶体积的 .,混合均匀,置于?水浴加热,直至 凝胶完全熔化。 再加入.个 .体积的 .,混匀;如果分离的 片段小于,需加入个凝胶体积的异丙醇。 将步骤中的混合液,转移到制备管已置于离心管中, 离心,弃滤液。 ,弃滤液。 将制备管放回离心管,加 ,离心第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损 伤的关系 将制备管再次置回离心管中,加 ,弃 ,离心 滤液。重复此步,再用 洗涤一次,×离心。 将制备管置回离心管,离心。 将制备管转移入新的.离心管中,在制备膜中央加.山去离 子水,室温静置,离心洗脱。 ... 产物的连接与转化 载体连接: 反应体系: 产物室温静止。 用法制备大肠杆菌感受态细胞: 液体培养基中,摇床振荡过夜。 吸大肠杆菌菌液,接种到 液体培养基中,摇床振荡培养。 吸过夜培养物,接种到 将培养物转移至冰上,冰浴 。 将培养物分装至冰预冷的.离心管中,×离心。 弃上清,加冰预冷的. ,重悬沉淀,充分悬浮。 。 离心 弃上清,加冰预冷的. 山,再次重悬沉淀。 按%比例加灭菌甘油,.冷冻保存。 转化及蓝白斑筛选: 取感受态细胞至冰上溶解。 加连接液于感受态细胞中,轻旋混匀,冰浴。 ?水浴精确热激,迅速至冰上。 加 培养液,?,,温和振荡.。 培养细菌期间,将%溶于水和/ 溶于二甲基甲酰 胺以:的比例混合,涂布于含/氨苄青霉素的固体培养基 平板,每个平板混合液。避光,?正置干燥。 将培养好的菌液涂布于上述平板上,避光,?倒置培养过夜。 次日,?倒置保存。白色菌落即含有外源插入片段的重组质粒。 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 ...质粒的提取 本实验使用 提取质粒,按说明操作: 试剂盒组成: : /,室温可贮存个月,长期贮存于.? :细菌悬浮液。加入后,混合均匀,?贮存 :细菌裂解液含、,室温密闭贮存 :中和液,室温密闭贮存 :洗涤液,室温密闭贮存 :去盐液,依照说明加入指定体积的无水乙醇并混合均匀,室温密闭 贮存 : 洗脱液,室温密闭贮存 操作步骤: 将培养基中培养过夜的菌液离心,弃尽上清。 加肛 已加入悬浮细菌沉淀,应悬浮均匀,不可以 有小的菌块残留。 ,温和地上下翻转.次,充分的混合均匀,使菌体充 加入 分裂解,直至形成澄清的溶液,此步骤不宜时间过长。 注使用后应立即盖紧 的瓶盖,避免空气中的与 中的发生中和反应,导致溶菌效率降低。避免剧烈摇晃,以免基因 组污染。 加 ,温和地上下翻转.次,混合均匀,离心。 注:避免剧烈摇晃,否则会造成基因组污染。 取步骤中离心后的上清液,转移到制备管已置于离心管中, 离心,弃滤液。 将制备管重新置回离心管,加 ,离心,弃滤 液。 将制备管再次置回离心管,加 ,离心,弃滤 洗涤一次,弃滤液。 液。重复此步操作,即再用 将制备管置回离心管中,离心。 将制备管转移入新的.离心管内,于制备管的膜中央加.去离子 水,室温静置,离心洗脱质粒。 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 ...质粒酶切检测 反应体系: 山. .山 .. . ?孵育。 %琼脂糖凝胶电泳检测。 ... 质粒测序 经由公司测序,以确定插入片段的方向及序列。其中,为 正向插入; 和为反向插入; ..斑马鱼尾鳍的原位杂交 ... 标记的探针的合成‘ 质粒线性化及其纯化: 根据测序结果,分析插入目的片段的序列,确定外源基因的插入方向。 反应体系: 正向插入的质粒: × 仙 肛 . . 反向插入的质粒. “山 / . 山 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 . 混匀,?孵育。 取酶切产物,%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。 进行纯化,方法同前。 其余酶切产物用 反义探针的标记: 本实验使用,按说明操作。 反应体系: 线性化正义模板 .. .. / . . / 越 山 线性化反义模板 .山 . / .山 .山 / “ ‘ 混匀,?孵育。 取“%琼脂糖电泳检测,结果应为一条质粒带和一片弥散。 探针的纯化 剩余探针中加 ,/,?孵育。 . 终止反应。 加 ,无水乙醇,.?静置。 加. ,离心,弃上清。 加/醇配制,,离心,弃上清。 空气干燥,加. .,取“%琼脂糖电泳检测,剩余一保存。 ...斑马鱼尾鳍的整封原位杂交第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损 伤的关系 材料与试剂: %处理灭菌:含.%的; 阴离子杂交液: %去离子甲酰胺 ? 山阳离子杂交液啪: / / %处理灭菌:. . 洗液: %去离子甲酰胺 ? 洗液:含.%的: 洗液含.%的.: : ‘ 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 含.%的; 封闭液:工 . 匕蛆 . : . .操作步骤: 第一天: 将%更换为,室温洗涤次,每次。 蛋白酶处理。 室温洗涤次,每次。 %固定。 室温洗涤次,每次。 预杂交:先将于杂交炉中。预热,然后用已预热的替换 ,?预杂交。 杂交:先将探针配制,./于杂交炉内?加热,立即 置冰上使之变性,然后用含有探针的替换不含探针的, ?杂交过夜。附注:洗涤均在.摇床上完成, 第二天: 回收探针,加洗液,?洗涤次,每次。 换洗液,?洗涤。 换洗液,?洗涤次,每次。 换,室温于摇床上轻摇洗涤次,每次。 换封闭液,室温封闭。 换含抗体的封闭液,室温轻摇后,孵育,过夜。其中含第二章斑马鱼尾鳍再生 能力与年龄和重复损伤的关系 抗体的封闭液按:的比例配制。附注:。洗涤均在杂交炉内完成。 第三天: 弃抗体,加,洗涤次,每次。 换..配制,洗涤次,每次。 ,室温洗涤。 换含./左旋咪唑的 加 /于含./左旋咪唑 中,避光显色, 待特异性染色明显时终止显色。 加洗涤后,换%,室温固定。 %乙醇多次洗涤直至洗去浮色,照相。 ..斑马鱼尾鳍再生相关标记基因的定量表达 ... 不同再生时期斑马鱼尾鳍的的提取与纯化见.. ... 第一链的合成见.. ... . 引物序列: ’.’ ’一工.’’.从.’ ’一’ ’一盯.’ ’.’ ’一一’ ’.’.’ 反应体系: 试剂 反应体系 终浓度 【 × 山 . 山 . 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 反应条件: 』 引昌固 计算方法: 一。一。一。一也。一 法 ..统计学分析 所有统计学分析由完成,使用成对一检验分析,. 表示具有统计学差异。 第三节实验结果 .. 幂在斑马鱼再生尾鳍中的表达 再生标记基因女和的表达在斑马鱼再生的尾鳍中早已被阐述错 误未找到引用源。。本研究中,我们通过原位杂交和.检测了和 在断尾后不同时间点的表达水平。图.表明和在再生的尾鳍 中均有表达。尾鳍受到损伤后和均上调表达。表达水平的增加 相对缓慢,在大约达到最高水平。此时的表达量是受伤前时的将 近倍图.。随后的,其表达下降至最高点的四分之三。在再生第二章斑马鱼尾 鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 后期持续低表达图.。 切断尾鳍后勺表达迅速增加。在,其表达量较未受伤前的尾鳍 高达倍。随后表达下调。至,的表达减至峰值的四分之 一。在再生后期也持续表达图.。 . . . 疼隧融 .甏媳鬣耀臻萋 鼢旷蓼繁黼熬 如 掩一????函订二一:矗: ?彗?日勺一? 毫 ?亨害爹? 亨挚拿害毒 图. 和夸在成年斑马鱼?月龄再生尾鳍中的表达 ,年分别在、、、和时期尾鳍再生组织中的原位杂交。虚线 为切断面。标尺。和,和在不同再生时期的?结果。时的表 达量作为对照,设定为。数据为平均值标准误。。..代表无统计学差异;木.。 ..斑马鱼尾鳍的再生能力不随年龄的增长而降低 为了检测斑马鱼鳍再生与年龄的相关性,我们分别检测了不同年龄、、 和月龄斑马鱼尾鳍的再生情况。切断尾鳍后,将其放置于?环境下再 生恢复。随后检测不同时间点的组织外长和再生标记基因的表达情况。 在再生初期,年轻的和老年的斑马鱼之间组织外长和基玉和壕达 无统计学差异。在时,月龄的年轻斑马鱼其尾鳍的再生长度为. 第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 .。而、和月龄的鱼其再生长度与之相似图.。于此同时、 、月龄的鱼在矛表达量也无显著差异,分别大约 上调.倍图.,。 蠢邋歹避四髓 蕊嬲 三:“ 喜“ . 舄 , 兰 ?刁 皇 ? 琴 箩夕 箩, 箩‖ 图.不同年龄的成年斑马鱼尾鳍再生情况 ,不同年龄斑马鱼寸的尾鳍再生。虚线表示切断面。标。,不同 年龄斑马鱼时干表达的比较。分别设定月龄斑马鱼的和培的表达 量为。数据为平均值标准误。。..代表无统计学差异;丰.。 我们检测了尾鳍在再生后期,,,的外长情况。在和 时年轻鱼和老年鱼再生长度相似。例如,在,所有的再生长度均为原长切 断尾鳍前长度的%,至达到原长的%。然而,在和寸,它们 月龄的鱼尾鳍再生长度达到原长的 却存在显著差异。在时,月龄和 .%,而月龄的鱼再生长度仅为原长的%图.。在,月龄和 月龄的鱼尾鳍再生长度达到原长的.%。而月龄的鱼,仍然小于%图 .。这些数据表明受伤尾鳍的再生能力在老年鱼中有轻微的下降。 ..连续多次切断尾鳍其再生能力没有下降 通过对斑马鱼实施连续多次切断尾鳍,检测不同时期的再生情况。在再生 初期,每重复断鳍一次,每次在同一水平切断,于。下使其再生。我们检 每。、一第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 测了多次断尾后组织生长和标记基因的表达情况。为了进一步确定每次重复 切 断后的再生是由原有组织的间质细胞重新起始和发展,而并非由余留的芽基 细 胞发育完成,我们利用原位杂交和.证明了芽基组织已完全被切除图 . 和。在对照组织耳断尾后的组织和重复切除再生组织后剩余的老组 织中,均没有的表达。然而,在再生组织中,芽基正常存在,有明显 表达图.。 ? 舳 ? ? 如 一摹一屯。:砖.?。??。一 ? ? ,、誉 ? 》 ,\、 弩 图. 不同年龄斑马鱼在不同再生时期尾鳍生长长度 分别选用、和月龄斑马鱼测量、、和再生长度。尾鳍再生长度与断尾 前原长比较,标准化为%。 数据为平均值士标准误,,..代表无统计学差异: 水 .。 妻?擎,叠;:::慧;?竺?再?竺? 芝 ? 笺 暑 弓 .三? 兰 艺 ;季季蔷季 一?警 一芦一芦第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 ,在对照组织第一次断尾后立即切下的新鲜组织和再生切除芽基后的 余留原有组织第次和第次断尾或者不完全.??,.基的组织第次和第次断尾的 原位杂交。虚线表示切断面。标尺。,对应于的相应组织中的.结果。 单个表示不完全切除芽基的组织:牢.。 在再生初期,在仅断尾一次的斑马鱼和重复断尾多次.次的鱼中,到 呈鳍再生长度均约为.士.,无统计学差异图.。无论是第 一次切断尾鳍还是连续多次切断尾鳍,再生组织中标志基因和窑都上调 表达。在,矛与第一次断鳍相比无显著性差异图.和。 瓣瓣誊瀣镒羔? 羹 罟. 量 . 口 盘 主 芝 /、/// .//。/,/耋 毒 审 ? 第 毒’ 审 ? 蒂 图.成年?月龄斑马鱼连续多次切断尾鳍的再生比较 ,尾鳍的再生长度。虚线表示切断面。标尺。和,再生尾鳍中 数据 和夸的?的比较结果。分别以第一次断尾后和夸的表达量作为。 为平均值标准误。。..代表无统计学差异。 在再生后期,我们比较了不同年龄龄和月龄斑马鱼单次 或连续多次次断尾的再生情况。在所有实验的斑马鱼中,无论断尾几次, 时尾鳍的再生长度均达到原长的%左右。月龄和龄的鱼之间没有统 计学差异。我们对该时期的标记基进行定量比较错误未找到引用源。。 日无论是不同年龄的鱼之间还是不同断尾次数的鱼之间的表达均无 统计学差异图.。第二章斑马鱼尾鳍再生能力与年龄和重复损伤的关系 产零一它。蔷矗暑咎【专??一 歹八罗 红 \ 产摹一口。一??.戈心~莹心 歹‖ 铷 、 图. 月龄和月龄斑马鱼在时尾鳍的再生比较 ,第次、第次和第次断尾后尾鳍的再生外长长度。再生长度与断尾前的原长相 比,标准化为%。,对应与的表达的定量结果。第一次断尾后的 的表达量设定为作为对照。数据为平均疽?标准误。。..代表无统计学差异。 第四节分析讨论 一直以来两栖类动物和鱼作为模型被用来研究组织再生错误未找到引用 源。。在本研究中,我们通过对不同年龄的斑马鱼实施连续多次断尾,比较它 们的再生情况。我们从鳍外长和标记基因的表达两方面证明再生的起始能力不 随断尾次数的增加而下降。同时我们也证明再生的起始过程与年龄无关。然而,