肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制（医学论文）

肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及其机制（医学论文） 肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制 作者:付勇，张伟，刘彦仿，王春梅，陈丹，刘节，苏勤 【关键词】 肝肿瘤 关键词: 肝肿瘤;细胞角蛋白;层粘连蛋白;激光共聚焦显微镜;免疫印迹法 要:目的 利用体外培养的6株肝细胞癌细胞系研究肝细胞的 摘 细胞角蛋白,cytokeratin，CK,的异常表达及其与层粘连蛋白,laminin，LN,的关系. 方法 应用能特异识别CK8，18，7，19，LN，及LN受体的抗体对肝细胞癌细胞系进行免疫酶组织化学染色;应用激光共聚焦显微镜技术对肝细胞癌细胞系的CK19和LN表达情况进行观察;应用Western blot技术对肝细胞癌细胞系的CK18，7和19的表达进行检测. 结果 6株细胞系CK8和CK18全为阳性;CK7也全部阳性，但各株细胞反应强度不同;其中4株细胞CK19为阳性，其余两株为阴性;LN免疫组化结果与CK19的结果一致;CK19和LN阳性物质共定位于同一癌细胞的细胞质中，所有LN明确阳性的细胞都为CK19免疫反应阳性.所有6株细胞系都表达LN受体. 结论 肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白表达不同于正常肝细胞，常出现CK7和CK19的异常表达，且CK19和LN的共定位，提示更多精品文档,欢迎来我主页查询 LN可能对CK19的表达起诱导作用. Abstract:AIM To study the abnormal expression of CKs,，as well as its association with laminincyto-keratins, ,LN,，in hepatocellular cell lines growing in vitro.METHODS Ex-pression of CK8，CK18，CK7，CK19，LN and LN receptor， as well as their possible association，in six hepatocellular car-cinoma cell lines was demonstrated using immunocy-tochemical，confocal laser scanning microscopy and Western blotting approaches.RESULTS CK8and CK18were ex-pressed in all of the six cell lines examined.CK7-immunore-activity was also present，but in different levels，in all the cell lines.CK19was positive in four， and negative in two cell lines，correlating well to LN-immunoreactivity.The positive products of both molecules were present in the same cells as demonstrated by laser confocal scanning microscopy.LN re-ceptor was also expressed in all the cell lines.CONCLUSION Abnormal expression of CK7and CK19occurred frequently in hepatocellular carcinoma cells growing in culture.CK19and LN were expressed in the same hepatocellular cell lines， localized often in the same cells.These data provide strong 更多精品文档,欢迎来我主页查询 evidence for an inductive role of LN in the abnormal CK19expression. 0 引言 正常成人肝脏中，肝细胞的中间丝细胞骨架仅由细胞角蛋白,cytokeratin，CK,8和CK18构成;而胆管上皮细胞除含有上述两种CK外，还表达CK7和CK19，这两种细胞类型的CK组型过去被认为能在各种生理、病理状态下保持恒定不变，因此CK8和CK18被称为“肝细胞型”CK，CK7和CK19被称为“胆管型”CK,1, .最近有研究表明，肝细胞的CK组型在某些肝功能紊乱和肝脏疾病状态下会发生改变，肝细胞和肝细胞癌细胞可额外地表达“胆管型”CK,CK19或,和,CK7,，称为肝细胞CK的异常表达,2-8, ，但其发生机制尚未完全阐明.肝脏病理情况下，肝细胞和肝细胞癌中的CK19的异常表达可能与层粘连蛋白,laminin，LN,等细胞外基质成分的异常沉积有关,3，5，6，8-11, .为了进一步探讨肝细胞CK的异常表达和可能机制，作者对体外培养的6株肝细胞癌细胞系的CK组型及LN和LN受体表达情况进行了观察. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1 材料 更多精品文档,欢迎来我主页查询 RPMI1640培养基,Gibco公司,、新生牛血清购自宝泰克生物制品科技西北分公司,西安,，抗CK8,M0631,，CK18,M7010,，CK7,M7018,，CK19,M0772,单克隆抗体和LN的单克隆,M0638,及多克隆,Z0097,抗体，标记FITC的羊抗鼠IgG和标记TRITC的猪抗兔IgG荧光抗体，均为Dako公司产品.LN受体的单克隆抗体,MAB0273,及免疫组化试剂盒,UltrasensitiveTM S-P kit,购自福州迈新生物技术开发公司.试剂和药品均为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯或电泳级.肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B,校免疫学教研室惠赠,、9724,校动物实验中心惠赠,. 1.2 方法 肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B，9724，HHCC，9204，SMMC7721在含100mL L-1 新生牛血清的RPMI1640培养液中按常规方法培养，在含小盖玻片的十二孔培养板培养2:3d，待细胞生长成单层时，取出小盖玻片，用0.01mol L-1 pH7.4的PBS振洗2min，固定于预冷至4?的1 1,V V,甲醇:丙酮固定液中10min，然后用PBS振洗3次，每次5min. 1.2.1 免疫细胞化学染色 细胞爬片用0.01mL L-1 pH7.4的PBS水化后，内源性过氧化酶阻断剂室温孵育20min，用0.01mL L -1 pH7.4的PBS振洗5min×3次,下同,，滴加100mol L-1 免疫前同种动物血清封闭10min，PBS振洗.倾去血清，分别滴加CK8,1 40,，CK18,1 40,，CK7,1 40,，CK19,1 75,，LN,1 22,更多精品文档,欢迎来我主页查询 及LN受体,1 30,的mAb，4?孵育过夜.PBS振洗后，加生物素标记的第二抗体，37?孵育10min.PBS振洗后，加链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，37?孵育10min.PBS振洗，0.5g L -1 二氨基联苯胺/0.3mL L-1 H 2 O2 系统显色10min.苏木素衬染，脱水透明，用DPX封固.染色过程采用的阴性对照包括:?相同浓度的免疫前小鼠血清取代一抗;?PBS取代一抗;?用PBS取代二抗. 1.2.2 激光共聚焦显微镜观察 细胞爬片用0.01mol L-1 pH7.4的PBS水化后，用30mL L-1 正常小牛血清封闭30min，倾去血清，滴加鼠抗人CK19,1 75,mAb和兔抗人LN,1 38,的多克隆抗体混合液，4?孵育过夜;PBS振洗10min×3次，滴加FITC标记的羊抗鼠IgG,1 15,和TRITC标记的猪抗兔 IgG,1 30,的混合液，37?孵育60min，PBS振洗后，用无荧光缓冲甘油封片，直接在激光共聚焦显微镜,Bio-Rad MRC-1024,下观察并拍照.用于FITC的激发波长为488nm，用于TRITC的激发波长为568nm. 1.2.3 Western blot分析 将培养的肝细胞癌细胞系约107 个细胞收集在10mL离心管中，0.01mol L-1 pH7.4的PBS洗涤5min×2次后，加入1mL细胞裂解液,含150mmol L-1 NaCl，0.1g L-1 NP-40，0.05g L-1 更多精品文档,欢迎来我主页查询 脱氧胆汁酸盐钠，0.01g L-1 SDS，50mmol L-1 Tris-HCl,pH8.0,，2mg L-1 抑肽酶，2mg L -1 亮肽素和100mg L-1 苯甲基磺酰氟化物,，4?30min，细胞溶解产物通过2000r min-1 离心后保留上清，-80?贮存备用.将细胞裂解物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在含39mmol L-1 甘氨酸，48mmol L-1 Tris碱，0.37g L-1 SDS及200mL L-1 甲醇的转移缓冲液中，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜,购自宝泰克生物制品科技西北分公司,上.室温封闭2h后，分别加入小鼠抗人CK18，CK7和CK19mAb，4?孵育过夜，0.01mL L-1 pH7.4PBS振洗10min×3次，再加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig，室温反应1h，PBS振洗10min×3次，加底物显色10min后终止反应，并观察结果. 2 结果 2.1 免疫组化染色结果 6株肝细胞癌细胞系细胞生长良好，胞质丰富，呈多角形，除HepG2细胞在小盖玻片上呈簇状生长外，其余细胞系均呈散在性的均匀平铺在小盖玻片上生长.免疫酶组织化学反应显示，CK阳性物质主要位于肝细胞癌细胞的胞质中，有的呈颗粒状聚集在细胞两极或散在于细胞质中，有的呈细丝状贯穿于细胞或包绕着细胞核.LN及LN受体阳性物质位于肝细胞癌细胞的细胞质和细胞表面，呈颗粒状，散更多精品文档,欢迎来我主页查询 在或聚集分布.如Tab1所示，6株肝细胞癌细胞系均表达CK8和CK18且全部为强阳性,Fig1A，B,.CK7的表达也均为阳性,Fig1C，D,，但是反应程度不同，两株细胞系SMMC7721，9204为强阳性，其余4株细胞系反应为弱阳性.CK19的表达反应程度较弱，4株细 HepG2，Hep3B，9204为阳性,Fig1E,，其余胞SMMC7721， 两株细胞系HHCC和9724为阴性,Fig1F,.LN的表达结果与CK19的表达结果一致，即SMMC7721，HepG2，Hep3B，92044株细胞系为阳性,Fig1G,，其余两株细胞系HHCC和9724结果为阴性,Fig1H,.层粘连蛋白受体在全部肝细胞癌细胞系中皆，反应为阳性. 图1 体外生长HCC细胞系HepG2,A，C，E，G,和9724,B，D，F，H,的CK18,A，B,，CK7,C，D,，CK19,E，F,和LN,G，H,的表达.HepG2的CK19,E,和LN,G,均阳性，而9724的二者均阴性,F，H,.链霉菌抗生物素过氧化物酶免疫细胞化学染色，苏木素衬染 2.2 激光共聚焦显微镜结果 利用间接免疫荧光双标记法结合激光共聚焦显微镜显示，FITC标记的CK19,呈黄绿色颗粒，Fig2B，E,及TRITC标记的LN,呈红色颗粒，Fig2A，D,的阳性物质，均位于肝细胞癌细胞质内，但是对于不同的肝细胞癌细胞系，CK19和LN染色强度不同.其中免疫酶组织化学染色CK19阴性的两株细胞系，LN和CK19反应后多数细胞不见荧光标记，仅少数细胞有微弱的背景染色，根据结更多精品文档,欢迎来我主页查询 果判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，为阴性反应,Fig2G，H,.激光共聚焦显微镜检测结果与免疫酶组织化学染色结果基本一致.激光共聚焦显微镜观察还显示，CK19和LN的阳性物质在同一癌细胞的细胞质内出现部分重叠，呈现出桔红色或桔黄色荧光，CK19与LN同时表达，并具有共定位 C,，9204,D:关系,Fig2C，F,. 图2 HCC细胞系HepG2,A: F,和9724,G:I,中LN,红色,和CK19,绿色,的免疫荧光反应的激光共聚焦显微镜观察.LN,A，D,和CK19,B，E,在细胞系HepG2和9204中呈强阳性反应，二者在胞质中共存,桔红到桔黄色,.在9724细胞系中，LN和CK19仅呈现出极弱的荧光，难与背景区别，判定为阴性反应,G:I, 2.3 Western blot检测结果 共检测了除Hep3B以外，其余5个肝细胞癌细胞系中CK18,45ku,、CK7,54ku,和CK19,40ku,的表达，结果显示，CK18和CK7的单克隆抗体分别在45ku和54ku处标记出一条特异性条带.各细胞系在45ku,CK18,处，均显示出强的反应,Fig3，A和B,.在54ku,CK7,处，各细胞系反应程度也较强,Fig3，A和B,.而在40ku,CK19,处，各细胞系的反应程度有明显差别，HCC细胞系9204，HepG2和SMMC7721为阳性反应,Fig3A,，另外两株细胞系HHCC和9724的反应则基本上为阴性反应,Fig3B,.检测结果与免疫酶组织化学染色和激光共聚焦显微镜结果一致. 表1 HCC细胞系中细胞角蛋白、层粘连蛋白及其受体的表达 更多精品文档,欢迎来我主页查询 3 讨论 近几年对病变肝脏的研究显示，不仅肝细胞的细胞角蛋白表达的量可以有显著改变,12, ，而且其CK 组型也不象以前认为的那样稳定.是否表达“胆管型”CK作为鉴别HCC和胆管细胞癌的指标应用应谨慎,13, .在病毒性肝炎,尤其是乙型肝炎及肝硬变,、乙醇性和淤胆性肝硬变、四氯化碳性、奶油黄性及局部液氮所致的肝损伤、HCC组织中，还可出现CK19单独或合并CK7的表达，称为 .此结果表明，体外培养的肝细胞CK的异常表达,2-8，11-13, HCC细胞系，其CK组型的表达同体内HCC组织相类似，也存在CK的异常表达，这同我们以前的研究结果大致相同 ,3，7，11-14, ，从而进一步肯定了肝肿瘤细胞在某些因素的作用影响下确实能够发生CK表达的异常改变.因此，CK19表达与否不能作为HCC和胆管细胞癌之间鉴别的标准，只有当绝大部分的癌细胞都表达CK19时才支持胆管细胞癌的诊断,13, .人HCC组织中CK19的表达率最高的报道为38%,3, .我们的结果显示，在正常情况下与CK19成对表达的CK7，在体外连续传代培养的6株肝细胞癌细胞系中都有表达.有趣的是，6株HCC细胞系细胞的CK表达也不完全一致，不仅反应的阳性程度上有差别，而且表达的CK组型也不相同，这表明HCC细胞的CK的表达是可以发生变化的，确实存在CK7和CK19的异常表达，其CK组型也不完全相同,见Tab1及Fig1,.本研究为最终阐明HCC的CK异常表达的机制提供了合适的更多精品文档,欢迎来我主页查询 细胞模型. 体内肝细胞的CK异常表达的确切机制尚未完全阐明.细胞外基质成分，尤其是层粘连蛋白对肝细胞的CK19的表达起着非常重要的作用,3，5，6，8-11，13, .其依据在于体内正常肝细胞周围不存在基底膜样结构，而表达CK19的肝细胞及其来源的癌细胞周围常出现由LN构成的基底膜样结构，即出现LN异常沉积,2，7，11，13, ，就象胚胎肝内胆管形成那样,15, .正常LN主要是由成年人肝脏内皮细胞和肝内胆管上皮细胞产生的，但是在肝脏纤维化等疾病过程中，随着上述细胞的增生和激活，增生的贮脂细胞也合成并分泌LN，肝小叶内有LN的沉积，而且肝细胞也能够产生一定量的LN,16-18, .Han等,17, 的观察表明，CK19阳性的肝细胞亚群，LN也明确阳性.此研究结果显示，体外培养的肝细胞癌细胞不但能表达LN，还能够表达LN受体，而且其表达在很大程度上与CK19的异常表达保持一致性.激光共聚焦显微镜显示，CK19与LN的表达共定位于同一癌细胞中,Fig2,.因此，这一结果进一步支持了上述观点，即LN可能对肝细胞CK19的异常表达具有某种程度的诱导作用.LN作为一种糖蛋白，可能通过肝细胞膜上的LN受体作用于肝细胞，影响其分化和CK的表达.肝细胞的LN受体是一族整合素类物质，至少有20种.正常肝细胞仅表达α1 β1 ，而肝炎、胆汁性肝硬化和HCC等疾病时，肝细胞中却出现α2 β1 ，α 3 β1 和α6 β1 的表达，它们能够与LN结合，并且与LN分布一致,19, .我们设想，LN可能通过整合素类受体的介导，引起肝细胞及HCC细胞的CK19的异常表达.正进行的体外诱导试验将为阐更多精品文档,欢迎来我主页查询 明肝细胞及其来源癌细胞的CK异常表达的确切机制提供更有说服 力的证据. 参考文献: 1,Moll R，Frank WW，Schiller DL，Geiger B，Krepler , R.The catalog of human cytokeratin polypeptides:patterns of expres-sion of specific cytokeratins in normal epithelia， tumors and cul-tures cells ,Review,,J,.Cell，1982;31 ,1,:11-24. 2,Su Q，Liu YF.The 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