【doc】大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP、RBP和TTR表达降低

【doc】大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP、RBP和TTR表达降低 大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP、RBP和 TTR表达降低 2007年1月 第27卷第1期 基础医学与临床 Basic&ClinicalMedicine January2007 Vo1.27No.1 文章编号:1001—6325(2007)010072—04研究论文 大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP,RBP和TTR表达降低 李圣青,遭新宇,刘阿茹,简文.,阙海萍,杨树广,刘少君 (1.第四军医大学西京医院呼吸科,陕西西安710033;2.解放军军事医学科学院三所一室,北京100850) 摘要:目的探讨急性肺血栓栓塞时维生素D结合蛋白(DBP),维生素A结合蛋白(RBP)和甲状腺素转运蛋白 (‘不R)的表达变化及对代谢的影响.方法用颈静脉插管注入血栓的方法制备大鼠急性肺栓塞模型.用Western blot检测DBP,RBP和’不R蛋白水平,RT?PCR法检测肝组织中DBP,RBP和’l1’R的mRNA水平,放射免疫法测定 兀’.和25(OH)D,的血清浓度,微量荧光法测定维生素A的血清浓度. 结果急性肺栓塞后血清中DBP,RBP和 ‘不R的蛋白水平,肝组织中DBP,RBP和’不R的mRNA水平均逐渐 降低;而血清中这3个结合蛋白的配体兀’.,25 (OH)D,和维生素A的水平明显升高.结论急性肺栓塞后血清中 DBP,RBP和’不R的蛋白水平降低是由于肝细 胞合成减少所致,从而释放出更多的配体.升高的25(OH)D维生素A 和分子在急性肺栓塞后的一系列病 理生理变化中将发挥重要作用. 关键词:急性肺栓塞;蛋白印迹;DBP;RBP;11’R 中圈分类号:R563.5文献标识码:A ExpressiondecreaseofDBP.RBPandTrRintheacutepulmonaryembolismrats LISheng-qing,TIXin-yu,LIUA-ru,JIANWen,QUEHai.ping,YANGShu.guang,LIUShao-jun (1.DepartmentofRespiratoryMedicine,xomgHospital,FourthMilitarymedicalUniversity.Xi’an710032; 2.InstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China) Abstract:ObjectiveTostudytheexpressionchangesandmetaboliceffectsofDBP.RBPandTTRafteracute pulmonaryembolism(PE)througharatmode1.MethodsWeconstructedaratacutePEmodelbyinjectingembo. 1iintothejugularvein.TheserumproteinlevelsofDBP.RBPandTTRwerevalidatedbywesternblotmethods. ThemRNAlevelsofDBP,RBPandTTRwasidentifiedbysemi.quantitativeRT.PCR.Theserumconcentrationsof 25(OH)D3andFT4weredeterminedbymeansofRIA,andthatofVitaminAwerecheckedbymicrofluorescence. ResultsTheserumproteinlevelofDBP,RBPandTTRandtheirmRNAlevelsinratliveralldecreasedgradually afteracutePE.Onthecontrary,theserumconcentrationsof25(OH)D3,VitaminAandFT4increasedsharplyaf- teracutePE.ConclusionThesynthesisofDBP,RBPandTTRinratliverwasdepressedobviouslyafteracute PE,whichresultedinthedown.regulationoftheserumproteinlevelsofthem.Thelowserumconcentrationsof DBP,RBPandTTRwouldleadtothereleaseoftheirlig肌 ds——25(OH)D3,VitaminAandFT4,whichwould playimportantrolesinthepathophysiologicchangesafteracutePE. Keywords:acutepulmonaryembolism;westernblot;DBP;RBP;TTR 收稿日期**2006—01—24修回日期:2006—07—20 2007.27(1)基础医学与I临床BaMc&ClinicalMedicine73 肺栓塞是血栓或其他性质的栓子(如气体,羊 水,脂肪),顺着血流方向堵塞肺动脉的结果.绝大 多数肺栓塞的栓子来源于下肢深静脉血栓(DVT). 栓子直接阻塞肺动脉和由栓子诱发的神经体液因素 导致的血管痉挛,可使肺血管床面积减小,引起肺血 管阻力增加和肺动脉高压,严重者导致右心功能不 全,甚至休克,死亡.急性肺栓塞是临床常见的 一 种急性肺损害,研究急性肺栓塞后肺部和全身的 病理生理变化及代谢性改变,对于肺栓塞的临床诊 断和治疗都具有重要的指导意义.我们曾发现急性 肺栓塞大鼠血清中出现一系列表达差异变化的血清 蛋白,这些蛋白包括:维生素D结合蛋白(vitaminD bindingprotein,DBP),维生素A结合蛋白(Retinal bindingprotein4,RBP),甲状腺素转运蛋白(Transt— hyretin,,I-】[.R),铁蛋白(Ferritin,Fn),结合珠蛋白 (Haptoglobin,Hp),补体C4A(complement4A,C4A), 补体C4B(complement4B,C4B),载脂蛋白A—I(Apoli— poproteinA—I,ApoA—I)等.本研究重点讨论DBP, RBP和rI-I.R在急性肺栓塞中所发挥的作用. 1材料与方法 1.1材料 TrizolReagent和SuperScriptnl(Invitrogen公 司).rTaq酶(Takara公司).羊抗DBP抗体和兔 抗rI-I.R抗体(SantaCruz公司).RBP单抗(Novus Biologicals公司).FT.和25(OH)D,放射免疫试剂 盒(美国Diasorin公司),维生素A 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品(美国Sig— ms公司).雄性Wistar大鼠(解放军军事医学科学 院实验动物中心). 1.2方法 1.2.1大鼠急性肺栓塞模型的建立:采用改进的 Clozel大鼠急性肺栓塞模型].取40只大鼠,随机 分为5组,每组8只.取大鼠自体血,每mL全血中 加入2U凝血酶,室温下静置过夜,制备直径2mm, 长10mm的血栓栓子.将大鼠用I%戊巴比妥 I.2mL麻醉,经大鼠颈总静脉插管注入栓子,每只3 个栓子.以正常组为对照.分别在I,8,24和48h 开胸,心脏穿刺取血,分离血清,同时立即取肝组织. 1.2.2Westernblot:采用1×PBS将血清蛋白稀释10 倍,上样量为60g,经过SDS—PAGE电泳后转膜并封闭 过夜,按顺序加一抗和二抗,最后用A,B液显色. I.2.3mRNA检测:采用Trizol试剂提取大鼠肝组 织总RNA,琼脂糖凝胶电泳验证总RNA的质量,紫 外分光光度计进行RNA定量.采用SuperScriptIII 合成cDNA第一链,反应物一20?保存或直接用于 RCR.采用PrimerPremier5.0PCR引物设计软件 分别设计DBP,RBP和rI-I.R的引物.同时用Se— quencher序列比对软件对包括内参B—actin在内的4 对引物做特异性验证.DBP引物序列:上游5一CCC AGGITCCAGAAGTGT.3,下游5一CTCAGTCGT TCCGCCAAT一3,扩增长度220bp;RBP引物序列: 上游5一GGGTGTAGCCTCcTrTCT一3,下游5一 TGTArI-I.TGGACGATGGTrT一3,扩增长度 417bp;rI-I.R引物序列:上游5一cTrCCCTrcGCC TGTTCC一3,下游5一GAGCCTTCCAGTACGATr TG一3,扩增长度300bp;内参B—actin引物序列:上 游5一GATGACCCAGATCATGTrTG一3,下游5一 TAGGAGCCAGGGCAGTAA一3,扩增长度614bp. 采用PE9700PCR仪,反应条件:94?2rain,94? 10S,55?15S,72?1rain,72?7rain,4?保 存.用1.2%Agorase进行琼脂糖电泳,ImageMas— terTotalLabv1.II软件作图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 .首先确定条 带,消除背景,然后以Marker条带为标准计算待测 条带的灰度值,最后计算目的条带与对应内参条带 的比值. I.2.425(OH)D,,维生素A和FT.血清浓度检 测:采用免疫法和SN-695智能型放免测定仪,测 定25(OH)D,和FT.的血清浓度.采用微量免疫荧 光法和RF-540荧光分光光度计检测维生素A的血 清浓度.激发光波长330nm,发射光波长480nm, 按试剂盒 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 和仪器的 操作规程 操作规程下载怎么下载操作规程眼科护理技术滚筒筛操作规程中医护理技术操作规程 检测. 1.3统计学分析 采用SPSSIO.0统计软件分析,测量值以士s 表示,两组间比较采用t检验. 2结果 2.1Westernblot 大鼠急性肺栓塞后,血清中DBP,RBP和rI-I.R 的蛋白水平逐渐降低,在急性肺栓塞后48h尤为明 显(图1,表1). 2.2半定量RT?PCR 大鼠急性肺栓塞后,肝组织中DBP,RBP和 74基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine DBP RBP 图1Westernblnt结果 Fig1ResultsofwesternblotofDBP.RBP andTTRatdifferenttimepoints TTR的mRNA水平逐渐下降(图2,表I) 2.325(OH)D,维生素A和FT的血清浓度 大鼠急性肺栓塞后,25(OH)D,维生素A和 订.的血清浓度出现逐渐升商现象(表2). 3讨论 急性肺栓塞后肺组织和肺泡灌洗液中CXC, C—C和巨噬细胞炎症蛋白一2等炎症细胞趋化因子的 表达日月显升高,导致中性粒细胞,淋巴细胞,巨噬 细胞和嗜酸性粒细胞在炎症部位的聚集,这炎症 细胞能够分泌和释放大量的前炎症细胞心子:II.一1, II+.6,IL一10和TNF—d等.:这些细胞因子进入血 循环作用于肝细胞,导致DBP,RBP和TTR的表达 F降,从而释放出大量的活性配体 DBP,RBP和m是血清中非常重要的结合蛋 白,主要由肝脏合成l奉研究发现,急性肺栓塞后大 鼠血【清中结合蛋白DBP,RBP和R的浓度明显减 低.同时肝细胞合成这3种蛋白的能力显着下降. 伴随着DBP,RBP和rrR的表达减低,这3种蛋白 的相应配体25(OH)D,维生素A和FT被以活性 形式释放人血,它们的血清浓度出现逐渐升离现象. DBP除r可25(OH)D结台以外.还可与 C5a作为中性粒纲胞的魑化子一起作用另外, DBP还可与血液中的actin结合,清除坏死细胞释放 袭1急性肺栓塞后DBP,RBP和TTR的血清浓度变化殛肝组织中的mRNA表达变化 TablelChangesofserlllnconcentrationsandmRNAexpressioninratliverof DBP,RBPandI”TRafteracutePE (n=8,?5} 尸(0135’.P<O01comparedwithcontrolgmup f0c.啮dl】,8h2/l1.{BhMDLar-20.0…】Jh8}L24h4;n几._】181.4h掉l’ ABC 口n 图2半定量RT-PCR结果 Fig2Resultsofsemi—quantttativeRT?PCRofDBPIA).RHP(B)andTTR 【CJa1differenttimepoints 基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine75 表2急性肺栓塞后25(OH)D,,vitaminA和FT.的血清浓度变化 Table2ChangesofsePumconcentrationsof25(OH)D3(A).vitaminA(B)and FT.(C)afteracutePE(n=8-4-s) P<0.05.’’P<0.0lcomparedwithcontrolgroup 的actin蛋白.25(OH)D,能够促进肺泡?型上皮 细胞的分化,促进肺泡表面活性物质的合成;同 时25(OH)D,通过调节细胞因子的合成,抑制淋巴 细胞的归巢而具有抗炎作用.DBP的表达下降 和25(OH)D,的升高对急性肺栓塞所造成的肺损 伤具有保护作用. RBP是维生素A的特异性结合蛋白,主要在肝 脏合成.它将由小肠吸收入血的维生素A转运至 其他靶细胞.维生素A参与上皮细胞中糖蛋白的 生物合成,维持上皮细胞的正常结构和功能并可促 进上皮细胞的正常分化并控制其恶性变,从而有防 癌作用.另有研究发现,在急性肺损伤时,肺泡灌洗 参考文献: [1]GirardP,SanchezO,LeroyerC,etat.Deepvenous thrombosisinpatientswithacutepulmonaryembolism: prevalence,riskfactors,andclinicalsignificance[J]. Chest,2005,128(3):1593—16OO. [2]ClozelJP,HolvoetP,TschoppT.Experimentalpulmonary embolusintherat:anewinvivomodeltotestthrombolyti drugs[J].JCardiovascPharmacol,1988,12:520—525. [3]ZagorskiJ,DebelakJ,GellarM,eta1.Chemokinesaccu. mulateinthelungsofratswithseverepulmonaryembolism inducedbypolystyrenemicrospheres[J].JImmunol, 2003,171(10):5529—5536. [4]CollenD,HoylaertsMF.Relationshipbetweeninflamma. tionandvenousthromboembolisma8studiedbymicroparti- cleassessmentinplasma[J].JAmCoilCardiol,2005. 45(9):1472—1473. 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