蛋白质提取与纯化技术

蛋白质提取与纯化技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一，蛋白质(包括酶)的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 (一)水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等)。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐， 一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 (二)有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内(度为10%，40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低，更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升)，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸)，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此 法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 (二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadexged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 (三)根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONTFACE=宋体LANG=ZH-CN>纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章) (四)根据配体特异性的分离方法,亲和色谱法亲和层析法 (aflinitychromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 细胞的破碎 1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移 动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法:有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解 )也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF 还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的: 1、减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流;或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。 5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子 受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。 二、干燥 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。 三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，保持0,4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。 1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。 2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 缓冲液中。 3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。 蛋白质提取、纯化及分析技术(适应于微 生物、生化等专业) 实验一 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、原理与目的 多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。 本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。 二、材料与试剂 (1)马铃薯(大约每小组100-200g) (2)试剂: 0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵;0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2)配置时配 (3)实验器械与仪器设备: 试管与试管架;烧杯、玻璃搅棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋; 过滤纱布;植物组织匀浆器;pH计和pH试纸;GL-20C高速冷冻离心机; DL-7A大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤 1:粗酶提取: 水果肉组织按1:1(W/V)比例与003M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮)混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 2:盐析分级沉淀: 在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解)，然后6000rpm离心20min弃除沉淀;离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解)，再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。 四、实验结果 获得PPO粗酶液。 实验二 PPO粗酶液的纯化 一、原理 1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析 利用大分子不能进入凝胶颗粒内部 最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。(G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质) 2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，(NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来)。粗酶液从而得到纯化。 二、材料与试剂 试剂:0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇;DEAE-纤维素DE52;葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖,40、70、100等; 实验器械与仪器设备:试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等;试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤 1(葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 (1)柱材处理 称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。 (2)装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液(凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果)轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 (3)平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。 2(上样:将粗酶液上柱。 3(洗脱:用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。 4(DEAE,纤维素的处理及装柱 (1)处理 本实验采用的是DEAE,纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质;再在0.5N的HCL溶液中浸泡1,2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干;将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1,2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 (2)装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5,2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 (3)平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。 5(上样: 将洗脱酶液上样，用0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)洗脱杂蛋白。 6(洗脱: 用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。 7(测定酶活性和蛋白质浓度 实验三 PPO活性测定 一、原理与方法 PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠,0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 其方法是:在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠,0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30?恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位(U)。 二、仪器与试剂 (1)样品: 多酚氧化酶粗酶液 硫酸铵沉淀组分 DE-52洗脱组分 葡聚糖凝胶洗脱组分 (2)底物: 邻苯二酚:O.01M邻苯二酚溶液 (3)反应体系: 0.2M邻酸二氢钠,0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8 (4)器皿与仪器: 试管、恒温水浴等 分光光度计 三、酶蛋白的比活性 比活性,酶活单位(U)/mg蛋白质 四、实验结果与分析 1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410) 结果列表 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 空白 0 0 3 0.16 0.09 粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03 1 0.00 0.01 5 0.03 0.01 2 0.13 0.09 6 0.02 0.02 分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。 2. DE-52的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410) 结果列表 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 空白 0 0 3 0.03 0.05 粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05 1 0.00 0.00 5 0.07 0.02 2 0.03 0.02 6 0.03 0.00 分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。 实验四 胰酶分离提取 一、原理与目的 提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。 胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活;低与此PH酶易变性;高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000,25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N端Lys与Ile之间的 一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI变成10.8。 本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯 化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。 二、材料与试剂 1(仪器 紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等。 2(材料:新鲜猪胰脏 3(试剂及溶液配制 pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液(母液为0.8M，用时稀释一倍)、Tris、硫酸铵。 0.8M pH9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正。 三、操作步骤 (胰蛋白酶原的提取与分离: 1 (1)称取1,1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏(或用高速组织匀浆机捣碎)加1,2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推)。检查提取液中PH，若高于PH3.0时应及时用10,乙酸调节，使提取液维持PH2.5,3.0之间。在冷室5?左右搅拌提取18,24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次(时间约为1,2h)，合并滤液，此时滤液PH值较高，可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5,3.0，放置 3,5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。 (2)盐析:滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75,饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品。 (3)胰蛋白酶原得激活:将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量(约为滤饼重得1/4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5?冰箱中使酶原活化。 (4)纯化:去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5,3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40,饱和度(每升滤液加242g硫酸铵)。放置5?冰箱中5,8h,抽滤除去沉淀。 实验五 卵清蛋白分离提取 一、实验目的与原理 鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白 抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。 由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂: 1(材料:新鲜鸡蛋2只 2:仪器:抽滤瓶500,1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3:试剂: 10,TCA，用固体NaOH调调PH至1.05,1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液(每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2)，50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 ，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25?,30?，在不断搅1 拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸,丙酮(1:2V/V)，立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4?冰箱中放置过夜。 2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。 3，边搅拌边加入4?预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4?放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。 4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水(50倍)透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。 实验六 亲和层析纯化胰酶 一、实验目的与原理 生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。 本实验通过将胰蛋白酶抑制剂,鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。 二、仪器与试剂 1.鸡卵粘蛋白制备 2(Sephadex-G75的活化和偶联 2(5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 (溶于20ml水) 3(亲和层析 0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml 仪器器材:抽滤瓶500,1000ml、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器 三、操作步骤 1、鸡卵粘蛋白的制备 2、Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝胶，75,K2CO3，调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h。反应过程随时加入5,K2CO3,以维持pH的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5，洗涤。 、胰蛋白酶的亲和层析 3 卵类粘蛋白在pH7,8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH2,3时又能解离，因而掌握好上柱地PH条件和洗脱缓冲条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白地粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合地杂蛋白后，改变PH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化地目的。由于亲和层析结合地专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。 (1)亲和层析 将鸡卵粘蛋白,Sephadex-G75装柱(1×10cm),用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2,3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。 当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。 (2)胰酶蛋白和活性测定 实验七 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定 一、实验目的与原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS,复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本 身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。 本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。 二、仪器与试剂 1(材料: 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。 2(试剂: (1)丙稀酰胺(Acr母液):30,Acr (Acr/Bis) (2)10,的SDS溶液 (3)10,的过硫酸铵溶液 (4)四甲基乙二胺(TEMED) (5)分离胶缓冲液:1.5M Tris,PH8.8 (6)浓缩胶缓冲液:1.0M Tris,PH6.8 (7)电极缓冲液:10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3 (8)样品缓冲液:0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 (9)染色液:0.15,考马斯亮蓝R250，溶于脱色液 (10)脱色液:50,的甲醇，7,的冰醋酸的水溶液 (11)标准分子量蛋白。 3(仪器设备: 电泳仪，垂直电泳槽等。 三、操作步骤 1, 凝胶制备: 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏胶)，垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。 2, 上样: 分别取样品若干ml于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3,5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA(2,3mA/em)，保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1,2cm时，即可停止电泳。 3, 染色: 电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37?温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 四、结果 (略) 五、注意事项 1、 SDS与蛋白质的结合按质量成比例(即:1.4gSDS/g蛋白质)，如果比例不当，就不能得到准确的数据。 2、 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。 不能利用这次的标准曲线作为下次用。 3、 有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(α-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 4、 有的蛋白质(如:电荷异常或结构异常的蛋白质;带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。 5、 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 实验八 Western bloting 技术 一、实验目的与原理 Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合抗体。在加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白—一抗—二抗的位置即将呈现一定的颜色。 二、材料与方法 1.材料 从微生物细胞中提取的多酚氧化酶(PPO):10μl，20μl NC膜:硝酸纤维素膜 2.仪器: 电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床 3.试剂: 转移缓冲液:48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同时加入20%乙醇。 封闭液与稀释液:PBS(牛血清白蛋白) 辣根过氧化物酶显色液:现配现用 三、操作步骤 1.SDS-PAGE电泳见上个实验 2.电转 ?剪NC膜大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。 ?在转移装置中依次将三层滤纸、凝胶、滤纸、三层滤纸放在一起。 ?将装好的转移装置放入电转移槽中NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。 ?接通电源电压63V，电流90mA,转移过夜。 ?转移结束后，取出装置，依次取掉各层，用铅笔在膜的上沿做标记，切下其中一个孔所对应膜的一半。 ?NC膜的封闭:将NC膜放入一塑料袋中，加入封闭液3ml，封口，轻轻震荡2h。 ?将封闭好的NC膜放入另一塑料袋中，加入用封闭液稀释的一抗，2.8ml，封口。4? 下轻摇2h。 ?洗膜:弃去反应液，用一抗稀释液洗三次，每次10min。 将膜从PBS中取出转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min。 ?将二抗用二抗稀释液稀释，将NC膜放入塑料袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，轻轻震荡1h。 ?洗膜:取出膜转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min，三次。 ?将膜放入显色液中，室温轻轻摇动，10min。 ?待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 。 实验九 等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点 一、原理 )是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定等电点聚焦(IEF 的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以―聚焦‖. 二、仪器与试剂 1(材料:蛋白样品 2(试剂: 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100 电极液:1M磷酸(阳极液)、1M氢氧化钠(阴极液) 固定液:100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液:0.35g考马斯亮蓝R,150溶于300ml脱色液中，加热到60,70?，加入0.3g硫酸铜。 脱色液:25,乙醇、8,冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1,Ampholine 、2,Triton X-100、9M尿素 三、操作步骤: 1, 样品制备: 用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。 2,制模具: 洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。 3, 配胶: 胶液组成:6ml胶母液(10,，19/1) 6,8,尿素 1ml Ampholine (pH3.5-10) 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 4, 灌胶:配好的胶迅速灌入模具 5, 电泳: 等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。 6, 表面电极测定蛋白质的pI 7, 固定:取出塑料片，放入固定液中15min 8, 染色:取出塑料片放入染色液中65?染色，直至条带出现 9, 可脱色至背景消除后干燥保存。 四、结果 (略) 五、注意事项 1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2%-3%较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。 核酸技术 实验十 染色体DNA的提取 一、实验目的与原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。 二、材料以方法 1、 材料:培养菌体 2、 仪器设备:超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、 试剂: 细胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇 无水乙醇，70,乙醇，异丙醇 3 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液 三、操作步骤 (1) 培养菌体 (2) 加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65?下20,30 min，然后加入等体积的氯 仿，轻摇 (3) 12000,15000rpm离心15 min (4) 取上 蛋白质提取方法 蛋白质提取方法,,,,,,-列举10种方法 一、 植物组织蛋白质提取方法(summer) 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4?或11100rpm20min4? 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液:300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳～ 二、 植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20?的条件下过夜，然后离心(4?8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4?8000rpm以上1 小时)，然后真空 干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15?8000rpm以上1小 时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4?待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80?备用。 药品: 提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点～当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少～ 三、 组织:肠黏膜 (newinbio) 目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤: 含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min 离心:12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95,乙醇:(2ml每1mlTRIPURE 用量) 振荡，置室温20min 离心: 7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95,乙醇步2 次 沉淀中加入100,乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心: 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1,SDS溶解沉淀 离心:10000g，10min，4度 取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT) 存在的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 :加入1,SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶,测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决:提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5,10分钟，效果很好的。 四、 lysis solution:(yog) Protein extraction buffer (Camiolo buffer): 100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g (0.3M) NaCl 1.753g (0.1M) L-arginine basic salt 1.742g (0.01M) EDTA-HCl 0.292g (0.25%) Triton X-100 250. ul up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter. 1. Freeze tissue in liquid nitrogen. 2. Rinse in PBS then mince. 3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue. 4. Homogenize for 1 minute at 4\\,C. 5. Spin at 3,000. rpm/15 minutes/4\\,C. 6. Remove supernatant ,nd save in another tube. 7. If necessary, dialize the supernatant against PBS with 50mM/L Tris-HCl pH 7.4. 五、 植物材料:水稻苗，叶鞘，根(ynibcas) 1、200 毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min 取上清 3、重复离心5min lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 六、 蛋白质样品制备(sigma) 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三 氯乙酸(丙酮配制，含10mM 即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20?沉淀1 小时，4?，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20?沉淀1 小时，同上离心弃上清， (有必要再用80,丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)， 2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37?温育30min，期间搅 动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点 越好～上清即可上样电泳。或者-70 度保存 七、 植物根中蛋白质的抽取(phenol) (1) sample, 液氮研磨 (2) 装1.5 ml centrifuge 用tube (3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite (5) 取上层液，蛋白质就在里面 八、 SDS extraction followed by acetone precipitation – simple extraction protocol that does not require phenol. Recommended start protocol for whole tissue extractions.(hgp) 1. Grind 1 g of fresh tissue to a powder with liquid nitrogen in a mortar ,nd pestle. 2. Add 5 mL of extraction media (0.175 M Tris-HCl, pH 8.8, 5% SDS, 15% glycerol, 0.3 M DTT) directly to mortar ,nd continue grinding for an additional 30 sec. 3. Filter homogenate through two layers of miracloth into a 50 mL Falcon tube at room temperature. 4. Immediately add 4 volumes of ice cold 100% acetone to filtered homogenate, mix by vortexing ,nd place at -20 C for at least one hour to precipitate proteins. 5. Centrifuge at 5000 g for 15 min to collect precipitated protein, decant supernatant. 6. Gently blot residual acetone from container with Kimwipe ,nd then wash pellet in 15-20 mL of cold 80% acetone. Be sure to thoroughly break-up pellet by pipetting, vortexing or sonication. 7. Repeat steps 5 ,nd 6. 8. Collect final protein precipitate by centrifugation at 5000 g for 15 min ,nd dry pellet by inverting on Kimwipe for 15 min at 37 C. 9. Resuspend final pellet in 0.5-1 mL of IEF extraction solution (8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% Triton X-100, 50 mM DTT, 0.2% pH 3-10 ampholytes) by pipetting ,nd vortexing at 25-30 C. Incubate sample for 1 h at room temperature with agitation. Do not heat sample under any circumstances as this will lead to carbamylation of proteins. 10. Centrifuge for 10 min at 12000 g ,nd use supernatant to rehydrate IPG strips. 11. If protein quantitation is necessary, precipitate protein sample with TCA or acetone prior to performing Bradford or Lowry assay as detergents ,nd reducing agents interfere with these assays. Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants (see Hurkman ,nd Tanaka, 1986, Plant Physiology 81:802-80 九、 材料:细菌蛋白(puc18) 用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS， 20mmol 的2-巯基乙 醇。 十、 线粒体蛋白的提取 (bioon) Isolation for Mitochondria Modification by Bioon Materials ,nd reagents: homogenizing buffer: 100 mM mannitol 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 5 mM MgCl2 关 于 蛋 白 质 1 mM EGTA 1 mM DTT leupeptin (0.1 ug/ml) 0.1M Na2CO3 Methods: - 10*6 Cells were washed with ice-cold PBS ,nd lysed by homogenizing in 1 ml buffer (ice-cold) containing 100 mM mannitol, 10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, leupeptin (0.1 ug/ml) - Subjected to Polytron homogenization for three-four bursts of 3-10 s each at a setting of 6.5. - Intact cells ,nd nuclei were separated by centrifugation at 120 g for 5 min at 4? - Supernatants were centrifuged at 10,000 g for 10 min to collect the heavy (mitochondrial) membrane pellet. - Cytoplasmic fractions were obtained by centrifuging supernatants at 100,000 g for 30 min. - Resuspended pellet to 0.25mg/ml in fresh preparation of 0.1M Na2CO3 (pH 11.5) - Incubated on ice for 30 min. - Ultracentrifugation at 100000g for 1h at 4? to precipitate the mitochondria membrane protein. And the supernatants are mitochondrial matrix. 0.5mg of proteins in mitochondria can get 100ug of proteins (the alkali-resistant fractions) Ref.: PNAS, 2002，99:12825–12830 本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测 竹节人参中蛋白质提取工艺研究 【摘要】 目的研究竹节人参蛋白质提取最佳生产工艺。方法采用单因素和L9 (34)正交实验，以竹节人参蛋白质得率为指标，考察了氢氧化钠溶液的浓度、用 量、提取时间和提取次数对提取效果的影响。结果氢氧化钠浓度为0.15 mol/L，用 量为样品体积的20倍，提取时间1.5 h，提取 3 次为最佳工艺。结论 该工艺合理， 重复性好，可为竹节蛋白质提取工艺的确定提供实验依据。 【关键词】 竹节人参 蛋白质 单因素递变 正交实验 工艺条件 Abstract:ObjectiveTo study the extraction process of protein from panax japonicus.MethodsUse orthogonal design L9(34),and take the protein rate as the index，definite the best condition of protein process.ResultsThe best process condition was 0.15 mol/L Sodium hydroxide, 20 times amount of samples, the extraction time was 1.5 hours, had extracted 3 times.ConclusionThis process is the best and it can be used for extraction of Panax japonicus protein. Key words:Panax japonicus; Protein; Single factor change; Orthogonal experiment; Craft conditions 竹节人参属五加科植物，别名竹节三七、竹节参、白三七、北三七、大叶三七 ,1,3,。具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功能，兼具我国北药人参和南药 三七之功效，在民间有“草药之王”的美誉，属我国特有珍贵中药材资源。 湖北恩施是世界第一高硒地区,4,，生长于这一地区的竹节人参由于其富含硒 而药效独特，疗效显著,5,，现已进行大规模的种植，资源十分丰富。现代药理学 研究表明，竹节人参主要活性物质为皂苷类、多糖、氨基酸及少量的挥发性油等,6,。 目前，在对竹节人参活性成分进行提取的同时，浪费了大量竹节人参的含硒有效成 分。为了充分利用宝贵的富硒竹节人参资源，笔者选择了生长在高硒地区的竹节人 参为研究对象，系统研究了竹节人参中各活性成分及有效成分的提取工艺，为综合 利用竹节人参提供理论依据。本文旨在以超声提取皂苷后的残渣为原料，通过单因 素和正交实验，探讨残渣中蛋白质最佳提取工艺。 1 器材与方法 1.1 材料 竹节人参由湖北省中药材研究所提供，为家种4年生的竹节人参根。在以甲醇为 溶剂，超声提取竹节人参皂苷后的残渣为本实验的原料。 1.2 仪器 AVANTI30高速冷冻离心机(美国贝克曼公司); S53/54全波长分光光度计。 1.3 实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 设计 1.3.1 溶剂的选择控制样品与提取溶剂的体积约比为1?20，分别用水，0.1 mol/L氯化钠溶液，0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂于常温下进行提取，以蛋白质的得率为指标，选择最佳溶剂。 1.3.2 单因素实验本实验以溶剂的浓度、溶剂用量、提取时间及提取次数作为影响竹节人参蛋白质得率的单因素，设置各因素不同的水平，找出不同因素对蛋白质得率的影响规律。 1.3.3 正交实验以单因素实验的结果为参考，进行溶剂的浓度、溶剂用量、提取时间及提取次数4因素3水平正交实验设计方案，因素水平表(见表1)。以蛋白质的得率为指标，通过L9(34)正交实验确定最佳的提取条件。表1 正交设计因素水平(略) 1.4 样品处理提取竹节人参皂苷的残渣置鼓风干燥箱中60?下烘干，密封置于干燥器中备用。 1.5 蛋白质的提取与分离分别用水、0.1 mol/L氯化钠溶液、0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂，对样品中的蛋白质进行提取，得到相应的溶液即为水溶蛋白质、盐溶蛋白质、酸溶蛋白质及碱溶蛋白质。然后在水溶蛋白、盐溶蛋白、酸溶蛋白及碱溶蛋白的提取液中加入硫酸铵至饱和，4?静置过夜，离心，取沉淀透析至透析液中加饱和氯化钡无沉淀生成时，再分别用蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠、0.1 mol/L盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液充分溶解后定容，备用。 1.6 蛋白质得率的计算蛋白质得率η=100×(m1 /m2)，其中m1为从样品中所提取出的蛋白质的质量，m2为样品的质量。 1.7 测定方法蛋白质含量测定用考马斯亮蓝G-250显色，595 nm测吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，曲线回归方程Y=507.13X -0.076 4，相关性系数r=0.998 6。 2 结果 2.1 溶剂的选择在选定的条件下，用水、0.1 mol/L氯化钠溶液、0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为提取溶剂，分别从样品中提取蛋白质，然后测定并计算出蛋白质的得率，其结果如表2所示。由表2可知，用氢氧化钠作提取溶剂，蛋白质的得率都明显地高于其它提取溶剂，因此本实验选择氢氧化钠作为提取溶剂。 表2 不同溶剂对竹节人参蛋白质得率的影响(略) 2.2 单因素实验 2.2.1 氢氧化钠溶液浓度对样品中蛋白质提取效果的影响为了研究氢氧化钠溶液的浓度对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个浓度梯度，其浓度分别为0.05，0.1，0.15，0.2 mol/L。用不同浓度的氢氧化钠溶液提取样品中的蛋白质，用上述方法计算蛋白质的得率。提取条件为20倍体积的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次，2 h/次，其结果见图1。由图1可知，随着氢氧化钠浓度的升高，蛋白质的得率增加，但浓度升高到一定程度时，蛋白质的得率反而有所下降，这可能是由于氧氧化钠溶液的浓度过高使部分蛋白质发生了变性。本实验结果以0.15 mol/L的氢氧化钠溶液为最佳。 2.2.2 氢氧化钠溶液用量对样品蛋白质提取效果的影响为了研究氢氧化钠溶液的用量对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个不同的氢氧化钠的用量，分别为样品体积的10，15，20，25倍。提取条件为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次，2 h/次。按上述方法计算蛋白质的得率，其结果见图2。由图2可知，随着氢氧化钠体积的增加，蛋白质的得率也增加，当体积增大到20倍后，再增加溶液的体积时，蛋白质的得率变化很小，结合成本考虑，20倍体积的氢氧化钠溶液为最佳。 2.2.3 提取时间对样品蛋白质提取效果的影响为了研究提取时间对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个不同的提取时间，分别为提取0.5，1，2 ，3 h/次。提取条件为20倍体积0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次。然后用同样的方法计算蛋白质的得率，其结果见图3。由图3可知，随着提取时间的增加，蛋白质的得率增加，当提取时间增加到2 h后，蛋白质得率增加的弧度很小，从时间和能耗方面考虑，以提取2 h/次为宜。 2.2.4 提取次数对样品蛋白质提取效果的影响为了研究提取次数对样品蛋白质提取效果的影响，本实验在提取次数上设置了4个不同处理，分别为1，2，3，4次。提取条件为20倍体积0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，提取2 h/次。然后用同样的方法计算蛋白质的得率，其结果见图4。由图4可知，随着提取次数的增加，蛋白质的得率增大，但提取次数达到2次后，再增加提取次数，蛋白质的得率增加很小，从成本方面考虑，以提取2次为宜。 2.3 正交实验为了研究不同因素共同作用对竹节人参蛋白质提取效果的影响，采用L9(34)正交表对样品中蛋白质进行提取，以蛋白质的得率为指标，进行实验优化，确定最佳的提取条件。结果及方差分析见表3及表4。表3 样品中蛋白质提取正交实验表及结果(略)表4 样品中蛋白质提取正交实验的方差分析(略) 由表3中的极差可知，影响样品中蛋白质得率的各因素中，其主次顺序依次为D > A > B > C，即提取次数>氢氧化钠的浓度> 氢氧化钠的用量>提取时间。表4的方差分析表明，提取次数对蛋白质的得率具有显著的影响，其它各因素对蛋白质得率的影响未达到显著水平。 本实验结果表明，A3B2C1D3组合提取蛋白质的效果最好。即对样品中蛋白质的最佳提取条件为:氢氧化钠的浓度为0.15 mol/L，用量为样品体积的20倍，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。 3 讨论 通过提取溶剂的选择，确定了用氢氧化钠溶液进行提取。 通过单因素实验，得到了各因素在不同水平下的较佳数值，其中提取次数对蛋白质得率影响较大。 通过正交实验及方差分析，确定了样品中蛋白质提取的最佳工艺条件为:氢氧化钠的浓度为0.15 mol/L，用量为样品体积的20倍，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。 本文旨在以超声提取皂苷后的残渣为原料，通过单因素和正交实验探讨残渣中蛋白质的最佳提取工艺。对于竹节人参主要活性物质皂苷及多糖的提取工艺已另文发表。 蛋白质提取与制备 1蛋白质提取与制备 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化硫等)中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH 用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷(Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 1.1蛋白质提取与制备概述 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽有了不少改进，但其主要原理仍不外乎两个方面:一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法;按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法;按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等;按生物功能专一性有亲合层析法等。 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某 一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴定来判明。 另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰岛素Zn2+等。此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过20?时，几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA 完全抑制，因此在进行柱层析前先将粗毒素0.1mol/LEDTA 溶液处理，即使在室温高于20?，仍能很好的得到神经毒素。整个制备过程一般可分为5 个阶段:?材料的选择和预处理，?细胞的破碎(有时需进行细胞器的分离)，?提取，?纯化(包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等)，?浓缩、干燥及保存。以上5 个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。保存活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。因此选择的条件应为十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。 1.2蛋白质提取与制备具体操作方法 1.2.1原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质(本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白)时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异(如饥饿时脂肪和糖类相对减少)，采收期及产地等因素也要注意。 1.2.2前处理 1.2.2.1细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一 般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ?机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:?高速组织捣碎机(转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片)，宜用于动物内脏组织的破碎;?玻璃匀浆器(用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎)，适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ?物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 a 反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15,20?使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 b 冷热变替法 将材料投入沸水中，于90?左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 c 超声波法 暴露于9,10 千周声波或10,500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。 d 加压破碎法 加一定气压或水压也可使细胞破碎。 ?化学及生物化学方法 a 有机溶媒法 粉碎后的新鲜材料在0?以下加入5,10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 b 自溶法 将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30?左右较早溶化。自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0,4?，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。 c 酶法 与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g 菌体加1,10mg 溶菌酶， pH6.2,7.01h 内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。表面活性 剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。 1.2.2.2细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA 几乎全部集中在细胞核内。RNA 则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。 细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll(一种蔗糖多聚物)或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提取:大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。盐溶液提取:以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素。 a 盐浓度 等渗盐溶液尤以0.02,0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。 b PH 值: 蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择PH3,6 范围对于分离提取是有利的。 c 温度: 多数酶的提取温度在5?以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37,50?条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。 d 有机溶剂提取: 有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体(Mitochondria)及微粒体(Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广(pH3,10，温度-2?至40?)。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。 e 表面活性剂的利用: 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基硫酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型(如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等)，阳离子型(如氧化苄烷基二甲基铵等)及非离子型(Triton X-100 、TirtonX-114、吐温60 及吐温80)等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。 f 对提取物的保护: 在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH 在3,5 或更高些，因在较低PH 条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大，上述条件均视具体对象而变化。有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使酸基丢失。 黄粉虫蛋白资源的利用 一、黄粉虫蛋白质提取的方法有几种, 黄粉虫蛋白质的提取方法一般可分为碱法、盐法和酶法等3种。 二、怎样用碱法提取黄粉虫蛋白质, 将黄粉虫虫浆或干粉，按一定比例加入氢氧化钠溶液，在一定温度条件下，处理一定时间后，离心去除虫渣。用10%盐酸调节PH到4.5左右，可见明显的沉淀析出。再经高速离心机离心4分钟后得到粗的含盐蛋白质。最后将盐蛋白经透析得到去盐蛋白。 三、怎样用盐法提取黄粉虫蛋白质, 将黄粉虫虫浆或干粉，按一定比例加入氯化钠溶液，在一定温度条件下，处理一定时间后，离心去除虫渣。用10%盐酸调节PH到4.5左右，可见明显的沉淀析出。再过高速离心机离心4分钟后得到粗的含盐蛋白质。最后将盐蛋白经透析得到去盐蛋白。 四、怎样用酶法提取黄粉虫蛋白质, 将黄粉虫虫浆或干粉，按一定比例加入胰蛋白酶和蒸馏水，在高速离心机下匀浆3分钟。用1%的氢氧化钠溶液调节PH至7，经过一定的酶解时间，一定的酶解温度。然后升温至70?杀酶30分钟，置冰箱中冷藏过夜。最后将虫渣过滤，在80?下烘干，得到粗蛋白。 五、为什么说黄粉虫蛋白是优质蛋白, 黄粉虫蛋白质中所含必需氨基酸的种类多，含量高，蛋白质营养价值高;另一方面黄粉虫蛋白质中必需氨基酸数量相互之间的比例适宜，于人体的需要相符合，所以说黄粉虫蛋白是优质蛋白。 六、如何制作黄粉虫蛋白粉, 制作黄粉虫蛋白粉的工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 如下: (1) 选料 将黄粉虫幼虫或蛹，经清理去杂、灭菌、烘干、粉碎，采用加盐或加碱法使虫体蛋白质充分溶解，然后可用等电点法或盐析法、透析法等方法，使蛋白质凝聚沉淀，再把沉淀物烘干，即得黄粉虫蛋白质。 (2) 工艺流程 虫体清洗去杂 — 软化 — 杀菌 — 烘干 — 脱色 — 脱臭呻洗涤 — 破碎 — 提取分离 — 洗涤 — 烘干 — 粉碎 — 筛分 — 成品。 七、怎样用黄粉虫生产酱油, 用黄粉虫生产酱油的工艺流程如下: (1) 选料 选用新鲜黄粉虫幼虫或蛹，经过严格清理去杂，加水磨浆，然后加酶使蛋白质酶解成氨基酸，再经灭菌、过滤、调味调色等工序制成。黄粉虫酱油营养丰富，味道鲜美，富含氨基酸及钙、磷、铁、镁、锌等多种微量元素和维生素。此酱油既是优良的调味品，又具有营养保健功能。 (2) 工艺流程 黄粉虫清理去杂 — 清洗 — 加水磨浆 — 调pH至7.0 — 酶解(加人士,胰酶45~C经5,8小时) — 灭酶(90~C) — 粗滤，调pH至4.5,5.0 — 灭菌(100~C，30分钟) — 调味调色 — 搅拌 — 过滤 — 分装成品。 八、怎样用黄粉虫加工虫酱, 用黄粉虫加工虫酱的工艺流程如下: (1) 选料 选用鲜黄粉虫幼虫或蛹，经去杂处理，清除消化道及分泌物，然后清洗干净，在75~80?的温度下烘干，再加水研磨成酱状，同时可调配食用油、豆粉、芝麻、辣椒等辅料，配制成各种风味酱。也可将磨成的酱状料加入白砂糖等制成酥糖馅、月饼馅等各种点心馅来制作点心。 (2) 工艺流程 虫体清理去杂 — 清洗 — 沥水 — 烘干 — 灭菌 — 加水磨浆 — 调配 — 成品。 九、怎样用黄粉虫生产罐头, 用黄粉虫生产罐头的工艺流程如下: (1) 选料 选择体态完整的黄粉虫幼虫或蛹，经过清蒸、红烧、油炸、五香腌制等不同的调味加工，制成各种风味罐头。使其具有经久耐藏、营养丰富、口味独特、食用方便的特点。 (2) 工艺流程 虫体清理去杂 — 清洗 — 固化 — 灭菌 — 调味 — 装罐 — 排气 — 密封 — 杀菌 — 冷却 — 成品。 十、怎样用黄粉虫生产滋补酒, 用黄粉虫生产滋补酒的步骤如下:选用老熟的黄粉虫幼虫或蛹，经清理去杂后，固化、烘干脱水，配以枸杞、红枣放人白酒中，浸泡1—2月即成。这种补酒颜色纯红，口味甘醇，具有安神、养心、健脾、通络活血等功效。 十一、怎样用黄粉虫加工调味粉, 用黄粉虫加工调味粉需要以下几步: (1) 选料 将黄粉虫幼虫或蛹，经去杂脱水后进行灭菌干燥，再研磨成千粉。此粉营养全面，可添加到面包、糕点、饼干、糖果等各类食品中，增加蛋白质含量，提高其营养价值 (2) 虫体经清理去杂 — 清洗 — 固化 — 脱色 —烘烤 — 研磨 — 工艺流程 筛分 — 成品。 十二、怎样用黄粉虫生产口服冲剂, 用黄粉虫生产口服冲剂需要以下几步: (1)选料 将老熟的黄粉虫幼虫或蛹，经清理去杂、脱脂、脱色等处理，采用喷雾干燥等工艺制成乳白色粉状冲剂。其蛋白质、微量元素、维生素含量丰富，适合配制滋补强身饮料及各种冷饮食品。 (2)工艺流程 虫体清理去杂—清洗—固化—脱脂—脱色—研磨—过滤—均质—喷雾干燥—成品。 十三、怎样提取黄粉虫水解蛋白质和氨基酸, 用黄粉虫提取黄粉虫水解蛋白质和氨基酸需要以下几步: (1) 选料 将老熟的黄粉虫幼虫或蛹，经清理去杂、脱脂、脱色等处理。黄粉虫蛋白质中氨基酸组成合理，可制取水解蛋白和氨基酸，两者虽然水解度不同，但都具有良好的水溶性。可用于加工保健食品、食品强化剂，也可用于治疗氨基酸缺乏症的药品。一般可再提取蛋白后进行水解，水解的方法可采用酸法、碱法或酶法。一般采用酶解法制取复合氨基酸粉的含量最高。水解得到的复合氨基酸产品，经烘干制成粉状成品。如要制成单一品种的氨基酸，可将复合氨基酸液进一步纯化分离，制成某种氨基酸口服液或胶囊。 (2) 工艺流程 鲜虫 — 水洗 — 干燥 — 粉碎 — 脱脂 — 酶解 — 灭酶 — 离心 — 过滤 — 杀菌 — 冷却 — 接种 — 发酵 — 搅拌 — 加热 — 均质调配 — 装瓶 — 杀菌 —冷藏。 十四、用黄粉虫生产的蛋白饮料有什么特点, 用黄粉虫生产的蛋白饮料有如下的特点:大多数饮料虽然含糖较高，但是蛋白质缺乏，营养不平衡。为使饮料能够提供人体所需的蛋白质;可利用黄粉虫蛋白对饮料进行强化。对于不含酸的清凉饮料，可将黄粉虫蛋白用酸化或酶催化法转化成可溶性蛋白质，然后按一定的比例添加到清凉饮料或含有碳酸气的饮料中进行强化。对于果汁饮料可采用双酶解法制取等电点溶解蛋白，作为果汁等软饮料的强化剂，再配以蜂蜜、果汁，其饮料中含有大量易被人体吸收的游离氨基酸，维生素和微量元素的含量也较高，是一种新型营养保健饮料，具有很高的营养价值，适合于运动员、婴幼儿、青少年及重体力劳动者饮用。另外，还可将黄粉虫蛋白与其他各种乳酸饮料中所含蛋白，按一定比例科学搭配，使动、植物蛋白得以互补，各种氨基酸构成比较平衡，从而提高饮料中的生物价值。 十五、什么是抗菌肽, 昆虫体内由于外界刺激(包括物理、化学、病原微生物等)产生的具有抗菌、抗病毒等活性的小分子多肽。 十六、黄粉虫体内有抗菌肽存在吗, 正常情况下，黄粉虫体内没有抗菌太存在，但在其虫体受到物理、化学刺激或病原微生物侵害时则可产生抗菌太。 十七、怎样诱导与利用黄粉虫抗菌肽, 诱导黄粉虫体内产生抗菌太的方法很多，一般以幼虫阶段诱导更为方便进行。可采用紫外光照射法，体内注射菌源法等。通过诱导黄粉虫产生抗菌太，可进一步分析确定其结构，通过分子生物学手段，开发医用或农用新药物。 十八、黄粉虫脂肪资源的利用 十九、怎样提取黄粉虫体内的脂肪, 一般采用有机溶剂萃取法，即将黄粉虫干虫或干粉，按一定比例加入石油醚，在一定温度条件下，反复浸提处理，再将浸提液进行蒸馏分离，回收石油醚并获得黄粉虫粗虫油，进一步纯化得到精致虫油。 二十、黄粉虫那个虫态的脂肪含量最高, 黄粉虫的初龄幼虫和中龄幼虫生长较快，新陈代谢旺盛，体内脂肪含量低，蛋白质含量较高。老熟幼虫和蛹体内脂肪含量较高，蛋白质含量相应较低。 二十一、黄粉虫脂肪有什么用途, 黄粉虫脂肪是优质的油脂资源，富含不饱和脂肪酸，并且胆固醇含量低。另外，黄粉虫脂肪还具有药理活性，可用于医药开发领域。 二十二、黄粉虫脂肪可以食用吗, 黄粉虫脂肪经加工纯化后可以直接食用，是具有特殊开发价值的较理想的食用脂肪。 二十三、为什么说黄粉虫脂肪是较理想的食用脂肪, 黄粉虫脂肪中不饱和脂肪酸含量较高，主要是人体必需脂肪酸(亚油酸)和软脂酸，而增高血胆固醇作用的肉豆蔻酸含量较低，脂溶性维生素含量高。这都说明它是一种对动物，特别是对人类有益的脂肪。由此可见，黄粉虫脂肪是较理想的食用脂肪。